專利名稱：含有根據(jù)豬生長階段表達(dá)的肌肉特異性基因的功能cDNA芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及篩選根據(jù)豬生長階段表達(dá)的肌肉特異性基因的表達(dá)譜以及用該表達(dá)譜制造的功能cDNA芯片。尤其是，本發(fā)明涉及篩選在生長階段的豬的肌肉和脂肪組織中特異性表達(dá)的肌肉特異性基因表達(dá)譜以及用來評價肉的高質(zhì)量以及篩選豬的特異性基因的功能cDNA芯片，該功能cDNA芯片采用僅僅整合肌肉特異性基因的方法制備得到。
背景技術(shù)：
由于原產(chǎn)的黑豬具有很厚的背部脂肪層，生長速度慢且繁殖率低，因此養(yǎng)豬的農(nóng)民不愿意養(yǎng)這類豬。但是，這種豬具有結(jié)實的脂肪組織、白色的脂肪顏色、良好的質(zhì)地、豐富且甜的肉汁，口感好，因此目前對這種豬肉的消耗量趨向于增加?？墒?，對這種原產(chǎn)豬的基因研究、譜系的保存和控制，以及肉質(zhì)相關(guān)基因的分析仍然很不夠。尤其是，與肉產(chǎn)量相關(guān)性狀相比，肉質(zhì)相關(guān)基因性狀是更多基因特性綜合的結(jié)果，這方面的研究尚未完全展開(Cameron，1993)。
一些重要的基因影響豬的肉質(zhì)，目前已知的有ryanodine受體基因(RYR)，它導(dǎo)致了PSE(蒼白的，柔軟的，滲出的)豬肉(Eikelenboom andMinkema，1974；Smith and Bampton，1977；Webb，1981；Christian andMabry，1989；Fujii el al.，1991)，以及酸肉基因(Rendement Napole，Le Royel al.，1990；Lundstrom el al.，1996)。此外，通過QTL(數(shù)量性狀座)分析可以知道肉質(zhì)相關(guān)區(qū)域或各種候選基因。已知存在于第7號染色體上的豬白細(xì)胞抗原(SLA)復(fù)合物(Geffrotin el al.，1984)以及圍繞該區(qū)域的微衛(wèi)星標(biāo)記S0064，S0066，S0102或TNF與背部脂肪厚度、上部腰肉位置、肉質(zhì)特性以及豬肉腐敗相關(guān)(Jung el al.，1989；Rothschild el al.，1995；Bidanel elal.，1996)。并且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)背部脂肪厚度和腹部脂肪含量相關(guān)的QTL位于微衛(wèi)星標(biāo)記S0001-S0175(Andersson el al.，1994)的位置。此外，已有報道，垂體特異性的轉(zhuǎn)錄因子(PIT1)基因是一種激素調(diào)節(jié)因子(Yu el al.，1995)。并且已知肌肉間的脂肪含量(IMF)能極大地影響肉嫩、肉汁和口感(Devol elal.，1988；Cameron，1990)。有報道HFAPB(心臟脂肪酸結(jié)合蛋白)基因能影響肌肉間的脂肪含量(Gerbens el al.，1997)?，F(xiàn)在，位于第6號染色體上的微衛(wèi)星SW1823至S0003(74至79cM)位置與肉的這些特性的相互關(guān)系已得到了研究(Grindflek el al.，2001)。
因此，由于第4、6和7號染色體上大量發(fā)現(xiàn)了影響肉的質(zhì)量性狀的QTL(Clamp el al.，1992；Andersson el al.，1994；Renard el al.，1996；Rohrerand Keele 1998a，1998b；Wang el al.，1998；de Koning el al.，1999；Oviloel al.，2000；Gerbens el al.，2000)，已有許多研究圍繞這些染色體開發(fā)了肉質(zhì)相關(guān)標(biāo)記。
在過去的幾年里，已經(jīng)有研究嘗試開發(fā)含有無名的豬肉質(zhì)相關(guān)基因標(biāo)記和已知標(biāo)記的基因圖譜。到現(xiàn)在，已有多種在mRNA水平分析基因表達(dá)的技術(shù)被用來分析豬的基因差異，例如northern印跡，差異展示、基因表達(dá)的順序分析以及點印跡分析等。但是，這些方法的缺陷是不適合用于多種表達(dá)產(chǎn)品的同時分析。近來已發(fā)展出一項新技術(shù)如cDNA微陣列能夠克服上述缺陷。cDNA微陣列已成為在各種活體上研究基因表達(dá)的最有力的方法之一。該技術(shù)用于多基因的同時表達(dá)，大規(guī)模地發(fā)現(xiàn)基因，以及用于基因DNA克隆的多態(tài)性篩選和圖譜的制定。該技術(shù)用來對從已知或未知的基因中轉(zhuǎn)錄的RNA進(jìn)行定量分析，是一種非常先進(jìn)的RNA表達(dá)分析技術(shù)。
目前使用的DNA芯片類型包括復(fù)合的DNA芯片，該DNA芯片的構(gòu)建是通過設(shè)計引物，并根據(jù)數(shù)據(jù)庫信息將來自cDNA文庫的基因與功能DNA芯片結(jié)合，該功能DNA芯片是通過將現(xiàn)有文獻(xiàn)中相關(guān)的基因結(jié)合而構(gòu)建得到的。當(dāng)復(fù)合的DNA芯片用于翻譯時，由于非相關(guān)基因的作用而導(dǎo)致了翻譯上的困難，因此需要很大的努力來最終解釋生物學(xué)功能。并且，由于芯片的構(gòu)建是基于數(shù)據(jù)庫的，因此，沒有信息或相關(guān)基因存在部分缺失的新基因可能就會有困難。同時，功能DNA芯片容易被翻譯，但是需要另外收集基因用來表征那些在現(xiàn)有文件中未描述過的或功能未知的基因。因此，芯片上DNA的構(gòu)建對于有效的解釋生物功能是非常重要的。
考慮到這些問題，本發(fā)明人引入了cDNA微陣列技術(shù)來篩選豬的特定組織中與肉質(zhì)相關(guān)的基因表達(dá)譜，并通過僅僅整合篩選到的特定基因而制備功能cDNA芯片，該芯片可用于高肉質(zhì)豬的改良，以及根據(jù)豬的品種和組織來評價肉質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于根據(jù)肌肉的生長階段篩選差異表達(dá)的特定基因的表達(dá)譜，這種篩選是通過將與探針整合的基底和來自豬的肌肉和脂肪組織的靶DNA雜交，其中探針是從豬的肌肉和脂肪組織中分離到的總RNA中制備而來的。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種功能cDNA芯片，用于豬的肉質(zhì)評價和篩選特定基因，該芯片是通過僅僅整合篩選到的特定基因而制備得到的。
根據(jù)本發(fā)明，上述目的是通過下述步驟實現(xiàn)的首先，用PCR從總RNA中制備數(shù)以千計的ESTs，其中的總RNA是從豬的肌肉和脂肪組織中分離到的，然后將ESTs克隆分析，并在數(shù)據(jù)庫中篩選它們的核苷酸序列，用PCR擴(kuò)增ESTs，接著分離純化，使用DNA芯片陣列在載玻片上排列產(chǎn)物和對照組，從豬的肌肉和脂肪組織里分離到的總RNA中制備靶DNA，來篩選生長相關(guān)基因的表達(dá)譜，將載玻片(探針DNA)和靶DNA雜交，掃描產(chǎn)物以獲得一個圖像文件，根據(jù)圖像文件上豬的生長階段檢測差異表達(dá)的肌肉相關(guān)基因的表達(dá)情況，并通過僅僅整合根據(jù)生長階段的豬的肌肉特異性基因來制備功能cDNA芯片。
本發(fā)明包含下述步驟從豬的肌肉和脂肪組織中制備ESTs以及鑒定序列信息；用ESTs制備探針DNA；將豬的肌肉和脂肪組織中獲得的熒光標(biāo)記的靶DNA(ESTs)與探針DNA雜交，接著掃描和分析圖像文件；根據(jù)豬的生長階段檢測肌肉相關(guān)基因的表達(dá)譜；并通過僅僅整合肌肉特異性基因制備功能cDNA。
用于豬的肉質(zhì)評價和特異性基因篩選的功能cDNA芯片是由下述步驟制備的從豬的肌肉和脂肪組織中分離到總RNA，用PCR利用分離到的總RNA制備4434 ESTs；用DNA芯片陣列在載玻片上排列ESTs和酶對照；從豬的肌肉和脂肪組織分離到的總RNA中制備具有3-dCTP和5-dCTP結(jié)合的靶DNA；將載玻片(探針DNA)與靶DNA雜交，掃描產(chǎn)物并分析圖像，以便根據(jù)豬的生長階段檢測特異性表達(dá)的肌肉相關(guān)基因的表達(dá)情況；并通過僅僅整合篩選到的豬生長階段的肌肉特異性基因來制備功能cDNA芯片。
根據(jù)本發(fā)明的用于豬的肉質(zhì)評價和特異性基因篩選的功能cDNA芯片包含探針和固定探針的基底，該探針含有在豬的肌肉和脂肪組織中特異性表達(dá)的肌肉特異性基因。
根據(jù)本發(fā)明，用于豬的肉質(zhì)評價和特異性基因篩選的功能cDNA芯片的DNA微陣列上所固定的探針DNA包含ESM特異性基因和ASM特異性基因。
根據(jù)本發(fā)明，在用于豬的肉質(zhì)評價和特異性基因篩選的功能cDNA芯片的DNA微陣列上所固定的ESM特異性基因包含肌動蛋白、β-肌球蛋白、糖原磷酸化酶、肌球蛋白重鏈、丙酮酸激酶和肌鈣蛋白C編碼基因。
根據(jù)本發(fā)明，在用于豬的肉質(zhì)評價和特異性基因篩選的功能cDNA芯片的DNA微陣列上所固定的ASM特異性基因包含1-α動力蛋白重鏈、601446467F1，纖維連接蛋白(fibronectin)前體物和MHC的I型編碼基因。
本發(fā)明功能cDNA芯片的基底優(yōu)選是聚合物膜，例如硅樹脂晶片、玻璃、聚碳酸脂、膜、聚苯乙烯或聚亞胺酯。本發(fā)明所述的DNA微陣列可以采用制備DNA微陣列的常規(guī)方法將探針固定在基底上，采用的方法包括光刻法、壓電影印、微吸量、點印法等。在本發(fā)明中，采用了點印法。
用于豬的肉質(zhì)評價和特異性基因篩選的試劑盒包含功能cDNA芯片、從篩選的組織分離到的RNA中制備的具有3-dCTP和5-dCTP連接的cDNA，以及熒光掃描系統(tǒng)和計算機(jī)分析系統(tǒng)，其中功能cDNA芯片中整合了豬生長階段的肌肉特異性基因。
具體實施例方式
本發(fā)明的詳細(xì)描述參見下述實施例，但是這些實施例并不是用來限制本發(fā)明的。
實施例1根據(jù)豬的生長階段篩選肌肉特異性基因的表達(dá)譜為了根據(jù)豬的生長階段篩選肌肉特異性基因的表達(dá)譜，從KagoshimaBerkshire的肌肉和脂肪組織里分離到的總RNA中制備探針DNA，將組織的總RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記用于制備靶DNA。這些DNA雜交后掃描。分析所得圖像結(jié)果，用來根據(jù)豬的生長階段篩選肌肉特異性基因。
制備實施例1探針DNA的制備和排列首先，制備探針DNA并將其結(jié)合到載玻片上，該探針DNA也就是用PCR擴(kuò)增的cDNA。采用RNA抽提試劑盒(Qiagen，Germany)，根據(jù)手冊說明從Kagoshima Berkshire(體重30kg和90kg)的背最長肌的肌肉和脂肪組織中抽提總RNA，用oligo(dT)柱子提取mRNA。使用SP6，T3正向引物和T7反向引物(Amersham Pharmacia Biotech，England)對提取的mRNA樣品進(jìn)行RT-PCR用來合成cDNA。每一份PCR反應(yīng)物的總體積均為100μl。100pM的正向和反向引物都轉(zhuǎn)移至96孔PCR板上(Genetics，England)。每孔含有2.5mM的dNTP、10×PCR緩沖液、25mM MgCl2、0.2μg的DNA模板和2.5U的Taq聚合酶。在GeneAmp PCR系統(tǒng)5700(AB AppliedBioSystem，Canada)中進(jìn)行PCR，條件為94℃30秒，58℃45秒，72℃1分鐘，30個循環(huán)。
擴(kuò)增的DNA片段大小通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR產(chǎn)物在96孔板中經(jīng)乙醇沉淀，干燥并在-20℃保存。
上述制備得到的總4434 cDNAs(ESTs)克隆后分析豬的基因核苷酸序列，利用NCBI的數(shù)據(jù)庫鑒定它們的基因信息。具有信息的基因被分離后用PCR純化。構(gòu)建總4434 cDNAs(ESTs)的基因座和圖譜?？?434 cDNAs(ESTs)和300個酵母對照被排列在1.7cm2大小的區(qū)域。然后，用顯微鏡(Corning制造)在載玻片上將探針DNA點樣，用Microgrid II(Biorobotics)將探針DNA包被上CMT-GAPSTM氨基硅烷。用開口針(split pin)將探針印跡到Microgrid II上。該針樣裝置靠近微板上的孔，往載玻片上注入溶液(1-2nL)。探針DNA印跡后，干燥載玻片，用Stratalinker TM(Stratagene，USA)在90mJ條件下將點印的DNA和載玻片進(jìn)行UV交聯(lián)，室溫下用0.2％SDS洗兩次共2分鐘，然后用三蒸水在室溫下洗一次共2分鐘。洗滌后，95℃下將載玻片浸入水槽中2分鐘，再加入封閉液(1.0g的NaBH4溶于300mLpH7.4的磷酸緩沖液，與100mL無水乙醇形成的混合物)封閉15分鐘。然后，載玻片在室溫下用0.2％SDS洗3次共1分鐘，然后用三蒸水在室溫下洗一次共2分鐘，在空氣中涼干。
制備實施例2靶DNA的制備和雜交為了制備靶DNA來篩選豬的肌肉和脂肪組織中的肌肉特異性基因，從體重為30kg和90kg的Kagoshima Berkshires的背最長肌中取出肌肉組織。從體重為30kg的Kagoshima Berkshires中取出脂肪組織。肌肉和脂肪組織被切成5-8mm長，用液氮冷凍，保存在-70℃。
根據(jù)TrizolTM試劑盒(Life Technologies，Inc.)手冊，從0.2-1.0g的實驗組和對照組中分離出總RNAs，用來制備靶DNA。每50-100mg的組織中加入1mL TrizolTM，使用玻璃-特氟綸或Polytron勻漿器進(jìn)行破碎。破碎的顆粒在4℃下12,000g離心10分鐘，將1mL的上清液等分。在每個等分液中加入200ul的氯仿，震蕩15秒，冰上放置15分鐘，4℃下12,000g離心10分鐘。加入同樣量的氯仿，震蕩15秒，冰上放置15分鐘，4℃下12,000g離心10分鐘。將上清轉(zhuǎn)移到一個新管中。在管中加入500μl的異丙醇，震蕩，冰上放置15分鐘。冷卻后，4℃下12,000g離心5分鐘。移出上清，與1mL 75％冷卻的乙醇混合，4℃下12,000g離心5分鐘。移出上清，在凈化臺上凍干30分鐘，加入20μl無Rnase的水或DEPC水來溶解RNA。總DNA濃度設(shè)定在40μg/17μl，用于電泳。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的第一鏈cDNA合成方法來制備靶DNA。簡言之，根據(jù)Schuler(1996)描述的方法，40μg的總RNA和oligo dT-18mer的引物(InvitrogenLife Technologies)混合，65℃下加熱10分鐘，4℃冷卻5分鐘。然后，加入1μl的25mM dATP、dGTP和dTTP的混合物、1μl的1mM dCTP(Promega)、和2μl的1mM氰藍(lán)3-dCTP或2μl的1mM氰藍(lán)5-dCTP、20U的RNA酶抑制劑(Invitrogen Life Technology)、100U的M-MLV Rtase以及2μl的10×第一鏈緩沖液，用吸液管混勻。反應(yīng)混合物在38℃下溫育2小時，用乙醇沉淀去除未連接的核苷酸。步驟中使用DEPC處理的無菌水。
上述制備的載玻片，用雜交溶液(5×SSC，0.2％SDS，1mg/mL鯡魚精DNA)在65℃下預(yù)雜交1小時。標(biāo)記有氰藍(lán)3(Cy-3)和氰藍(lán)5(Cy-5)的靶DNA在95℃下的20μl雜交溶液中重新懸浮，變性2分鐘。然后，載玻片在65℃下與溶液雜交過夜。雜交是在一個蓋有玻璃(Grace Bio-Lab)的潮濕箱中進(jìn)行的。
雜交后，載玻片在室溫下用2×SSC、0.1％SDS洗滌4次，共5分鐘，同時在振蕩器上劇烈震動。然后，載玻片在室溫下用0.2×SSC 5分鐘以及0.1×SSC 5分鐘洗滌兩次。
載玻片用象素大小為50μm的ScanArray 5000(GSI Lumonics Version3.1)進(jìn)行掃描。氰藍(lán)3-dCTP標(biāo)記的靶DNA在565nm下掃描，氰藍(lán)5-dCTP標(biāo)記的靶DNA在670nm下掃描。通過氰藍(lán)3-dCTP-和氰藍(lán)5-dCTP-標(biāo)記的點的線性掃描對兩個熒光強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。再次用象素大小為10um的ScanArray 4000XL對載玻片進(jìn)行掃描。得到的結(jié)果TIFF圖形文件用Quantarray軟件2.1版進(jìn)行分析，自動去除背景。每點的強(qiáng)度從Quantarray導(dǎo)入至Microsft Excel。結(jié)果見表1和表2。
ESM(早期肌肉)的全部基因表達(dá)模式都與ASM(成熟期肌肉)和ESF(早期脂肪)的表達(dá)模式進(jìn)行了比較?！癊SM特異性”和“ASM特異性”基因見表1，“ESF特異性”基因見表2。20個基因在ASM中表現(xiàn)出比ESM中高5倍的表達(dá)水平。并且，18個基因在ESF中表現(xiàn)出比ESM中高10倍的表達(dá)水平，在ESM中比ASM中高5-10倍的表達(dá)水平。
某些ASM特異性基因、ESM特異性基因和ESF特異性基因包含表1和表2所示的可預(yù)見的基因組。
表1ESM和ASM間差異表達(dá)基因的表達(dá)比率






同意的登錄號**和數(shù)據(jù)庫相符的信息沒有匹配沒有和數(shù)據(jù)庫相符的信息；新的ESTESM早期肌肉(體重30kg)，ASM成熟期肌肉(體重90kg)，SM豬的肌肉。
如表1所示，在ASM中表達(dá)的14個基因已在表1中被鑒定且知道了它們的功能，但是并沒有精確測定。這些基因包括肌動蛋白α1、原肌球蛋白α鏈、醛縮酶A、果糖-1，6-二磷酸酶、NADH-泛醌氧化還原酶鏈1、葡萄糖磷酸變位酶異構(gòu)體1mRNA、丙酮酸激酶、線粒體、kel-樣蛋白(表2)。包含微絲的肌動蛋白細(xì)胞骨架負(fù)責(zé)真核細(xì)胞的各種功能，如細(xì)胞內(nèi)傳輸以及結(jié)構(gòu)支持。肌動蛋白以單體(G-肌動蛋白)或細(xì)絲(F-肌動蛋白)的形式存在。F-肌動蛋白是微絲的主要成分。許多蛋白調(diào)節(jié)微絲的長度、位置和變形。肌動蛋白細(xì)胞骨架具有一個可變的結(jié)構(gòu)，它可以根據(jù)刺激以及細(xì)胞周期過程立即變化形狀和結(jié)構(gòu)。肌動蛋白細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)不是固定的，而是根據(jù)細(xì)胞環(huán)境發(fā)生改變。結(jié)合有肌鈣蛋白復(fù)合物(肌鈣蛋白-I，-T和C)的原肌球蛋白在脊椎動物門線性肌肉收縮引起的Ca2+依賴性調(diào)節(jié)中起重要作用。原肌球蛋白與包含二聚體的α卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)組緊密相關(guān)。催化哺乳動物PEP到ADP轉(zhuǎn)磷酸作用的丙酮酸激酶是重要的調(diào)節(jié)酶之一，它的調(diào)節(jié)代謝途徑的特性與途徑調(diào)節(jié)中其它組織需要的各種代謝要求緊密聯(lián)系。因此，本發(fā)明人將它用于本發(fā)明目的的研究中。
此外，在ESM中表達(dá)的5個基因已在表1和2中被鑒定且它們的功能未知，對此并沒有精確測定。這些基因包括膠原蛋白、disk/大同源物5(果蠅)，酸性分泌蛋白和波形纖維蛋白(vimentin)。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，并包含至少18種類型的不同的大蛋白質(zhì)組，這在胚胎發(fā)育和各種形態(tài)學(xué)分化過程中的細(xì)胞分裂、復(fù)制、遷移和連接中能觀察到，并且被外周細(xì)胞基質(zhì)的細(xì)胞相互作用部分調(diào)節(jié)。
在白細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞過程的一系列基因表達(dá)之后，波形纖維蛋白編碼基因(Vim)的表達(dá)是其中的一個終止標(biāo)記。因此，對轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)理的評價是理解負(fù)責(zé)白細(xì)胞分化的基因調(diào)節(jié)途徑的重要階段。
表2ESM和ESF間差異表達(dá)基因的表達(dá)比率





同意的登錄號**和數(shù)據(jù)庫相符的信息沒有匹配沒有和數(shù)據(jù)庫相符的信息；新的ESTESM早期肌肉(體重30kg)，ESF早期脂肪(體重30kg)，SM豬的肌肉。
如表2所示，在ESF中表達(dá)的13個基因包括肌鈣蛋白-C、L-乳酸脫氫酶M鏈、LIM域1蛋白、丙酮酸激酶、核糖體蛋白P0和轉(zhuǎn)運RNA-Trp合成酶。包含編碼M1型和M2型同功酶的人丙酮酸激酶M(PKM)基因的基因組克隆被分離，測定它們的外顯子序列?；虼蠹s是32kb，包含12個外顯子和11個內(nèi)含子。外顯子9和10分別包含對M1型和M2型特異的序列，這表明人同功酶是從相同的基因中通過選擇性剪切制備得到的，如脂肪基因。4LIM域蛋白1(FHL1)首先被用作豐富的骨骼肌蛋白，該蛋白具有4個LIM域和1個例如鋅指結(jié)構(gòu)的GATA。FHL1在骨骼肌和各種組織中表達(dá)。近來，選擇性地插入FHL1 mRNA編碼C末端缺失的蛋白質(zhì)已得到鑒定?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL1C在豬的骨骼肌中通過一種新鑒定到的起始密碼子最終產(chǎn)生含有16個氨基酸的N末端。從上述的這些結(jié)果可以看到，這些基因可作為肉質(zhì)相關(guān)的候選基因來評價。
因此，鑒定到的基因表達(dá)比率在ESM比ASM中以及ESM比ESF中是兩倍多。通過cDNA微陣列分析，鑒定到了極大地過度表達(dá)的總共128個基因。肌動蛋白、β-肌球蛋白、糖原磷酸酶、肌球蛋白重鏈、新基因(novelgenes)、丙酮酸激酶和肌鈣蛋白C在ESM中特異性表達(dá)。膠原蛋白、纖維連接蛋白、金屬蛋白酶3抑制劑、整合素(intergrin)β-1亞基在ESF中特異性表達(dá)。1-α動力蛋白重鏈、601446467F1，假設(shè)的蛋白、纖維連接蛋白前體物、MHC的I型、新基因、無名蛋白產(chǎn)物在ASM中特異性表達(dá)。這些基因被作為肉質(zhì)相關(guān)的候選基因來評價。此外，本發(fā)明人還將對更多基因的功能進(jìn)行研究，以便培育高肉質(zhì)的豬。
實施例2用于豬的肉質(zhì)評價和篩選特異性基因的本發(fā)明功能cDNA芯片的構(gòu)建在實施例1中篩選到的豬生長階段肌肉特異性基因，包括ESM特異性基因，例如肌動蛋白、β-肌球蛋白、糖原磷酸化酶、肌球蛋白重鏈、新基因、丙酮酸激酶和肌鈣蛋白C編碼基因，以及ASM特異性基因，例如1-α動力蛋白重鏈、601446467F1，假設(shè)的蛋白、纖維連接蛋白前體物和MHC的I型編碼基因被固定在DNA微陣列上，用制備實施例1的方法來構(gòu)建用于豬的肉質(zhì)評價和篩選特異性基因的功能cDNA芯片。
實施例3構(gòu)建用于豬的肉質(zhì)評價和篩選特異性基因的本發(fā)明的試劑盒用于豬的肉質(zhì)評價和篩選特異性基因的本發(fā)明的試劑盒包括如實施例2構(gòu)建的功能cDNA芯片、從篩選組織的RNA中獲得的結(jié)合有Cy5-dCTP或Cy3-dCTP的cDNA、以及熒光掃描系統(tǒng)和計算機(jī)分析系統(tǒng)。
工業(yè)應(yīng)用性如實施例所述，本發(fā)明涉及根據(jù)豬的生長階段來篩選肌肉特異性基因的表達(dá)譜，以及采用該表達(dá)譜構(gòu)建的功能cDNA芯片，并且根據(jù)豬的肌肉和脂肪組織的生長階段提供了肌肉特異性基因的表達(dá)譜。此外，本發(fā)明還提供了用于豬的肉質(zhì)評價和篩選特異性基因的功能cDNA芯片，該芯片是通過僅僅整合上述篩選到的肌肉特異性基因而制備的。因此，該功能cDNA芯片可用來根據(jù)豬的品種評價肉質(zhì)，并培育高肉質(zhì)的豬，因而本發(fā)明對養(yǎng)豬業(yè)是非常有用的。
權(quán)利要求
1.用于肉質(zhì)評價和篩選特異性基因的功能cDNA芯片，該芯片包括含有肌肉特異性基因的DNA探針和固定探針的基底，其中肌肉特異性基因是在豬的肌肉和脂肪組織中特異性表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能cDNA芯片，其中探針DNA包括ESM特異性基因和ASM特異性基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的功能cDNA芯片，其中ESM特異性基因包含肌動蛋白、β-肌球蛋白、糖原磷酸化酶、肌球蛋白重鏈、丙酮酸激酶和肌鈣蛋白C編碼基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的功能cDNA芯片，其中ASM特異性基因包含1-α動力蛋白重鏈、601446467F1，纖維連接蛋白前體物和MHC I型的編碼基因。
5.用于豬的肉質(zhì)評價和篩選特異性基因的試劑盒，包括權(quán)利要求1所述的功能cDNA芯片、整合在芯片上的從篩選組織的RNA中獲得的結(jié)合有Cy5-dCTP或Cy3-dCTP的cDNA、以及熒光掃描系統(tǒng)和計算機(jī)分析系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及根據(jù)豬的生長階段來篩選肌肉特異性基因的表達(dá)譜，以及采用該表達(dá)譜構(gòu)建的功能cDNA芯片，并且根據(jù)豬的肌肉和脂肪組織的生長階段提供了肌肉特異性基因的表達(dá)譜。此外，本發(fā)明還提供了用于豬的肉質(zhì)評價和篩選特異性基因的功能cDNA芯片，該芯片是通過僅僅整合上述篩選到的肌肉特異性基因而制備到的。因此，該功能cDNA芯片可用來根據(jù)豬的品種評價肉質(zhì)，并培育高肉質(zhì)的豬。
文檔編號C12M1/34GK1621532SQ20041000752
公開日2005年6月1日 申請日期2004年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月24日
發(fā)明者金哲旭, 呂政秀, 李正圭, 宋瑛敏, 曹光根, 鄭起和, 金一錫, 陣祥根, 樸修賢, 鄭智媛, 李旼晶, 權(quán)銀貞, 趙恩錫, 趙碻來, 慎詵敏, 南喜善, 洪娟喜, 洪星光, 姜陽守, 河永主, 盧正晚, 郭石俊, 崔仁灝, 金炳宇 申請人:慶尚南道, 金哲旭