專利名稱：一種禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因ns1及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及動物病毒學技術領域。具體涉及一種新的含有禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1的重組大腸桿菌菌株(Escherichia coli)BL21/pET-28a-NS1，利用該菌株表達禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，并建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)鑒別診斷方法，用于區(qū)分禽流感滅活疫苗免疫雞與野毒感染雞。本發(fā)明提供含有禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1的表達質(zhì)粒(pET-28a-NS1)、重組大腸桿菌菌株Escherichia coli BL21/pET-28a-NS1，NS1蛋白的表達與純化方法以及用該蛋白建立的可區(qū)分禽流感滅活疫苗免疫雞與野毒感染雞的鑒別診斷方法。
背景技術：
禽流感(Avian influenza virus，AIV)又名真性雞瘟或歐洲雞瘟，是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一種禽類的感染或/和疾病綜合征。是國際獸疫局規(guī)定的A類烈性傳染病，并被列入國際生物武器公約動物類傳染病名單。自1994年第一次報道H9N2亞型禽流感在中國的流行以來，我國對禽流感逐漸開始重視起來并開展了相應的研究。該亞型禽流感病毒不僅給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，同時國內(nèi)外學者的研究表明流感病毒也可能感染人，而且在中國大陸和香港地區(qū)一些流感毒株已經(jīng)傳給了豬和人，有可能給人類的健康構(gòu)成新的威脅，從而引起了人們的高度重視。
A型流感病毒的基因組由8個不連續(xù)的病毒RNA節(jié)段組成，片段8在8個基因組片段中最短，僅有890個核苷酸，該片段的5’端有26個核苷酸為非編碼區(qū)，它含有兩個讀碼框(閱讀框)，可編碼兩種蛋白質(zhì)，即NS1和NS2，兩者分子量分別為25000和12000。非結(jié)構(gòu)蛋白NS1與AIV的復制密切相關，AIV新合成的基因組的5’端通過共價鍵與NS1聯(lián)結(jié)，在隨后的病毒包裝過程中NS1被去掉并連在病毒粒子的外層，NS1具有抗原性，它雖然是微蛋白，但在病毒復制過程中能持續(xù)刺激機體產(chǎn)生抗體。非結(jié)構(gòu)蛋白的出現(xiàn)僅僅只限于病毒的感染期，而在使用滅活苗免疫時不會產(chǎn)生，研究表明，非結(jié)構(gòu)蛋白及其抗體可以作為病毒感染機體的一個重要標記，從而可以將其區(qū)分免疫群和感染群，進行鑒別診斷，但目前尚未有應用檢測非結(jié)構(gòu)蛋白抗體作鑒別禽流感的報道?；诖?，利用大腸桿菌表達NS1蛋白，建立了區(qū)分AIV野毒感染雞和滅活疫苗免疫雞的ELISA鑒別診斷方法。
由于目前禽流感是世界各國密切關注的最重要的動物傳染病。不同的國家或地區(qū)采取不同的控制政策，在采取捕殺政策的國家，重點是如何檢測隱性感染動物；在采取注射疫苗預防禽流感的國家，如何區(qū)分野毒感染雞和注苗動物則是控制和消滅該病的關鍵。因而建立有效的鑒別診斷方法以區(qū)別滅活疫苗免疫雞和野毒感染雞、檢測隱性感染雞就成為禽流感防制技術研究的重要課題。
目前用于禽流感檢測的方法可以分為抗原檢測和抗體檢測方法兩大類。前者主要包括病毒分離鑒定、RT-PCR、血凝試驗(HA)、核酸探針技術等，該類方法檢測周期長，技術、設備要求高，不適用于臨床大規(guī)模檢測；后者主要指血清學檢測方法，主要包括血凝抑制試驗(HI)、瓊脂擴散試驗(AGP)、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(NI)、病毒中和試驗(Virus Neutralization Test；VNT)、全病毒酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked Immunosorbent Assay；ELISA)等，該類方法操作較前者簡單易行，適合臨床大規(guī)模的抗體監(jiān)測，其不足是不能區(qū)分滅活疫苗免疫雞和野毒感染雞。因為常規(guī)的ELISA或血凝抑制試驗是檢測禽流感病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的抗體。結(jié)構(gòu)蛋白的抗體既可以通過免疫獲得，也可以由野毒感染而引起。因此這些方法只能用于動物禽流感病毒抗體水平的監(jiān)測，在及時發(fā)現(xiàn)野毒感染，清除野毒感染雞方面顯得無能為力。
現(xiàn)在發(fā)展中國家主要用禽流感滅活疫苗對本病進行防疫。由于禽流感滅活疫苗的成分主要是純化的滅活病毒粒子，疫苗免疫雞后，動物體內(nèi)不會有病毒增殖，因而也就無病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的表達，動物體內(nèi)也沒有抗非結(jié)構(gòu)蛋白抗體產(chǎn)生。而野毒感染雞體內(nèi)則有病毒的增殖，病毒在增殖過程中非結(jié)構(gòu)蛋白也得到了表達，其中的一些非結(jié)構(gòu)蛋白具有免疫原性，引起動物體產(chǎn)生抗非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體(Tesar等，Virus Genes.1989，3(1)29-44)。動物體這種抗體差異，為建立檢測隱性帶毒雞，區(qū)別滅活疫苗免疫雞和野毒感染雞的鑒別診斷方法提供了理論依據(jù)。
目前我國禽流感在禽流感的臨床抗體檢測中用的ELISA檢測方法是用滅活的禽流感全病毒包被酶標板制備酶標抗原。該方法存在病毒滅活不徹底，從而造成活病毒逃逸、擴散的潛在危險。
鑒于禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的特性，利用該蛋白研制出快速、準確、安全、廉價的鑒別禽流感免疫雞與野毒感染雞的診斷試劑盒，將為禽流感的防制和消滅提供有效工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種編碼禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1的cDNA序列。
本發(fā)明目的之二是提供一種可以特異性表達禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的重組大腸桿菌，為ELISA鑒別診斷方法提供抗原。
本發(fā)明的目的之三是提供一種表達及純化禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的制備方法。
本發(fā)明的目的之四是提供一種快速、準確、安全、廉價的區(qū)分禽流感免疫雞與野毒感染雞的ELISA鑒別診斷方法及鑒別診斷試劑盒。
本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)一種禽流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1的cDNA序列，它的cDNA序列如序列表SEQ ID N01所示。
表達禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1的重組大腸桿菌(Escherichia coli BL21/pET-28a-NS1，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2004年5月10日，保藏編號CCTCC NOM204035，其中所說的非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1含有如序列表SEQ ID NO1所示的cDNA序列。
一種禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1的重組大腸桿菌的制備方法，它包括下列步驟1)以分離的禽流感病毒基因組為模板，通過RT-PCR方法擴增得到禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1的cDNA序列；2)在原核表達載體pET-28a(Vet Q，1998，20Suppl 224-26)的SalI和XhoI多克隆位點中定向插入禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1的cDNA序列，構(gòu)建得到原核表達載體pET-28a-NS1；3)將步驟2)所說的原核表達載體pET-28a-NS1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，用卡那霉素抗性篩選單個重組菌，誘導該菌株，得到特異表達禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1；4)純化步驟3)所表達的NS1蛋白，得到所需的禽流感鑒別診斷抗原；5)將步驟4)得到的抗原組裝成鑒別診斷禽流感的試劑盒。
以上所說的禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1純化的具體步驟是挑取單個重組大腸桿菌BL21/pET-28a-NS1菌落至LB培養(yǎng)基加卡那霉素至終濃度50μg/mL，37℃搖床培養(yǎng)12小時后放4C冰箱過夜；用含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基將該菌液按1∶100比例稀釋后，分裝至細菌培養(yǎng)瓶中，置37℃搖床培養(yǎng)至OD600≅0.6,]]>用0.4mmol/L的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷進行誘導，每小時取樣100μl，誘導3-4小時后進行SDS-PAGE電泳分析，誘導的菌體經(jīng)離心、超聲波破碎后提取包涵體，經(jīng)純化、變性、復性等處理后分裝于-20℃保存?zhèn)溆?。在本步驟中申請人經(jīng)過反復驗證，證實本步驟中的一些重要技術參數(shù)如OD600≅0.6,]]>異丙基硫代-β-D-半乳糖苷最佳誘導濃度為0.4mmol/L，最佳誘導時間為3-4小時。
一種禽流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1在制備禽流感鑒別診斷試劑盒中的應用。
一種禽流感病毒的鑒別診斷試劑盒，它包含以上所述的禽流感鑒別診斷抗原。
以下對本發(fā)明做進一步描述1)作為本發(fā)明的原始禽流感病毒是由本申請人從湖北省感染了禽流感病毒的雞場中分離得到的，經(jīng)鑒定該毒株血清型為H9N2，該毒株保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2004年5月20日，保藏編號CCTCC-C200410。對該毒株的非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1進行克隆以提取的禽流感病毒RNA為模板，通過RT-PCR擴增得到NS1基因的cDNA，經(jīng)測序分析確定該NS1基因的cDNA序列如序列表SEQ ID NO1所示。
2)原核表達載體pET-28a-NS1的構(gòu)建將禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1的cDNA序列定向插入到原核表達載體pET-28a的SalI和XhoI多克隆位點。
3)重組大腸桿菌Escherichia coli BL21/pET-28a-NS1的構(gòu)建將2)所述的原核表達載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，經(jīng)卡那霉素抗性篩選得到陽性重組菌株。該菌株保藏在保藏在CCTCC，保藏日期2004年5月10日，保藏編號M204035。
4)禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因在大腸桿菌BL21中的表達及表達蛋白的純化方法將3)所述的重組大腸桿菌Escherichia coli BL21/pET-28a-NS1在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導，斑點雜交分析，證實該重組大腸桿菌可以特異性地表達禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，表達的蛋白以包涵體的形式存在大腸桿菌BL21中，且具有免疫學活性。
5)區(qū)分禽流感野毒感染雞與滅活疫苗免疫雞的NS1-ELISA鑒別診斷方法的建立與鑒別診斷試劑盒的制備經(jīng)離心破碎BL21細胞，從4)中所述的包涵體中純化NS1表達蛋白。用該蛋白包被ELISA酶標板制備ELISA抗原酶標板。用空白對照菌(Escherichia coli BL21/pET-28a)誘導產(chǎn)物制備血清稀釋液，按照普通ELISA方法檢測待檢血清。根據(jù)反應后的吸光值確定陰性、可疑、陽性的判斷臨界值。按照如下的配方制備包被液、洗滌液、封閉液、底物液A、B、終止液包被液(25mmol/L碳酸鹽緩沖液)Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，ddH2O加至1000mL(pH9.6)。
10倍洗滌液NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO4·12H2O 29g，KH2PO42g，Tween-20 5mL，雙蒸水加至1000mL(pH7.4)。
封閉液0.5g牛血清白蛋白(BSA)溶于100mL洗滌液。
底物液底物液A0.006％H2O2緩沖液；底物液B取Na2HPO4·12H2O14.2g，檸檬酸10.5g，用雙蒸水定容至500mL配成0.1磷酸鹽檸檬酸緩沖液(pH5.0)，然后加上聯(lián)苯二胺(TMB)。使用時將A液和B液等體積混合，混合后5分鐘內(nèi)使用，現(xiàn)配現(xiàn)用終止液(0.025％HF)HF(40％)625μL，雙蒸水100mL。
將NS1抗原酶標板、禽流感野毒感染標準陽性血清、滅活疫苗免疫標準陰性血清、包被液、洗滌液、封閉液底物緩沖液A、B、終止液組裝成NS1-ELISA鑒別診斷試劑盒。
本發(fā)明的有益效果是1、本發(fā)明的有益效果之一是生物安全性高。本發(fā)明所涉及到的原核表達載體pET-28a是分子生物學中常用的原核表達載體，沒有生物危險性，在此基礎上構(gòu)建的原核表達載體pET-28a-NS1也沒有任何生物危險性。重組大腸桿菌BL21/pET-28a-NS1是將原核表達載體pET-28a-NS1轉(zhuǎn)化至分子生物學中常用的大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞后經(jīng)卡那霉素抗性篩選獲得，也不具生物危險性。本發(fā)明所用的抗原酶標板是用禽流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白制備的，制備過程中不涉及禽流感活病毒，因此沒有禽流感活病毒逃逸、擴散的潛在危險。
2、本發(fā)明的有益效果之二是生產(chǎn)成本低。本發(fā)明所提供的禽流感鑒別診斷方法和診斷試劑盒所需抗原是禽流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。該蛋白可以通過重組大腸桿菌BL21/pET-28a-NS1在體外得到大量的表達，適合大規(guī)模的生產(chǎn)。而目前常用的禽流感全病毒ELISA診斷方法和診斷試劑盒的抗原是用禽流感全病毒制備的，需要大量的增殖活病毒，所需生產(chǎn)設備、生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)成本較高。
3、本發(fā)明的有益效果之三是可以提供區(qū)分禽流感野毒感染雞和滅活疫苗免疫雞鑒別診斷方法和鑒別診斷試劑盒。本發(fā)明ELISA鑒別診斷方法和試劑盒所用抗原為禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白。由于禽流感滅活疫苗免疫未感染禽流感病毒的雞群后，被免疫雞體內(nèi)無活病毒的增殖，故無禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的產(chǎn)生，也就無抗非結(jié)構(gòu)蛋白NS1抗體的產(chǎn)生，而禽流感野毒感染雞體內(nèi)有禽流感活病毒的增殖，病毒在增殖的過程中會轉(zhuǎn)錄翻譯出非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，動物機體就會產(chǎn)生抗非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的抗體。因此用禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，作為ELISA酶標抗原可以與抗非結(jié)構(gòu)蛋白NS1抗體發(fā)生特異性結(jié)合，從而達到鑒別禽流感診斷滅活疫苗免疫雞和野毒感染雞的效果。目前我國臨床上使用的常規(guī)ELISA診斷方法和試劑盒其ELISA抗原是用滅活的禽流感全病毒制備的。該方法檢測的是禽流感病毒的抗體。由于無論是滅活疫苗免疫雞還是野毒感染雞，都會產(chǎn)生抗禽流感病毒的抗體。因此常規(guī)的ELISA診斷方法和試劑盒不能達到本發(fā)明鑒別診斷的目的。
4、本發(fā)明的有益效果之四是提供的鑒別診斷試劑盒使用方便。本發(fā)明在提供了鑒別診斷方法的基礎上，還將該方法所需的各種試劑組裝成試劑盒，操作簡單易行，非常適合禽流感的臨床大規(guī)模檢測。


序列表SEQ ID NO1是本發(fā)明的禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的cDNA序列。
序列表SEQ ID NO2是本發(fā)明的禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的cDNA序列上游引物。
序列表SEQ ID NO3是本發(fā)明的禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的cDNA序列下游引物。
圖1顯示本發(fā)明的主要技術路線。
圖2顯示了表達病毒禽流感非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因表達載體pET-28a-NS1物理圖譜及構(gòu)建流程圖。
圖3顯示了AIV H9N2株RT-PCR擴增NS1結(jié)果。1.陰性對照，2.RT-PCR產(chǎn)物，3.DL2000 marker。
圖4顯示了重組表達質(zhì)粒的酶切鑒定圖。1.DL 2000 marker 2.pET-28a-NS1/SalI+XhoI 3.pET-28a/SalI+XhoI 4.DL 15000 marker圖5顯示的是誘導表達的禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的SDS-PAGE電泳圖。圖5(A)中1.蛋白marker 2.pET-28a-NS1 in BL21(DE3) 3.pET-28a in BL21(DE3)圖5(B)中1.蛋白marker 2.純化的NS1蛋白圖6顯示的是誘導表達的禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的斑點雜交檢測結(jié)果。1.pET-28a-NS12.pET-28a具體實施方式
實施例1禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1cNDA序列的克隆在9-11日齡雞胚上接種禽流感病毒(Avian influenza vir，作為本發(fā)明的原始禽流感病毒株，是由申請人從湖北省感染了禽流感病毒的某雞場中分離得到的，經(jīng)鑒定該毒株血清型為H9N2，該毒株保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2004年5月20日，保藏編號CCTCC-V200410。Us)收集病毒。以禽流感病毒提取的病毒RNA為模板，通過RT-PCR擴增禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因cDNA。RT-PCR所用引物根據(jù)NCBI報道的的NS1基因組序列設計，其序列如下P15’—GCGTCGACATAATGGATTCCAAC—3’(上游引物)P25’—CCACTCGAGCTATTTTGGAGAGAG—3’(下游引物)RT-PCR反應體系為模板RNA 8μL，2×Reaction buffer 25μL，P1、P2引物各1.0(終濃度為10pmol/L)，Taq/mix 1.0μL，加DEPC處理水至50μL。RT反應條件為45℃40分鐘，99℃5分鐘，5℃5分鐘；然后PCR反應條件為，95℃預變性5分鐘94℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，72℃延伸1分30秒，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。將RT-PCR產(chǎn)物回收、純化，與克隆載體pMD18-T連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆子(命名為pT-NS1)，小量提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定后測序得到NS1的cDNA全序列(如序列表SEQ ID NO1所示)。
實施例2禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因原核表達載體的構(gòu)建用SalI和XhoI分別酶切pT-NS1和載體pET-28a，回收NS1基因和載體pET-28a；然后用T4 DNAligase連接，16℃水浴過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，37℃培養(yǎng)，從中隨機挑選多個單菌落，分別放入LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12小時后從中提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定后篩選得到陽性重組質(zhì)粒，并命名為pET-28a-NS1。
實施例3
重組大腸桿菌Escherichia coli BL21/pET-28a-NS1和Escherichia coli BL21/pET-28a的構(gòu)建將重組表達載體pET-28a-NS1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，涂布LB卡那霉素(Kana)平皿，挑選多個單菌落放入LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)8小時后分別用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導表達，然后進行SDS-PAGE和斑點雜交分析，從中篩選出能夠在大腸桿菌BL21中誘導表達禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的重組大腸桿菌Escherichia coli BL21/pET-28a-NS1。
同時，將載體pET-28a同步轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21細胞，按以上方法在大腸桿菌BL21中誘導表達，篩選出無禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白表達的空白對照重組大腸桿菌菌Escherichia coli BL21/pET-28a。
實施例4最佳誘導物濃度及最佳誘導時間的確定挑取單個重組大腸桿菌Escherichia coli BL21/pET-28a-NS1菌落至5mL LB培養(yǎng)基，加卡那霉素(Kana)至終濃度為50μg/mL，37℃搖床培養(yǎng)8小時后放4℃冰箱過夜。用含50μg/mL卡那霉素(Kana)的LB培養(yǎng)基將該菌液按1∶100比例稀釋后，分裝至5支細菌培養(yǎng)瓶中(5mL/瓶)，置37℃搖床培養(yǎng)至OD600≅0.6,]]>加入誘導劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)3h后，等量取樣進行SDS-PAGE。根據(jù)NS1蛋白表達情況確定IPTG最佳誘導濃度為0.4mmol/L。
挑取單個重組大腸桿菌BL21/pET-28a-NS1菌落至5mL LB培養(yǎng)基，加至終濃度為50μg/mL，37℃搖床培養(yǎng)8小時后放4℃冰箱過夜。用含50μg/mL卡那霉素(Kana)的LB培養(yǎng)基將該菌液按1∶100比例稀釋后，分裝至5支細菌培養(yǎng)瓶中(5mL/瓶)，置37℃搖床培養(yǎng)至OD600≅0.6]]>，以最佳誘導物濃度(IPTG濃度為0.4mmol/L)進行誘導，每小時取樣1mL，共誘導5小時后進行SDS-PAGE電泳分析，根據(jù)NS1表達情況確定最佳誘導時間為3-4小時。
實施例5禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的大量誘導表達和蛋白純化挑取單個重組大腸桿菌Escherichia coli BL21/pET-28a-NS1菌落至5mL LB培養(yǎng)基，加卡那霉素至終濃度為50μg/mL，37℃搖床培養(yǎng)至混濁，放4℃冰箱過夜。取該菌液2mL加入200mL含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，置37℃搖床培養(yǎng)至OD600≅0.6]]>，加入誘導劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.4mmol/L，繼續(xù)誘導培養(yǎng)3-4小時。
離心收集誘導后的菌體，用細菌裂解液重懸，-40℃速凍1小時，超聲波破碎2-3分鐘，至溶液為清亮透明。4℃離心后棄上清，用少許TE溶液(pH7.4)輕輕洗滌沉淀。加入原細菌培養(yǎng)液體積1/10的包涵體變性溶液，用吸管吹打沉淀或攪拌，靜置1-2h，使其沉淀緩慢溶解。4℃12000轉(zhuǎn)離心10min，棄沉淀，取上清，加入PEG4000至0.2％(W/V)、氧化型谷光苷肽至1mM、還原性谷光苷肽2mM，靜置至少30min后，轉(zhuǎn)至處理好的透析袋中，于TE溶液(pH7.4)或PBS溶液(pH7.4)中透析2-3d，取出立即使用或分裝至1.5mL管，-20℃或-40℃保存?zhèn)溆眉毦呀庖号浞絋ris-Cl 50mM/L、EDTA 0.5mM/L、NaCl50mM/L、Glycerol 5％(W/V)、DTT 0.5mM/L(使用前加入)。
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實施例6禽流感病毒NS1-ELISA鑒別診斷試劑盒構(gòu)成及制備方法1、NS1-ELISA試劑盒包括1.1包被抗原的微孔板(8孔×12條×2塊)1.2陰、陽性對照血清各1管 (0.5ml/管)1.3抗雞IgG-HRP結(jié)合物 1瓶 (25ml/瓶)1.4 10倍洗滌液濃縮液 1瓶 (50ml/瓶)1.5底物A液、B液 各1瓶 (12ml/瓶)1.6終止液 1瓶 (12ml/瓶)1.7血清稀釋液 1瓶 (50ml/瓶)2、NS1-ELISA相關溶液配方包被液(25mmol/L碳酸鹽緩沖液)Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，ddH2O加至1000mL(pH9.6)。
10倍洗滌液NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO4·12H2O 29g，KH2PO42g，Tween-20 5mL，雙蒸水加至1000mL(pH7.4)。
封閉液0.5g牛血清白蛋白(BSA)溶于100mL洗滌液。
底物液底物液A0.006％H2O2緩沖液；底物液B取Na2HPO4·12H2O14.2g，檸檬酸10.5g，用雙蒸水定容至500mL配成0.1mL磷酸鹽檸檬酸緩沖液(pH5.0)，然后加上聯(lián)苯二胺(TMB)。使用時將A液和B液等體積混合，混合后5分鐘內(nèi)使用，現(xiàn)配現(xiàn)用終止液(0.025％HF)HF(40％)625μL，雙蒸水100mL。
3、NS1-ELISA抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度采取方陣滴定的方法來確定。試驗結(jié)果表明抗原最佳包被濃度為1∶80，即0.175μg/mL，血清最佳稀釋度為1∶40，即0.25μL/孔。(見表1、2所示).
表1用本發(fā)明的試劑盒檢測禽流感陽性血清結(jié)果血清稀 抗原釋度1∶101∶201∶401∶801∶160 1∶320 1∶640 1∶12801∶20 1.8001.6851.6421.1590.8640.860 0.577 0.6531∶40 1.6601.3281.349 0.6340.552 0.434 0.342陽性血清1∶80 1.2481.0651.0040.6930.5120.348 0.277 0.199結(jié)果1∶160 0.8750.8060.6770.4560.3240.183 0.123 0.1121∶320 0.7620.5460.4310.3320.2130.138 0.119 0.0861∶640 0.5600.4120.3300.2050.1520.117 0.090 0.076表2 用本發(fā)明的試劑盒檢測禽流感陰性血清結(jié)果抗原1∶101∶201∶401∶801∶160 1∶320 1∶640 1∶12801∶200.5100.4480.3570.2790.183 0.145 0.109 0.1091∶400.3630.3020.255 0.118 0.096 0.084 0.0851∶800.3220.2340.1860.1480.111 0.075 0.077 0.086
陰性血清結(jié)1∶160 0.238 0.217 0.1570.140 0.106 0.077 0.074 0.095果1∶320 0.237 0.165 0.1620.119 0.100 0.075 0.068 0.0831∶640 0.208 0.173 0.1220.111 0.094 0.060 0.062 0.065抗原酶標板的制備將上述實施例5制備的NS1蛋白用所說的包被液按1∶80稀釋，按100μL/孔加入到酶標板中，置37℃1小時后放入4℃冰箱過夜；棄包被液，加入所說的封閉液(150μL/孔)于37℃封閉1小時；棄封閉液，加保護劑(150μL/孔)，37℃1小時，4℃8小時，棄保護劑，自然風干；將酶標板放入專用錫泊袋，加一小袋干燥劑，抽真空，熱壓封口。
4、血清稀釋液的制備將空白對照菌(BL21/pET-28a)作同步誘導，離心收集菌體，TEN溶液(pH7.4)洗滌1次，加入原培養(yǎng)物體積1/10的PBS溶液(pH7.4)重懸，-40℃速凍1h，超聲波破碎至透明(2-3min)；取該溶液20mL，加入封閉液80mL，即為血清稀釋液。
實施例7禽流感病毒NS1-ELISA檢測步驟及判斷標準操作步驟1)從4℃冰箱中取出試劑盒，平衡各組分至室溫。
2)取預包被的微孔條板(根據(jù)標本多少，可拆開分次使用)，用洗滌液洗板3次，200μl/孔，每次靜置3分鐘倒掉，最后一次拍干。除空白對照孔外，每孔加入以樣品稀釋液1∶40稀釋的待檢樣品，每孔加100μl，同樣1∶40稀釋對照血清，設陽性對照2孔，陰性對照3孔，空白孔不加，輕輕振勻孔中樣品(勿溢出)，置37℃溫育30分鐘。
3)甩掉板孔中的溶液，用洗滌液洗板3次，200μl/孔，每次靜置3分鐘倒掉，最后一次拍干。
4)每孔加酶標二抗100μl，置37℃溫育30分鐘。
5)洗滌4次，200μl/孔，每次靜置3分鐘倒掉，最后一次拍干。
6)每孔加底物A液、B液各1滴(50μl)，室溫避光顯色15分鐘。
7)每孔加終止液1滴(50μl)，15分鐘內(nèi)測定結(jié)果。
NS1-ELISA結(jié)果判定標準的確定采集經(jīng)禽流感(H9N2)亞型滅活苗免疫，經(jīng)HI檢測為陽性的94份雞血清，進行NS1-ELISA檢測全為陰性，計算該94份血清的平均值x，標準偏差SD，陰陽界限計算公式x+2SD。計算得平均值x等于0.192，SD等于0.088，求得陰陽界限為0.369。
結(jié)果判定以空白孔調(diào)零，在酶標儀上測各孔OD630值，OD630≥0.369判為陽性，疑為禽流感病毒感染；OD630＜0.369判為陰性。
實施例8本發(fā)明的應用效果舉例本例中所指的NS1-ELISA檢測方法參照實施例7所述的操作步驟，其檢測結(jié)果如表3，表4和表5所示。
1.分別將雞新城疫陽性血清、雞馬立克氏病陽性血清、雞傳染性支氣管炎陽性血清、雞傳染性喉氣管炎陽性血清、雞傳染性法氏囊陽性血清、雞腺病毒I型陽性血清、雞腺病毒III型陽性血清、雞副流感陽性血清作1∶40稀釋，用NS1-ELISA檢測，同時設陽性、陰性對照，結(jié)果(表3)表明與上述陽性血清無交叉反應。
表3禽流感NS1-ELISA交叉反應的檢測血清編號1 2 3 4 5 6 7 8陽性對 陰性對照 照OD 0.217 0.206 0.097 0.179 0.134 0.137 0.114 0.112 1.1040.196值注1雞馬立克氏病陽性血清，2雞腺病毒I型陽性血清，3雞腺病毒III型陽性血清，4雞副流感陽性血清，5雞傳染性支氣管炎陽性血清，6雞傳染性喉氣管炎陽性血清，7雞新城疫陽性血清，8雞傳染性法氏囊陽性血清2.為驗證試劑盒的敏感性和特異性，選擇用國內(nèi)常用的檢測方法血凝抑制試驗(HI)檢測為陰性的健康雞群進行免疫試驗和攻毒試驗，抗體效價在第5周達峰值，檢測結(jié)果如下表4所述。
表4 禽流感NS1-ELISA的診斷特異性與敏感性試驗血清類型 血清數(shù)量NS1-ELISA結(jié)果 血凝抑制試驗(HI)結(jié)果(份) 陽性(陽性率％)陽性(陽性率％)AIV滅活苗免疫雞血72 4 (5.6) 69 (95.8)清AIV攻毒雞血清27 26 (96.3)26 (96.3)3.NS1-ELISA臨床檢測結(jié)果。
表5禽流感NS1-ELISA臨床檢測結(jié)果檢測雞來源地 血清份數(shù)陽性血清份數(shù)陽件率(％)廠東深圳403225 55.8湖北安陸1749051.7湖北新洲56 3460.7合計633348 55.0試驗結(jié)果顯示，利用禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因表達抗原，建立的ELISA檢測方法可以快速、準確地區(qū)分禽流感免疫雞與野毒感染雞。
盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實施例進行說明，但是不能認為是對本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍由所附權利要求書限定。另外，本領域的技術人員在所附權利要求書限定的范圍內(nèi)對本發(fā)明進行各種改動或修飾，這些改動或修飾形式同樣落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1序列1-3(SEQUENCE LISTING)<110>華中農(nóng)業(yè)大學<120>一種禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1及其制備方法與應用<130>
<141>2004-05-18<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>627<212>DNA<213>雞(Gallus gallus)<220>
<221>CDS<222>(1)..(627)<223>
<400>1act gtg tca agc ttc cag gta gac tgc ttt ctt tgg cat gtc cgc aaa48Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp His Val Arg Lys1 5 10 15cga ttt gca gac caa gaa ctg ggt gat gcc cca ttt ctg gac cgg ctt96Arg Phe Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe Leu Asp Arg Leu20 25 30cgc cga gat cag aag tcc ctg aga gga aga ggc agc act ctt ggt ctg144Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu35 40 45gac atc aga acc gcc act cat gaa gga aag cat ata gtg gag cgg atc192Asp Ile Arg Thr Ala Thr His Glu Gly Lys His Ile Val Glu Arg Ile50 55 60ctg gag gaa gag tca gat gag gca ctt aaa atg acc att gct tca gtg240
Leu Glu Glu Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr Ile Ala Ser Val65 70 75 80cca gct cca cgc tac cta act gac atg act ctt gaa gaa atg tca agg288Pro Ala Pro Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg85 90 95gat tgg tta atg ctc att ccc aaa cag aaa gtg aca ggg tcc ctt tgc336Asp Trp Leu Met Leu Ile Pro Lys Gln Lys Val Thr Gly Ser Leu Cys100 105 110att aga atg gac caa gca ata gtg gat aaa acc atc aca ctg aaa gca384Ile Arg Met Asp Gln Ala Ile Val Asp Lys Thr Ile Thr Leu Lys Ala115 120 125aac ttc agt gtg att ttc aat cga ctg gaa gct cta ata tta ctt aga432Asn Phe Ser Val Ile Phe Asn Arg Leu Glu Ala Leu Ile Leu Leu Arg130 135 140gct ttt aca gac gaa gga gca ata gtg ggc gaa atc tca cca tta cct480Ala Phe Thr Asp Glu Gly Ala Ile Val Gly Glu Ile Ser Pro Leu Pro145 150 155 160tct ctt cca gga cat act gat gag gat gtc aaa aat gca att ggg atc528Ser Leu Pro Gly His Thr Asp Glu Asp Val Lys Asn Ala Ile Gly Ile165 170 175ctc atc gga gga ttt gaa tgg aat gat aac aca gtt cga gtc tct gaa576Leu Ile Gly Gly Phe Glu Trp Asn Asp Asn Thr Val Arg Val Ser Glu180 185 190act cta cag aga ttc gct tgg aga agc agc gat gag gat ggg aga cct624Thr Leu Gln Arg Phe Ala Trp Arg Ser Ser Asp Glu Asp Gly Arg Pro195 200 205cca627Pro<210>2
<211>209<212>PRT<213>雞(Gallus gallus)<400>2Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp His Val Arg Lys1 5 10 15Arg Phe Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe Leu Asp Arg Leu20 25 30Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu35 40 45Asp Ile Arg Thr Ala Thr His Glu Gly Lys His Ile Val Glu Arg Ile50 55 60Leu Glu Glu Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr Ile Ala Ser Val65 70 75 80Pro Ala Pro Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg85 90 95Asp Trp Leu Met Leu Ile Pro Lys Gln Lys Val Thr Gly Ser Leu Cys100 105 110Ile Arg Met Asp Gln Ala Ile Val Asp Lys Thr Ile Thr Leu Lys Ala115 120 125Asn Phe Ser Val Ile Phe Asn Arg Leu Glu Ala Leu Ile Leu Leu Arg130 135 140Ala Phe Thr Asp Glu Gly Ala Ile Val Gly Glu Ile Ser Pro Leu Pro145 150 155 160Ser Leu Pro Gly His Thr Asp Glu Asp Val Lys Asn Ala Ile Gly Ile165 170 175Leu Ile Gly Gly Phe Glu Trp Asn Asp Asn Thr Val Arg Val Ser Glu180 185 190Thr Leu Gln Arg Phe Ala Trp Arg Ser Ser Asp Glu Asp Gly Arg Pro195 200 205
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<221>5’UTR<222>(1)..(24)<223>
<400>4ccactcgagc tattttggag agag2權利要求
1.一種禽流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1的cDNA序列，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO1所示。
2.表達禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1的重組大腸桿菌(Escherichia coli)BL21/pET-28a-NS1，保藏在CCTCC，保藏編號CCTCC NOM204035，其中所說的非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1含有如序列表SEQ ID NO1所示的cDNA序列。
3.一種禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1的重組大腸桿菌的制備方法，它包括下列步驟1)以分離的禽流感病毒基因組為模板，通過RT-PCR方法擴增得到禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1的cDNA序列；2)在原核表達載體pET-28a的SalI和XhoI多克隆位點中定向插入禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1的cDNA序列，構(gòu)建得到原核表達載體pET-28a-NS1；3)將步驟2)所說的原核表達載體pET-28a-NS1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，用卡那霉素抗性篩選單個重組菌，誘導該菌株，得到特異表達禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1；4)純化步驟3)所表達的NS1蛋白，得到所需的鑒別診斷抗原；5)將步驟4)得到的抗原組裝成鑒別診斷禽流感的試劑盒。
4.根據(jù)權利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟4)所述的純化優(yōu)選參數(shù)是，重組大腸桿菌在37℃搖床培養(yǎng)至OD600≅0.6,]]>用0.4mmol/L的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷進行誘導，誘導時間為3-4小時。
5.權利要求1-4任一項所述的禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1制作的禽流感鑒別診斷試劑盒。
6.一種禽流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1在制備禽流感鑒別診斷試劑盒中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于動物病毒學技術領域。公開了一種禽流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1的cDNA序列，用該基因構(gòu)建原核表達載體；將表達載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中得到重組菌株(Escherichia coli BL21/pET－28a－NS1)；利用該菌株表達禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1；利用所述的表達蛋白建立酶聯(lián)免疫吸附試驗鑒別診斷方法，用于區(qū)分禽流感滅活疫苗免疫雞與野毒感染雞。本發(fā)明還涉及制備方法、鑒別診斷試劑盒及其應用。
文檔編號C12N15/11GK1704474SQ20041000915
公開日2005年12月7日 申請日期2004年5月31日 優(yōu)先權日2004年5月31日
發(fā)明者金梅林, 陳煥春, 趙思婷, 王貴華, 張瑞華, 唐勇, 李紅超, 劉正飛, 錢平, 郭愛珍, 方六榮, 曹勝波, 吳斌 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學