專利名稱：大豆肽、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種低分子量的大豆肽產(chǎn)品、利用酶法直接降解低溫脫溶大豆豆粕制備該大豆肽的方法以及該大豆肽產(chǎn)品在抗疲勞及提高抗氧化能力方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的最基本的生命物質(zhì)之一，它的片段稱為肽。具有特定生理功能的肽稱為生物活性肽，是生命活動中起調(diào)節(jié)作用的一類重要生命物質(zhì)。近年來，國外的研究人員發(fā)現(xiàn)，從一些食物蛋白的酶水解產(chǎn)物中分離出的多種小肽具有調(diào)節(jié)人體的各種生理活性的作用。此外，長久以來人們知道，食物蛋白要經(jīng)過復(fù)雜的消化過程才能被人體吸收。然而，最近在醫(yī)學(xué)上發(fā)現(xiàn)，小肽可由腸道直接吸收，而且吸收速度要比相同組成的游離氨基酸還快，這些發(fā)現(xiàn)對開發(fā)肽類新型功能保健食品具有重要意義。
大豆肽是大豆蛋白經(jīng)過酶降解而獲得的多種肽的混合物。功能性食品應(yīng)該是具有合理營養(yǎng)和保健功能的營養(yǎng)健康食品。眾所周知，大豆蛋白是營養(yǎng)價值很高的食物蛋白，也是唯一能取代動物蛋白的植物蛋白。與大豆蛋白相比，大豆肽往往具有更良好的物理性質(zhì)和加工性能，例如，大豆蛋白的粘度隨濃度增加而迅速升高，但低分子量的大豆肽即使在50％的高濃度下也仍然保持流動性。大約10％濃度的大豆蛋白水溶液，一經(jīng)加熱就會凝固，而大豆多肽則不會。在溶解性方面，大豆蛋白在其等電點會形成沉淀，但大豆多肽仍然會保持溶解狀態(tài)。不僅如此，大豆多肽還具有抑制蛋白質(zhì)形成凝膠的能力。這些性質(zhì)對大豆肽的開發(fā)利用是非常有利的因素。除了營養(yǎng)功能而外，近年來人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，大豆多肽還具有許多生理功能，如調(diào)節(jié)脂肪代謝，降低膽固醇，抑制血壓升高，非過敏性，增強免疫功能等。
長久以來，大豆是生產(chǎn)食用油的主要原料，盡管制油工業(yè)的副產(chǎn)品豆粕中一小部分用來生產(chǎn)大豆分離蛋白，但大部分豆粕用來加工飼料，利用價值太低。然而，對大豆來說，豆粕中含有全部大豆蛋白質(zhì)。如果能以豆粕為原料并且直接用酶水解制備具有多種生理功能的高附加值的肽類功能食品，醫(yī)藥品以及包括化妝品在內(nèi)的其它產(chǎn)品。這可以使糧油資源得到綜合利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種原料易得、生產(chǎn)工藝簡單的制備一種低分子量的大豆肽的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種低分子量的大豆肽產(chǎn)品。
本發(fā)明的再一個目的是提供該低分子量肽產(chǎn)品在食品、藥品及化妝品行業(yè)中的應(yīng)用。
本發(fā)明是以大豆低溫脫溶豆粕(而不是以大豆分離蛋白)為原料，酶法制備低分子量大豆肽。這樣使大豆肽的生產(chǎn)工藝大大簡化，明顯降低成本。
本發(fā)明所述大豆肽的制備方法涉及大豆豆粕原料預(yù)處理、酸洗除雜、酶解等步驟，原料預(yù)處理即將大豆豆粕原料粉碎和過篩，目的是使大豆蛋白易溶出；酸洗除雜的目的是在使大豆蛋白沉淀的同時，使留在上清液中的可溶性寡糖等水溶性成分與其分開；在酶解過程中，蛋白質(zhì)被降解成肽，進入水溶液中，而纖維素類的不溶物留在沉淀中，固液分離后即得到大豆肽原液。最后采用超濾膜分離技術(shù)進行大豆肽的精制。
本發(fā)明涉及所采用的酶制劑底物專一性廣泛，容易獲得低分子量的肽片段，大豆肽基本無苦味。如果酶制劑選擇不當(dāng)，則大豆肽有苦味。
制備上述大豆肽產(chǎn)品的步驟如下制備步驟中所用水均為去離子水。
1、原材料預(yù)處理將市售大豆低溫脫溶豆粕用粉碎機粉碎，過60-80目篩；2、酸沉與水洗按固液比1∶8-1∶12往豆粕粉中加水，升溫至30-60℃，攪拌下用濃鹽酸調(diào)pH至3.0-6.0，沉淀大豆蛋白，繼續(xù)攪拌1-2h，6000-9000r/min離心，傾去上清；再按上述固液比往沉淀中加水(不需要升溫，也不調(diào)PH值)，攪拌15-20min洗沉淀，6000-9000r/min離心，去除上清液后收集沉淀；按同樣操作再水洗一次沉淀，棄上清，收集沉淀；3、酶水解按固液比1∶8-1∶12將步驟2中收集的沉淀與水混合，攪拌，用NaOH溶液調(diào)pH至8.0-10.0，升溫至35℃-60℃，按每kg豆粕加40-100ml酶液的比例，加入卡氏枯草桿菌絲氨酸堿性蛋白酶液[1]，開始水解反應(yīng)，在反應(yīng)的過程中，滴加0.05mol/LNaOH維持體系pH值恒定，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水解度達(dá)到20-30％時，停止反應(yīng)；
4、酶滅活步驟3結(jié)束后，快速升溫至90-100℃，保持10-20min使酶滅活，然后，快速(10-20min內(nèi))降至室溫，調(diào)pH至中性，12,000-15,000rpm，離心20-30min，固液分離，上清液為大豆肽原液；5、精制使大豆肽原液通過截止分子量5000-10,000Da的超濾膜系統(tǒng)，去掉大豆肽原液中的大分子片段完成其精制過程，膜上液回到步驟3繼續(xù)水解；6、濃縮由步驟5中得到的過膜液，減壓濃縮至固型物含量35-40％；7、干燥精制的大豆肽液濃縮后，經(jīng)噴霧干燥或冷凍干燥制成干粉，產(chǎn)率為20-30％(肽干粉/豆粕)；本發(fā)明大豆肽產(chǎn)品具有如下性能一.生物化學(xué)特征1、精制的大豆肽干粉是一種微黃色的粉末，粗蛋白質(zhì)量含量80％-85％，灰分5-7％，糖、水份及其他成分含量8-15％，其中糖為4-6％，產(chǎn)品的氮溶指數(shù)NSI為98.0-99.9％，三氯醋酸可溶蛋白(TCA Pr.)99.5％-99.9％；2、精制的大豆肽是一種寡肽的混合物，含有大約10-15％游離氨基酸，60％-70％寡肽的分子量分布在200-900Da；用TNBS法測定平均鏈長為3-5個氨基酸；3、大豆肽在所有pH下都能溶解于水；4、大豆肽對熱穩(wěn)定，100℃煮沸不出沉淀；5、大豆肽產(chǎn)品在室溫下保存3個月，肽含量無明顯變化；6、大豆肽氨基酸組成天門東氨酸；蘇氨酸；絲氨酸；谷氨酸；甘氨酸；丙氨酸；半胱氨酸；纈氨酸；蛋氨酸；異亮氨酸；亮氨酸；酪氨酸；苯丙氨酸；賴氨酸；組氨酸；精氨酸；脯氨酸。
二.生物功能1.大豆肽抗疲勞作用(1).檢測方法檢測動物昆明種雄性小鼠，6-8周齡，體重18-22g。隨機分成實驗組與對照組，以灌胃途徑給藥。實驗組每天灌服大豆肽溶液，給藥劑量實驗I組，100mg干粉/kg體重；實驗II組，200mg干粉/kg體重；實驗III組，400mg干粉/kg體重。干粉配成溶液后按小鼠每10g體重給藥0.2ml，對照組給同體積的蒸餾水。
運動耐力試驗，即負(fù)重游泳試驗40只小鼠，隨機分成四組，對照組及實驗I、II、III組。小鼠給藥25天后，將其置于游泳槽中游泳，水溫26±0.5℃，水深28cm，小鼠負(fù)重為體重的2％，記錄小鼠自由游泳從開始到死亡的時間。
血乳酸濃度測定40只小鼠，隨機分成對照組及實驗I、II、III組。給藥25天后，讓小鼠在30±2℃水中游泳30min，泳前安靜時及泳后15min、50min各取尾血一次，用對羥基聯(lián)苯比色法測定血乳酸含量。
肝糖原含量測定40只小鼠，隨機分成對照組及實驗I、II、III組。實驗第25天，處死小鼠，立即取出肝臟，用蒽酮比色法測定其糖原含量。
(2).檢測結(jié)果①小鼠負(fù)重游泳實驗從表1中數(shù)據(jù)可見，中劑量與高劑量組大豆肽的動物負(fù)重游泳時間與對照組比較，有明顯的延長并有顯著差異(與對照組相比P＜0.05)。
表1大豆肽對小鼠游泳時間的影響(X±SD)組 別 動物數(shù)(只)游泳時間(min)對照組 1079.64±12.24低劑量組1080.70±21.39中劑量組1096.93±8.27*高劑量組10112.45±9.36**與對照組相比P＜0.05②大豆肽對小鼠血乳酸濃度的影響從表2中的數(shù)據(jù)可以看出，大豆肽中、高劑量組的小鼠在實驗第25天，運動后15分鐘和50分鐘血乳酸值明顯低于對照組，且具顯著差異。在本實驗中，大豆肽實驗組小鼠在運動后15分鐘血乳酸值明顯低于對照組，證明在這個期間，有氧代謝在供能中所占比例很高，所以產(chǎn)生的乳酸少，則酵解過程中產(chǎn)生的乳酸不容易在肌肉中積累，從而可延緩疲勞的產(chǎn)生。實驗中，大豆肽實驗組小鼠在運動停止后50分鐘的血乳酸值明顯低于對照組，則表明在運動恢復(fù)期，肌肉中過多的乳酸能夠迅速被清除，這意味著能夠較快恢復(fù)疲勞。
表2大豆肽對小鼠乳酸含量的影響(mg/100ml，X±S)組 別 運動前 運動停止后15分鐘 運動停止后50分鐘對照組 28.97±2.95 57.48±2.98 49.04±1.77低劑量組 27.42±2.49 57.24±2.37 48.72±2.18中劑量組 27.51±2.43 52.38±1.56*44.44±2.87**高劑量組 28.01±2.97 48.78±1.78**40.29±2.00**
*P＜0.05；**P＜0.01③大豆肽對小鼠肝糖原含量的影響從表3中的數(shù)據(jù)可以看出，小鼠在給藥(大豆肽)第25天，其肝糖原含量，與對照組相比，低劑量組無顯著變化，而中劑量組小鼠肝糖原含量增加了22.30％(P＜0.05)，高劑量組小鼠肝糖原含量增加了35.98％(P＜0.01)。
如果機體在運動中肝糖原及肌糖原耗竭，則糖異生作用受阻，血糖濃度降低，并會干擾中樞神經(jīng)系統(tǒng)而出現(xiàn)疲勞。本實驗大豆肽實驗組肝糖原比對照組明顯提高，說明大豆肽能夠通過增加肝糖原儲備，維持運動時血糖水平，從而為機體提供更多的能量，使機體迅速恢復(fù)疲勞。
表3大豆肽對小鼠肝糖原的影響(X±SD)組別 肝糖原含量(mg/100g組織)對照組 2.78±0.30低劑量組 2.81±0.26中劑量組 3.48±0.21*高劑量組 3.79±0.23***P＜0.05；**P＜0.01上述實驗結(jié)果表明本發(fā)明所制備的大豆肽具有明顯的緩解體力疲勞的功能。此外，大豆肽富含人體必需氨基酸，且平衡良好，因而具有很高的營養(yǎng)價值。以大豆肽為基料，可以開發(fā)成保健食品和醫(yī)藥品(如腸道營養(yǎng)劑)，具有可以迅速消除疲勞，提高耐力以及補充營養(yǎng)等功效。該類產(chǎn)品適合長時間學(xué)習(xí)或工作的人，長時間開車或乘車的人以及從事體育運動或從事體力勞動的人食用。該產(chǎn)品也適合術(shù)后的病人或消化功能弱的老年人和嬰幼兒食用。該產(chǎn)品具有人群覆蓋面大的特點。
2.大豆肽抗氧化作用(1).檢測方法①鄰苯三酚自氧化鄰苯三酚(PR)在堿性條件下能迅速自氧化，釋放出O2-，生成有色的中間產(chǎn)物，可用分光光度法進行測定。PR自氧化過程的初始階段，中間產(chǎn)物的累積在30-40s后與時間成線性關(guān)系，且在320nm有強烈吸收，當(dāng)有抗氧化劑存在時，可清除O2-，從而阻止中間產(chǎn)物的積累，據(jù)此可求出抗氧化劑的類超氧化物歧化酶(SOD)活性。
反應(yīng)體積3ml，空白管加0.1ml重蒸餾水，2.8ml 0.1mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.2，)，25℃保溫10min，然后加入0.1ml預(yù)熱的3mmol/L鄰苯三酚，混勻，開始計時，反應(yīng)30s后，于320nm處作時間掃描，反應(yīng)時間4min?？瞻鬃罴训淖匝趸俾士刂茷?.06A/min；樣品管加0.1ml大豆肽(10mg/1ml)，2.8ml 0.1mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.2)，同樣25℃保溫10min，加入0.1ml 3mmol/L鄰苯三酚。30s后，于320nm處掃描。最后計算抑制率，用來評價樣品的清除超氧陰離子自由基的活性。
②亞油酸過氧化脂質(zhì)中的多不飽和脂肪酸由于含有多個雙鍵而化學(xué)性質(zhì)活潑，最易受到自由基的破壞發(fā)生過氧化反應(yīng)。一個不飽和脂肪酸分子通過自由基反應(yīng)形成共軛雙鍵和丙二醛。亞油酸是多不飽和脂肪酸的模型化合物，也含有多個雙鍵，亞油酸的過氧化可以代表體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的過程。
制備亞油酸微團液向避光容器中加入0.01mol/L，pH7.4的硼酸緩沖液，滴入適量的亞油酸，充分混勻至乳白色得亞油酸微團，濃度為6.4mmol/L，4℃冷藏保存，24小時內(nèi)使用。
亞油酸過氧化度的測定亞油酸過氧化由三個階段組成，即誘導(dǎo)期，延長期和終止期。在誘導(dǎo)期有共軛二烯生成，它反映亞油酸的過氧化程度，而共軛二烯在234nm有特征吸收；在亞油酸過氧化反應(yīng)的中期，有亞油酸過氧化物(LOOH)的生成，過氧化程度可以用過氧化值(POV)來表示；作為亞油酸過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物丙二醛(MDA)在終止期生成。而丙二醛可以與硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)，形成紅色的產(chǎn)物，在532nm的消光系數(shù)為1.56×105L·mol-1·cm-1。由此可以計算MDA的量，進而求出以MDA為代表的脂類過氧化值。
在測共軛二烯時，首先建立系統(tǒng)I，即0,01mol/L，pH7.4的硼酸緩沖液，含Vc 0.025mmol/L，Cu2+10μmol/L，亞油酸64μmol/L。其次，在系統(tǒng)I的基礎(chǔ)，通過分別加入終濃度為0.02，0.04，0.08mg/ml的大豆肽，0.04mg/ml的谷胱甘肽(GSH)建立系統(tǒng)II，III，IV和V。在25℃下，以相同濃度的亞油酸儲備液為空白，同步測定以上五個系統(tǒng)的OD234隨時間的變化，檢測大豆肽的抑制亞油酸過氧化的能力。
在測亞油酸過氧化物時(即測POV值)，每隔20分鐘，分別從上述體系I，III，V中取樣20ml，加入1.5ml 1N的HCl，將pH調(diào)至2.0以終止過氧化反應(yīng)。再加入4ml 40％的KI，于暗處放置10分鐘后，用準(zhǔn)確標(biāo)定的Na2S2O3滴定。當(dāng)溶液顏色由黃變?yōu)榈S時，加入兩滴1％的淀粉作指示劑，滴定至無色，記錄Na2S2O3的量。平行實驗三次。因為Cu2+也能氧化I-為I2，所以首先對只含Cu2+的空白體系進行滴定。以每ml反應(yīng)液中LOOH的生成量表示POV。
在測產(chǎn)物丙二醛時，先配制硫代巴比妥酸(TBA)溶液，稱取0.67g TBA，用100ml 5.6％的乙酸于56℃水浴溶解，保存于棕色瓶中待用。然后，建立以下四個系統(tǒng)系統(tǒng)I亞油酸的終濃度為64μmol/L，進行自氧化。
系統(tǒng)II亞油酸的終濃度為64μmol/L，Cu2+的終濃度的為10μmol/L，Vc的濃度為25μmol/L，使其進行過氧化。
系統(tǒng)III在系統(tǒng)II中加入終濃度為0.04mg/ml的大豆肽。
系統(tǒng)IV在系統(tǒng)II中加入終濃度為0.04mg/ml的GSH。
反應(yīng)啟動后，每隔20分鐘從各體系中取樣1ml，加入0.5ml的TBA后，沸水浴15分鐘，然后用去離子水稀釋至3.0ml。以去離子水為空白，測定OD532的值，平行實驗三次。
③大鼠紅細(xì)胞氧化溶血紅細(xì)胞懸液的制備Wistar大鼠斷頭取血，以4％的檸檬酸鈉作抗凝劑，加入2-3倍的生理鹽水懸浮，離心(1500r/min，5min，4℃)，去上清及黃色薄層，重復(fù)洗滌三次，懸浮于0.01mol/L，pH7.4的磷酸緩沖液中，配成1％的紅細(xì)胞懸液，冷藏待用。
紅細(xì)胞自溶血系統(tǒng)系統(tǒng)I10ml紅細(xì)胞懸液系統(tǒng)II系統(tǒng)I+0.1mmol/L大豆肽系統(tǒng)III系統(tǒng)I+0.1mmol/L Vc系統(tǒng)IV系統(tǒng)I+0.1mmol/L GSH過氧化氫誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血系統(tǒng)系統(tǒng)A10ml紅細(xì)胞懸液+100mmol/LH2O2；系統(tǒng)B系統(tǒng)A+0.1mmol/L大豆肽；系統(tǒng)C系統(tǒng)A+0.1mmol/LVc；系統(tǒng)D系統(tǒng)A+0.1mmol/L GSH系統(tǒng)A-D于37℃溫浴1h。
紅細(xì)胞自氧化溶血度的測定在測定血紅蛋白含量時，從系統(tǒng)I-IV1500r/min離心5min后的上清中取樣，測OD540；在測定氧化產(chǎn)物的量時，從系統(tǒng)I-IV1500r/min離心5min后的上清中取1.5ml加入1ml的TBA(硫代巴比妥酸)，置于沸水浴中30min，冷卻后1500r/min離心5min測OD532。OD532值與有色的反應(yīng)產(chǎn)物的濃度線性相關(guān)。
過氧化氫誘導(dǎo)的紅細(xì)胞過氧化溶血度的測定包括血紅蛋白的測定，方法是將系統(tǒng)A-D1500r/min離心5min后，取上清，測OD540，測定血紅蛋白的含量；氧化產(chǎn)物的測定方法從系統(tǒng)A-D1500r/min離心5min后的上清中取1.5ml，加入1ml的TBA溶液，沸水浴30min，冷卻后1500r/min離心5min，取上清液測定OD532，測定TBA反應(yīng)物的含量。
(2).檢驗結(jié)果①大豆肽對鄰苯三酚自氧化的抑制作用大豆肽對鄰三酚自氧化的抑制率按下式計算I＝(ΔAo-ΔA)/ΔAo×100％I表示抑制率；ΔAo、ΔA分別表示未加入和加入抗氧化劑后鄰苯三酚自氧化速率，即每分鐘其光吸收的平均變化率。經(jīng)測定，鄰苯三酚自氧化速率(ΔAo)為0.06A/min。
實驗結(jié)果表明，不同濃度大豆肽對鄰苯三酚自氧化的抑制率隨著樣品濃度的增加呈線性關(guān)系，其抑制率達(dá)到50％的大豆肽濃度(IC50)為4.5mg/ml。
②大豆肽對亞油酸過氧化的抑制作用共軛二烯測定結(jié)果以實驗條件下的亞油酸過氧化體系為對照組，加入不同濃度的大豆肽，測定反應(yīng)體系中共軛二烯生成量的變化，結(jié)果如附圖1所示。從圖中可見，大豆肽濃度為20μg/ml時的抑制率就已經(jīng)達(dá)到了80％，表現(xiàn)出較高的抗氧化活性。但是隨著濃度的增高，抑制率的增大并不十分明顯。分析其原因，可能是由于大豆肽的抗氧化活性主要表現(xiàn)為阻斷自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，捕捉自由基反應(yīng)鏈中的過氧自由基，因而可以減緩自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。而對于清除鏈引發(fā)階段自由基的能力較SOD等酶類要弱一些。因而即使抑制劑的濃度提高幾倍，抑制率的提高也不大。
過氧化亞油酸的測定結(jié)果亞油酸過氧化反應(yīng)生成的LOOH在弱酸條件下，可以把I-氧化成I2，I2又可與Na2S2O3進行定量反應(yīng)，由此可間接測定反應(yīng)生成的LOOH的量。因為Cu2+也能氧化I-，所以首先對只含Cu2+的空白體系進行滴定，以除去Cu2+對反應(yīng)的影響。
以大豆肽和谷胱甘肽(GSH)作為抗氧化劑，加入反應(yīng)體系，以檢驗大豆肽和GSH的抗氧化性，結(jié)果如附圖2所示。由圖2可知，大豆肽和GSH對過氧化亞油酸的生成都有抑制作用，但是在相同的肽濃度條件下大豆肽的抑制作用更強，大豆肽的抑制率為68.4％，GSH的抑制率為22.4％。
丙二醛的測定結(jié)果如附圖3所示，比較了大豆肽和GSH抑制亞油酸過氧化的終產(chǎn)物丙二醛的生成的作用。其中，GSH表現(xiàn)出較強的抑制作用，在濃度為0.04mg/ml時，其抑制率為46.2％，而大豆肽在相同的作用濃度下的抑制率為41.7％。
③大豆肽對大鼠紅細(xì)胞氧化溶血的影響以不加抗氧化劑的血紅蛋白的溶血為100％，計算加抗氧化劑的血紅蛋白的溶血度。由表4中可以看出，在有大豆肽存在時，紅細(xì)胞溶血度下降了38.6％，說明大豆肽對紅細(xì)胞的自氧化損傷有保護作用，強于谷胱甘肽(GSH)和Vc。
表4大豆肽對大鼠紅細(xì)胞自氧化溶血的影響自溶血大豆肽GSH VcOD5400.474 0.344 0.389 0.384溶血度 100％ 72.6％82.1％ 81.0％抑制率 --27.4％17.9％ 19％此外，在加入了外源活性氧(H2O2，O2-及·OH)作用于紅細(xì)胞之后，含有大豆肽的體系溶血度明顯下降(見表5)，由此可以推測大豆肽可能使紅細(xì)胞產(chǎn)生的超氧自由基減少。
表5 大豆肽對大鼠H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血的影響H2O2誘導(dǎo)的溶血 大豆肽 GSH VcOD5400.786±0.05 0.333±0.04 0.311±0.05 0.625±0.07溶血度 100％42.4％ 39.6％79.5％抑制度 -----57.3％ 60.4％20.5％自由基從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看是指含有未配對電子的基團、原子或分子。人體內(nèi)存在的氧自由基即活性氧，包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)，氫過氧基(HO2)，烷氧基(RO·)，烷過氧基(ROO·)，氫過氧化物(ROOH)和單線態(tài)氧(1O2)等。自由基是機體正常組織中的代謝產(chǎn)物，生成與被清除處于動態(tài)平衡，有的自由基對機體無明顯毒性，而大多數(shù)自由基對機體損害嚴(yán)重。只是在生理情況下這些自由基不斷產(chǎn)生，但也不斷被抗氧化劑清除，因而顯不出自由基對機體的損傷。而在某些病理情況下，自由基產(chǎn)生過多或清除過慢，它通過攻擊生物大分子使組織造成損傷，引起機體衰老，甚至引發(fā)腫瘤等惡性疾病。為了防御自由基的損傷，可以給予機體額外的自由基消除劑，以達(dá)到由于機體內(nèi)自由劑過剩所引發(fā)的疾病的目的。
隨著自由基理論的發(fā)展，天然小分子抗氧化劑的作用機理不斷被闡明，特別是維生素C(Vc)和谷胱甘肽(GSH)的作用機理已經(jīng)明了。上述實驗結(jié)果表明本發(fā)明所制備的大豆肽也是小分子的抗氧化劑。在摩爾濃度與GSH相當(dāng)?shù)那闆r下，大豆肽抑制亞油酸過氧化活性與GSH相接近。在反應(yīng)的第一與第二階段，大豆肽的抑制率略低于GSH，但在反應(yīng)第三階段高于GSH，表明大豆肽比巰基化合物更穩(wěn)定。紅細(xì)胞過氧化溶血實驗表明，在相同的摩爾濃度下，大豆肽抑制紅細(xì)胞過氧化溶血損傷能力，較Vc和GSH都強。
本發(fā)明所制備的大豆短肽具有清除自由基的抗氧化活性，這一生理功能可應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)和化妝品行業(yè)，適合于預(yù)防和治療由于自由基損傷所引起的疾病如癌癥，器官組織細(xì)胞的破壞和減少，免疫功能低下等。大豆肽可以用于普通食品的保鮮，如防止油類氧化酸敗。大豆肽可用于生產(chǎn)化妝品，如發(fā)乳劑，具有護發(fā)和保濕作用；又如面霜，有類似SOD的抗氧化作用，可以養(yǎng)顏(抗衰老)。與其他小分子抗氧化劑相比較，大豆肽更具有易制備，價格低廉，穩(wěn)定性好等特點。
三.大豆肽穩(wěn)定性檢驗對兩批大豆肽中試產(chǎn)品主要功效成分，即寡肽的穩(wěn)定性進行了檢驗。樣品在室溫條件下保存，每個月測定樣品中的肽的含量，觀察時間為三個月，測試結(jié)果見表6。
表6大豆肽穩(wěn)定性檢驗保存期(月) 批次I/mg/ml 批次II/mg/ml0 30.7 29.31 29.0 29.32 31.5 30.93 30.9 30.1由以上可以看出，本發(fā)明的大豆肽的具有制備工藝簡單，良好的物理性狀(低分子量，穩(wěn)定性高等)和多種生理功能(抗疲勞作用和較強的抗氧化作用)優(yōu)點。


圖1大豆肽濃度對亞油酸過氧化影響的實驗曲線；圖2大豆肽和谷胱甘肽對過氧化亞油酸生成抑制作用的實驗曲線；圖3大豆肽和GSH抑制亞油酸過氧化的終產(chǎn)物MDA生成的實驗曲線。
具體實施例方式
下面舉例說明本發(fā)明大豆肽的制備實施例1
取20g大豆豆粕粉(蛋白含量為45％)，加200ml水，攪拌，升溫至45℃，攪拌下用濃鹽酸調(diào)pH至4.2。2h后停止攪拌，離心(9000rpm，30min)，去掉上清，加200ml水，洗沉淀，攪拌20min，離心(9000rpm，30min)，去上清；此步驟再重復(fù)一遍。收集沉淀，加200ml水，攪拌，加0.5mol/LNaOH調(diào)pH9.5，升溫至35℃，加1.1ml酶液(卡氏枯草桿菌絲氨酸堿性蛋白酶[1]，Novo Nordisk)，開始水解反應(yīng)。在反應(yīng)的過程中，保持溫度50℃，維持pH9.5。當(dāng)水解度達(dá)到25％時，停止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，快速升溫至95℃，保持10-15min使酶滅活。然后，降至室溫，調(diào)pH至6.8。12,000rpm，離心30min，上清液為粗制大豆肽液。大豆肽液過截止分子量為5000Da的超濾膜，去除大分子片段。膜上液回到酶解罐中再次水解。精制的大豆肽液減壓濃縮至固形物含量35-40％，噴霧干燥得到精制的大豆肽干粉。產(chǎn)率0.51g/g蛋白，大豆肽含蛋白粗82.5％，灰分5.5％，糖及其他5.0％，水分7.0％；氮溶指數(shù)(NSI)99.9％，三氯醋酸可溶蛋白(TCA Pr.)99.8％，平均鏈長3.3，游離氨基酸14.8％。
實施例2取20g大豆豆粕粉(蛋白含量為45％)，加200ml水，攪拌，升溫至45℃，攪拌下用濃鹽酸調(diào)pH至4.2。2h后停止攪拌，離心(9000rpm，30min)，去掉上清，加200ml水，洗沉淀，攪拌20min，離心(9000rpm，30min)，去上清；此步驟再重復(fù)一遍，收集沉淀，加200ml水，調(diào)pH8.5，升溫至55℃，加1.6ml酶液(卡氏枯草桿菌絲氨酸堿性蛋白酶[1]，Novo Nordisk)，開始水解反應(yīng)。使pH維持在8.5。當(dāng)水解度達(dá)到30％時，停止反應(yīng)?？焖偕郎刂?5℃，保持15min使酶滅活。然后，降溫至室溫。調(diào)pH至7.0。12,000rpm，離心30min，上清液為粗制大豆肽液。大豆肽液過截止分子量10,000Da超濾膜。過膜液減壓濃縮至固形物含量35-40％，噴霧干燥，得到精制的大豆肽干粉。產(chǎn)率0.63g/g蛋白大豆肽含蛋白粗82.2％，灰分6.1％，糖及其他5.0％，水分6.7％；氮溶指數(shù)(NSI)99.9％，三氯醋酸可溶蛋白(TCA Pr.)99.6％，平均鏈長4.5，游離氨基酸14.5％。
文獻1Shui-Tein Chen，Shiah-Yun Chen，and Kung-Tsung Wang，Kinetically Controlled Peptide BondFormation in Anhydrous Alcohol Catalyzed by the Industrial Protease Alcalase，The Journal ofOrganic Chemistry，1992，57(25)6960-6965.
權(quán)利要求
1.一種大豆肽產(chǎn)品，其具有如下特征(1).精制的大豆肽干粉是一種微黃色的粉末，粗蛋白質(zhì)量含量80％-85％，灰分5-7％，糖、水份及其他成分含量8-15％，其中糖為4-6％，產(chǎn)品的氮溶指數(shù)NSI為98.0-99.9％，三氯醋酸可溶蛋白(TCA Pr.)99.5％-99.9％；(2).精制的大豆肽是一種寡肽的混合物，含有大約10-15％游離氨基酸，60％-70％寡肽的分子量分布在200-900Da；用TNBS法測定平均鏈長為3-5個氨基酸；(3).大豆肽在所有pH下都能溶解于水；(4).大豆肽對熱很穩(wěn)定，100℃煮沸不出沉淀；(5).大豆肽產(chǎn)品室溫下保存3個月肽含量無明顯變化；(6).大豆肽氨基酸組成天門東氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸。
2.權(quán)利要求1所述的大豆肽產(chǎn)品在抗疲勞方面的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的大豆肽產(chǎn)品在抗疲勞方面的應(yīng)用，其特征在于用于制備具有抗疲勞作用的保健食品或醫(yī)藥品。
4.如權(quán)利要求3所述的大豆肽產(chǎn)品在抗疲勞方面的應(yīng)用，其特征在于用于制備腸道營養(yǎng)劑。
5.權(quán)利要求1所述的大豆肽產(chǎn)品在用于提高抗氧化能力方面的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的大豆肽產(chǎn)品在用于提高抗氧化能力方面的應(yīng)用，其特征在于用于食品保鮮或用于制備化妝品。
7.如權(quán)利要求6所述的大豆肽產(chǎn)品在用于提高抗氧化能力方面的應(yīng)用，其特征在于用于制備具有護發(fā)和保濕作用的發(fā)乳劑或具有抗氧化作用的面霜。
8.如權(quán)利要求5所述的大豆肽產(chǎn)品在用于提高抗氧化能力方面的應(yīng)用，其特征在于用于制備預(yù)防和治療由于自由基損傷所引起的疾病的藥品。
9.如權(quán)利要求8所述的大豆肽產(chǎn)品在用于提高抗氧化能力方面的應(yīng)用，其特征在于用于制備預(yù)防和治療自由基損傷所引起的癌癥、器官組織細(xì)胞破壞和減少或免疫功能低下藥品。
10.一種制備權(quán)利要求1所述的大豆肽產(chǎn)品的方法，其步驟如下(1)原材料預(yù)處理大豆低溫脫脂豆粕粉碎，過60-80目篩；(2)酸沉與水洗按固液比1∶8-1∶12往豆粕粉中加去離子水，升溫至30-60℃，攪拌下用濃鹽酸調(diào)pH至3.0-6.0，沉淀大豆蛋白，繼續(xù)攪拌1-2h，6000-9000r/min離心，傾去上清；再按上述固液比往沉淀中加去離子水，攪拌15-20min洗沉淀，6000-9000r/min離心，去除上清液后收集沉淀，按同樣操作再水洗一次沉淀，棄上清，收集沉淀；(3)酶水解按固液比1∶8-1∶12將步驟2中收集的沉淀與去離子水混合，攪拌，用NaOH溶液調(diào)pH至8.0-10.0，升溫至35℃-60℃，按每kg豆粕加40-100ml酶液的比例，加入卡氏枯草桿菌絲氨酸堿性蛋白酶液，開始水解反應(yīng)，在反應(yīng)的過程中，滴加0.05mol/L NaOH維持體系pH值恒定，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水解度達(dá)到20-30％時，停止反應(yīng)；(4)酶滅活步驟3結(jié)束后，快速升溫至90-95℃，保持10-20min使酶滅活，然后，快速使溫度降至室溫，調(diào)pH至中性，12,000-15,000rpm離心20-30min，固液分離，得上清液，為大豆肽原液；(5)精制使大豆肽原液通過截止分子量5000-10,000Da的超濾膜系統(tǒng)，去掉大豆肽原液中的大分子片段完成其精制過程，膜上液回到步驟3繼續(xù)水解；(6)濃縮由步驟5中得到的過膜液，減壓濃縮至固型物含量35-40％；(7)干燥精制的大豆肽液濃縮后，經(jīng)噴霧干燥或冷凍干燥制成干粉，產(chǎn)率為20-30％。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種低分子量的大豆功能短肽產(chǎn)品、產(chǎn)品的制備方面及該產(chǎn)品在用于抗機體疲勞、提高機體抗氧化能力方面的應(yīng)用。該大豆肽是以低溫脫溶豆粕為原料，經(jīng)豆粕預(yù)處理、酶水解、酶滅活、精制和干燥制粉等步驟制得。大豆肽干粉是一種淡黃色的粉末，分子量主要分布在200－900Da，平均鏈長3－5個氨基酸，含有天門東氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸等多種氨基酸。本發(fā)明的大豆肽具有制備工藝簡單、高營養(yǎng)價值、物理性狀良好、多種生理功能等優(yōu)點，作為基料可以用于保健食品、普通食品添加劑、醫(yī)藥品和化妝品等領(lǐng)域。
文檔編號A23L1/305GK1593646SQ20041001099
公開日2005年3月16日 申請日期2004年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月16日
發(fā)明者張學(xué)忠, 吳曉霞, 徐力, 黃宜兵 申請人:吉林大學(xué)