專利名稱：一種制備海帶孢子體大分子量dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海帶孢子體大分子量DNA的制備，具體地說是一種簡單的制備海帶孢子體大分子量DNA的方法及其DNA分子量檢測方法。
背景技術(shù)：
海帶是我國重要的經(jīng)濟海藻之一，它含有豐富的碘、蛋白質(zhì)及各種人體必需的礦物元素。除了食用和藥用價值外，海帶所產(chǎn)生的褐藻酸和甘露醇是經(jīng)濟價值很高的工業(yè)原料。今年來，隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)已應(yīng)用到海帶的遺傳與變異、種質(zhì)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育等方面的研究中，而進行分子生物學(xué)研究的前提條件是制備高純度的海帶孢子體總DNA。
眾所周知，褐藻多糖如半乳糖及其衍生物和褐藻酸等一直是制約褐藻DNA制備的一個主要因素。與高等植物多糖相比，褐藻孢子體內(nèi)的多糖含量高，粘性大且是水溶性的。由于褐藻多糖能夠吸附DNA并與DNA共沉淀，導(dǎo)致所制備的DNA產(chǎn)量低，純度差，進而導(dǎo)致后續(xù)常規(guī)的分子生物學(xué)操作無法進行，如限制性內(nèi)切酶反應(yīng)，PCR反應(yīng)等。因此，制備高純度，得率高的海帶孢子體DNA是進行分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。
目前，關(guān)于褐藻DNA制備方法的已有一些報道。一是利用超速離心來去除褐藻多糖以純化DNA，但這種方法需要大量的海帶孢子體材料。二是利用Sepharose spin柱的方法來去除海帶孢子體中的褐藻多糖。三是運用CTAB方法，在Sargassum polycystum和S.siliquosum的DNA制備中有效地去除褐藻多糖，以此DNA為模板，成功地進行了PCR反應(yīng)。四是將褐藻酸裂解酶和CTAB結(jié)合來去除褐藻多糖。首先是用褐藻酸裂解酶裂解海帶孢子體組織細胞，去除海帶孢子體組織表面及細胞壁外褐藻多糖，再利用CTAB方法去除細胞內(nèi)剩余的多糖。上述制備海帶孢子體DNA的方法，過程繁瑣，即費時費用又很高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一個簡單易行的、適用于實驗室常規(guī)制備海帶孢子體大分子量DNA的方法。
一種制備海帶孢子體大分子量DNA的方法，可按如下步驟操作，1)取海帶孢子體在清水中清洗后，放入去多糖溶液中反復(fù)沖洗，重復(fù)此操作1次以上，用去多糖溶液去除海帶孢子體表面的多糖；2)將上述材料置于液氮中，迅速研成粉末(研磨1-6次)；液氮研磨使海帶孢子體組織細胞破碎，釋放細胞內(nèi)DNA；3)將藻粉轉(zhuǎn)入65℃預(yù)熱的SDS提取緩沖液的離心管中，63-65℃水浴保溫30min；4)加入KAc溶液(濃度為5mol L-1，pH 7.5)，混合均勻，第二次去多糖，去除細胞內(nèi)多糖；5)離心(10000rpm(10621×g)離心10min)，取上清，加入氯仿∶異戊醇抽提；用等體積的氯仿∶異戊醇去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)；6)離心(室溫12000rpm離心10min)，水相用冷的異丙醇于-18--20℃沉淀；7)離心(12000rpm室溫離心15min)，冷乙醇(體積濃度70％)洗沉淀，稍干后溶于TE中，加入RNase，終濃度為0.1μg μL-1，以消化RNA，得產(chǎn)品。
所述海帶孢子體表面去多糖溶液的組成為20％乙醇，0.5mol L-1KAc，pH 7.5；SDS提取緩沖液的組成為1.5％sodium dodecyl sulfate(SDS)，50mmol L-1ethylenediaminetetra-acetic acid(EDTA)，50mmol L-1Tris.HCl，pH 8.0，500mmol L-1NaCl，2％β-巰基乙醇；氯仿∶異戊醇的體積比最好為24∶1；于液氮中研磨時，液氮中加入10％海帶孢子體重量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
DNA濃度及純度測定1)使用BioPhotometer進行DNA濃度及純度測定；2)運用脈沖場電泳檢測所制備的海帶孢子體DNA分子量大小，即將制備的DNA溶解在TE緩沖液中，步驟為a.將所制備的海帶孢子體DNA溶于低熔點瓊脂糖中，并制備脈沖場膠塊；b.運用Bio-Rad CHEF Mapper脈沖場電泳儀，電泳檢測DNA。
電泳緩沖液為40mmol L-1Tris.HCl，pH 8.0，40mmol L-1冰乙酸，1mmol L-1EDTA；TE緩沖液的組成為10mmol L-1Tris.HCl，pH8.0，0.1mmolL-1EDTA，pH8.0；脈沖場電泳條件為電泳緩沖液為0.5×TBE(45mmol L-1Tris-borate，1mmol L-1EDTA，pH 8.0)，1％的瓊脂糖凝膠(Bio-Rad，Cat.No.161-3108，USA)，6V/cm，120°，脈沖交變時間5.3s到20.5s，線性遞增，電泳10.5h后，溴化乙錠染色20min，并使用分子生物學(xué)影像分析系統(tǒng)(Image Master System，Pharmacia Biotech，Sweden)拍照；電泳電壓為80-90V，電泳時間為1h。
3)普通瓊脂糖電泳檢測所制備的DNA分子量大小。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點1.速度快。本發(fā)明DNA提取步驟簡化，整個制備DNA過程在4h內(nèi)完成。
2.效果好。本發(fā)明有效地去除了褐藻多糖；得到了大分子量(48.5-97.0kb)及純度較高(OD260/OD280為1.7-1.9)的海帶孢子體DNA。
3.提取效率高。本發(fā)明在液氮中研磨，可使胞外或胞內(nèi)核酸酶失活，減少了DNA的降解；產(chǎn)量為18.7-37.5μg g-1(濕重)，能夠滿足常規(guī)分子生物學(xué)實驗要求。
4.無污染。本發(fā)明避免了使用有毒化學(xué)藥品。
5.操作費用較低。本發(fā)明在制備DNA的過程中沒有使用CTAB和蛋白酶K等試劑。


圖1為海帶孢子體DNA普通瓊脂糖電泳圖譜；圖2為海帶孢子體DNA脈沖場電泳圖譜；圖3為以本發(fā)明制備的DNA為模板擴增出HSR203j基因的部分片段的電泳圖譜；圖4為以本發(fā)明制備的DNA為底物進行限制性酶切反應(yīng)的電泳圖譜。
具體實施例方式
實施例11.海帶孢子體DNA的制備將用清水反復(fù)沖洗0.2～0.3g新鮮的海帶孢子體放入100mL去多糖溶液(20％乙醇，0.5mmol L-1KAc)中反復(fù)沖洗，重復(fù)此操作1次；將上述材料于液氮中，加入0.02g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，迅速研成粉末(1～6次)；將藻粉轉(zhuǎn)入63～65℃預(yù)熱的SDS提取緩沖液[1.5％sodium dodecylsulfate(SDS)，50mmol L-1ethylenediaminetetra-acetic acid(EDTA)，50mmol L-1Tris-HCl，pH 8.0，500mmol L-1NaCl，2％β-巰基乙醇]的離心管中，邊加熱邊混合均勻，65℃水浴保溫30min；加入溶液總體積1/3的5mol L-1KAc，混合均勻，冰上放置10min；10000rpm(10621×g)離心10min；取上清，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提10min，室溫12000rpm離心10min；水相用1倍體積的冷異丙醇沉淀，-18～-20℃沉淀30min；12000rpm室溫離心15min；用冷70％乙醇洗沉淀，稍干后溶于TE中；加入RNase，終濃度為0.1μg μL-1；使用BioPhotometer進行DNA濃度及純度測定；普通瓊脂糖凝膠電泳染色后顯示所提取的海帶DNA大小在23.0Kb以上。
2.脈沖場檢測DNA分子量大小將上述1所制備的DNA與含有低熔點瓊脂糖的TE(10mmol L-1Tris.HCl，pH8.0；1mmol L-1EDTA)緩沖液混合，制備脈沖場膠塊；應(yīng)用Bio-Rad CHEF Mapper脈沖場電泳儀電泳檢測DNA分子量大小。電泳條件為0.5×TBE(45mmol L-1Tris.borate，1mmol L-1EDTA，pH8.0)電泳緩沖液，1％的瓊脂糖凝膠，6V/cm，120°，脈沖交變時間5.3s到20.5s，線性遞增，電泳10.5h后，溴化乙錠染色20min，并使用分子生物學(xué)影像分析系統(tǒng)(Image Master System，Pharmacia Biotech，Sweden)拍照。脈沖電泳顯示所提取的DNA分子量大小為48.5～97.0kb。
應(yīng)用例1
以本發(fā)明實施例1制備的DNA為模板，擴增出HSR203j基因的部分片段(圖3)。
PCR擴增所用正向引物為P15’GTCAAAGATGTGGRCGCCGG3’，反向引物為P23’TGTTACCGCACCCTGTGTCAA3’。PCR反應(yīng)組成反應(yīng)總體積為20μL。1×PCR buffer(50mM KCl，0.01％gelatin，10mMTris.HCl，pH 9.0)，2.5mM MgCl2，0.2mM dNTP，0.2μM引物，40～50ng DNA，2.0U Taq酶。反應(yīng)參數(shù)為92～94℃預(yù)變性5min，，92～94℃60s，55～58.6℃60s，70～72℃120s，30個循環(huán)，70～72℃延伸10min。
應(yīng)用例2以本發(fā)明實施例1制備提取的DNA為底物，進行限制性酶切反應(yīng)，酶切反應(yīng)圖譜如圖4所示。酶切底物為1-2μg海帶孢子體DNA，限制性內(nèi)切酶分別是PstI，HindIII，BamHI，PvuII和EcoRI。酶切反應(yīng)時間為12-16h。
權(quán)利要求
1.一種制備海帶孢子體大分子量DNA的方法，其特征在于可按如下步驟操作，1)取海帶孢子體在清水中清洗后，放入去多糖溶液中沖洗，以去除海帶孢子體表面的多糖；2)將上述材料置于液氮中，迅速研成粉末；3)將藻粉轉(zhuǎn)入SDS提取緩沖液中，63～65℃保溫30min；4)加入KAc溶液，混合均勻，第二次去多糖；5)離心，取上清，加入氯仿異戊醇抽提；6)離心，水相用異丙醇于-18～-20℃沉淀；7)離心，乙醇洗沉淀，稍干后溶于TE中，加入RNase，得產(chǎn)品。
2.按照權(quán)利1所述制備海帶孢子體大分子量DNA的方法，其特征在于所述海帶孢子體表面去多糖溶液的組成為20％乙醇，0.5mol L-1KAc，pH 7.5。
3.按照權(quán)利1所述制備海帶孢子體大分子量DNA的方法，其特征在于所述SDS提取緩沖液的組成為1.5％SDS，50mmol L-1EDTA，50mmol L-1Tris.HCl，pH 8.0，500mmol L-1NaCl，2％β-巰基乙醇。
4.按照權(quán)利1所述制備海帶孢子體大分子量DNA的方法，其特征在于所述氯仿∶異戊醇的體積比為24∶1。
5.按照權(quán)利1所述制備海帶孢子體大分子量DNA的方法，其特征在于所述于液氮中研磨時，液氮中加入10％海帶孢子體重量的聚乙烯吡咯烷酮。
6.按照權(quán)利1所述制備海帶孢子體大分子量DNA的方法，其特征在于在獲得所述產(chǎn)品后，應(yīng)用脈沖場電泳進行DNA分子量大小的檢測，將制備的DNA溶解在TE緩沖液中，使用BioPhotometer進行DNA濃度及純度測定。
7.按照權(quán)利6所述制備海帶孢子體大分子量DNA的方法，其特征在于所述脈沖場電泳檢測的過程為，1)將得到的DNA與含有低熔點瓊脂糖的TE緩沖液混合，制備脈沖場膠塊；2)應(yīng)用Bio-Rad CHEF Mapper脈沖場電泳儀檢測DNA分子量大小。
全文摘要
本發(fā)明涉及海帶孢子體大分子量DNA的制備，具體地說是一種簡單的制備海帶孢子體大分子量DNA的方法，可按如下步驟操作，1)取海帶孢子體在清水中清洗后，放入去多糖溶液中沖洗，以去除海帶孢子體表面的多糖；2)將上述材料置于液氮中，迅速研成粉末；3)將藻粉轉(zhuǎn)入SDS提取緩沖液中，63～65℃保溫30min；4)加入KAc溶液，混合均勻，第二次去多糖；5)離心，取上清，加入氯仿異戊醇抽提；6)離心，水相用異丙醇于－18～－20℃沉淀；7)離心，乙醇洗沉淀，稍干后溶于TE中，加入RNase，得產(chǎn)品。本發(fā)明的優(yōu)點為速度快，效果好，提取效率高，無污染，操作費用較低。
文檔編號C12N15/29GK1800386SQ20041001141
公開日2006年7月12日 申請日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者段德麟, 王高歌, 胡自民 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所