專利名稱：石斑魚性反轉(zhuǎn)基因蛋白及核苷酸序列和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種石斑魚性反轉(zhuǎn)相關(guān)基因的序列，更具體涉及一種從石斑魚垂體的SMART cDNA文庫中篩選出的性反轉(zhuǎn)相關(guān)因子1(sex inversion relatedfactor 1，sirf1)的序列、氨基酸序列，本發(fā)明還涉及該基因的載體和重組株的用途。
背景技術(shù)：
石斑魚(E.coioides)為海洋珊瑚礁魚類，屬鮨科(Serranidae)，石斑魚屬(Epinephelus)，是一種名貴的海水魚類，銷售市場穩(wěn)定、價格昂貴，同時石斑魚也是人工繁殖與育苗技術(shù)難度最大的海產(chǎn)魚類之一，至今養(yǎng)殖種苗的供應(yīng)仍依賴捕撈野生天然苗。近年來，日本、東南亞各國、我國臺灣、華南沿海都進行了大規(guī)模的人工養(yǎng)殖。隨著海洋魚類人工規(guī)模化養(yǎng)殖不斷發(fā)展，天然苗種已不能滿足養(yǎng)殖生產(chǎn)的需要，人工育苗成為其持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)。盡管已進行了一些初步的繁殖生物學(xué)研究，但對人工育苗的理論基礎(chǔ)---生殖調(diào)控的研究才剛剛起步、基礎(chǔ)十分薄弱。據(jù)張其永等2000年統(tǒng)計，我國已成功繁殖培育出幼苗魚苗的石斑魚種類有赤點石斑魚、鮭點石斑魚、點帶石斑魚等。但實際上它們離能夠較穩(wěn)定地進行種苗批量生產(chǎn)的目標(biāo)尚有相當(dāng)?shù)牟罹唷?br> 石斑魚人工繁殖與育苗的難度主要來自以下幾個方面(1)石斑魚雌雄同體，雌性先熟，然后性轉(zhuǎn)化；(2)受精卵質(zhì)量差，孵化率低；(3)仔魚個體纖細(xì)，對開口餌料的要求嚴(yán)格；以及稚、幼魚的自相殘殺習(xí)性、病害等問題。尤其是石斑魚個體發(fā)育中普遍存在“先雌后雄”的性轉(zhuǎn)變過程，雄親魚均高齡化(一般6齡以上)，長時間的性逆轉(zhuǎn)過程，不僅消耗大量餌料，而且等生長到雄性精巢可以釋精時，種群數(shù)量已十分稀少而難以捕獲。即使捕獲到雄性親魚，因雌雄親魚性成熟不同步配對，導(dǎo)致受精率較低。目前育苗的方法是用外源的性類固醇激素(17a-甲基睪酮)給食、注射或埋植進行強制逆轉(zhuǎn)培育雄性親魚。但在完全不了解其性別逆轉(zhuǎn)的分子機制的前提下，盲目地用過多的外源類固醇激素必然會帶來很多弊端。譬如，不僅費工費時，而且轉(zhuǎn)化效果差，性轉(zhuǎn)變后，雄魚精子活力不強，而停藥后，會產(chǎn)生性別復(fù)原問題。埋植激素后會導(dǎo)致手術(shù)魚不攝食或攝食減弱，影響魚正常發(fā)育。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種石斑魚性反轉(zhuǎn)基因蛋白及核苷酸序列，篩選方法簡便，該基因可用于提高石斑魚繁殖力，培育雄性親魚。
本發(fā)明還涉及一種石斑魚性反轉(zhuǎn)相關(guān)因子1(sirf1)的基因序列在石斑魚生殖調(diào)控、性腺分化和性別逆轉(zhuǎn)中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及一種含有石斑魚性反轉(zhuǎn)相關(guān)因子1(sirf1)的載體在石斑魚生殖調(diào)控、性腺分化和性別逆轉(zhuǎn)中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及一種含有石斑魚性反轉(zhuǎn)相關(guān)因子1(sirf1)的載體的重組株在石斑魚生殖調(diào)控、性腺分化和性別逆轉(zhuǎn)中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及一種由含有石斑魚性反轉(zhuǎn)相關(guān)因子1(sirf1)的載體的重組株表達的蛋白在石斑魚生殖調(diào)控、性腺分化和性別逆轉(zhuǎn)中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及一種石斑魚性反轉(zhuǎn)相關(guān)基因的原核表達的融合蛋白GST-SIRF1在飼料制備人工餌料中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及一種石斑魚性反轉(zhuǎn)相關(guān)基因的原核表達的融合蛋白GST-SIRF1在石斑魚的繁殖和人工控制性別中的應(yīng)用。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)措施本發(fā)明所述的基因石斑魚性反轉(zhuǎn)相關(guān)因子1(sirf1)是從石斑魚垂體的SMART cDNA質(zhì)粒文庫中篩選到的一個基因。其特征是基因cDNA序列和編碼蛋白的氨基酸序列(如下)。該基因的cDNA長608bp，有一個252bp(54-305)的開放閱讀框，編碼83個氨基酸，5’非編碼區(qū)長53bp，起始于一個包含在脊椎動物起始密碼子ANNATG基元；3’非編碼區(qū)長303bp，有多聚腺苷酸加尾信號(AAUAAA)和多聚腺苷酸尾巴。在GenBank中進行氨基酸同源搜索，發(fā)現(xiàn)與本實驗室克隆到的一個原腸期特異轉(zhuǎn)錄的胚胎發(fā)育調(diào)控因子ger1具有90％的同源性。采用基因的特異引物擴增sirf1編碼C端73個氨基酸的cDNA片段，經(jīng)一系列純化、酶切、連接入pGEX-KG載體中，獲得含有該基因的表達載體pGEX-KG-sirf1。將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)pLysS(Novagen)，篩選獲得可誘導(dǎo)表達融合蛋白的重組株EcoliBL21(pGEX-KG-SIRF1)。
性反轉(zhuǎn)相關(guān)因子1(sirf1)基因的cDNA序列(SEQ ID No.1)GACACTCGATTGTTTTCCTCCTCTGAGACGGACAGCAGAGAGCCACAGCCAAGATGAGACTGTACCTTGCAATTGCCGTGCTGATGCTGGCTTTGGTCGCATACACAGAGGCCCAGGAGGAGACCTTCGAGCAGAAGTTCGCCAAGTTTACCGAGCAGGTGACTCAGGTGGGCCAAAACCTGGGTGAAAGGCTCAAGACCGGCTTTGATGATATCCAAACCAGCGACTTTGCAACCAATTCAAAGGCCCGTGTCAATGACTTTTTTGAGTGGGTGAAGACAAAACTTGAAGACCTCAACAACT
AAACAAGTCCCAGTCTCCAGCCTACAACCTGCCGTCTGACCGCTGACCTCTTCACACAAGTCATCGCTCTGCTCACCACGCAAAATGGTTGTGTTGCCTCTCTGTCAGTGTTTTTTGTAGATTAATTTAAGTGTAATCTTTTGGGGGGAAACAATGTGAAAAAGTGCAATAAAGACATCAAAAGAAAACATTTTATTATTATTATTTATATATCCATTTTAATCACTGGAAATAATATAAGAATTAAGTGTACTGAATAAAAAAAGTAAACAATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA性反轉(zhuǎn)相關(guān)因子1(sirf1)基因編碼蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No.2)MRLYLAIAVLMLALVAYTEAQEETFEQKFAKFTEQVTQVGQNLGERLKTGFDDIQTSDFATNSKARVNDFFEWVKTKLEDLNN該基因編碼83個氨基酸，前面21個氨基酸肽段為信號肽，其性反轉(zhuǎn)相關(guān)因子1(sirf1)基因編碼蛋白的氨基酸序列見序列表。通過Signal P程序?qū)ζ涞鞍状嬖谛盘栯牡目赡苄赃M行了分析，發(fā)現(xiàn)其N-端的21個氨基酸肽段為信號肽，提示該蛋白為分泌型蛋白(圖1)。
運用RT-PCR技術(shù)考察了其在石斑魚肝臟、腎臟、脾臟、胰臟、心、肌、垂體、下丘腦、端腦、小腦、中腦、延腦的mRNA水平，考察了其在處于卵子發(fā)生期、卵母細(xì)胞成熟期和變性期不同階段石斑魚個體的腦垂體、下丘腦及成熟卵巢和處于變性期的性腺的表達圖譜，結(jié)果表明該基因在六種腦組織和性腺中大量轉(zhuǎn)錄(圖2、3)。硬骨魚類與其它脊椎動物相似，“下丘腦—垂體—性腺”是調(diào)節(jié)生殖活動的重要內(nèi)分泌系統(tǒng)。該基因的表達譜完全符合魚類生殖的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)體系中的“下丘腦—垂體—性腺”組成的三級主干結(jié)構(gòu)，這表明該基因在調(diào)控石斑魚的生殖和性腺分化中具有重要功能。
采用基因的特異引物擴增sirf1編碼C端73個氨基酸的cDNA片段，經(jīng)一系列純化、酶切、連接入pGEX-KG載體中，獲得含有該基因的表達載體pGEX-KG-sirf1。將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)pLysS(Novagen)，篩選獲得可誘導(dǎo)表達融合蛋白的重組株Ecoli BL21(pGEX-KG-SIRF1)。通過上述過程制備含有該基因的載體和重組株，原核表達該蛋白(圖4)并免疫家兔制備多克隆抗體，用以研究該基因在性腺中的定位，以推斷其功能。
首先采用甲基睪丸酮人工誘導(dǎo)赤點石斑魚性反轉(zhuǎn)，通過42天的誘導(dǎo)，所有個體均成功被誘導(dǎo)為雄性個體，并能少量產(chǎn)精。對激素組和對照組性腺切片的組織學(xué)觀察表明，經(jīng)過42天投喂正常飼料的對照組所有個體的性腺為退化的卵巢；而投喂混有甲基睪丸酮的激素組所有個體的性腺為完全成熟的精巢。每隔一周收集激素組性腺進行SIRF1的熒光免疫組化分析。冰凍切片和FITC標(biāo)記的熒光染色結(jié)果表明，性反轉(zhuǎn)前的性腺表現(xiàn)為卵巢，SIRF1蛋白定位于顆粒細(xì)胞中(圖5)；性反轉(zhuǎn)一周的性腺為退化的卵巢，SIRF1蛋白主要定位于顆粒細(xì)胞中(圖6)。性反轉(zhuǎn)2周和3周的性腺，精小葉已形成，退化卵子重排在精小葉中，該蛋白表達量大，主要存在于精小葉壁的內(nèi)側(cè)細(xì)胞中(圖7、8)；在性反轉(zhuǎn)4周的性腺中，該蛋白表達量減弱，僅在少數(shù)精小葉壁的內(nèi)側(cè)細(xì)胞中有表達(圖9)；在性反轉(zhuǎn)5周和6周的性腺中，檢測不到該蛋白的表達(圖10)。鑒于已知在雌性個體中，由顆粒細(xì)胞分泌雌性激素刺激卵子的發(fā)育；在雄性個體中，精小葉壁的內(nèi)側(cè)細(xì)胞分泌雄性激素，而且該類細(xì)胞對類固醇(雌性激素雌二醇和雄性激素睪酮均為類固醇物質(zhì))的測定呈陽性反應(yīng)。考慮到該蛋白受雄性激素甲基睪丸酮誘導(dǎo)后大量在精小葉壁內(nèi)側(cè)細(xì)胞表達，在成熟精巢的精小葉壁內(nèi)側(cè)細(xì)胞中檢測不到該蛋白的存在，由此推測它有可能在受到甲基睪丸酮的誘導(dǎo)后，大量表達，并刺激其它雄性激素分泌，與性反轉(zhuǎn)相關(guān)。通過制備含有該基因的載體和重組株，制備原核蛋白，用于研究該基因在石斑魚性腺分化和性別逆轉(zhuǎn)中的作用。
鑒于sirf1基因是新基因，目前人類對此基因的認(rèn)識和了解僅限于本發(fā)明人所作的科學(xué)工作研究。由于該基因在腦組織和性腺中有大量轉(zhuǎn)錄，同時該蛋白在卵巢中定位于顆粒細(xì)胞中，在處于由雌向雄性轉(zhuǎn)變性腺中，定位于精小葉壁的內(nèi)側(cè)細(xì)胞中，考慮到已知這兩類細(xì)胞是分泌性激素的細(xì)胞，而該蛋白也是一個分泌型小肽，這表明該基因是調(diào)控石斑魚的由雌向雄性轉(zhuǎn)變的一個重要調(diào)控基因，在精小葉的形成中起重要作用。
本發(fā)明的優(yōu)點通過制備含有該基因的載體、重組株、表達的原核蛋白，用于研究該基因在石斑魚的生殖調(diào)控、性腺分化和性別逆轉(zhuǎn)中的作用。通過制備原核蛋白，可作為飼料添加劑制備人工餌料，以增強石斑魚的繁殖力和人工控制性別。


圖1為Signal P程序分析顯示出的基因sirf1的信號肽位置圖1是通過Signal P程序?qū)IRF1蛋白存在信號肽的可能性進行了分析，發(fā)現(xiàn)其N-端的21個氨基酸肽段極可能為信號肽，其信號肽酶的可能切割位點位于第21位和22位氨基酸之間，提示該蛋白為分泌型蛋白。
圖2為RT-PCR檢測基因sirf1在石斑魚組織中的表達圖2表明該基因在六種腦組織中大量轉(zhuǎn)錄，在其他6種組織中檢測不到轉(zhuǎn)錄本的存在。
圖3為RT-PCR檢測基因sirf1在處于卵子發(fā)生期(1)、卵母細(xì)胞成熟期(2)、變性期(3)不同階段石斑魚個體的腦垂體、下丘腦及成熟卵巢和處于變性期的性脲中的表達圖3表明在不同發(fā)育階段的垂體、下丘腦和性腺中都可檢測到大量轉(zhuǎn)錄本的存在。
圖4為SIRF1蛋白的原核表達，檢測誘導(dǎo)表達了GST-SIRF1基因的大腸桿菌菌體的結(jié)果圖4表明高效誘導(dǎo)表達了大小約為33KD的GST-SIRF融合蛋白(箭頭所示)圖5為SIRF1蛋白在赤點石斑魚性反轉(zhuǎn)前性腺中切片雜交實驗(明亮綠色為陽性信號)，其中A為兩個不同個體的卵巢切片；B從左至右依次為成熟卵子、開始敗育卵子和完全敗育的卵子；C為B的蘇木精—曙紅(HE)染色。
圖5表明SIRF1蛋白定位于顆粒細(xì)胞中。
圖6為SIRF1蛋白在赤點石斑魚喂以甲基睪丸酮1周后性腺中切片雜交實驗(明亮綠色為陽性信號)圖6表明SIRF1蛋白定位于顆粒細(xì)胞中。
圖7為SIRF1蛋白在赤點石斑魚喂以甲基睪丸酮2周后性腺切片雜交實驗(明亮綠色為陽性信號)，其中A為熒光染色；B為HE染色。此時，精小葉已初步形成，退化的卵子重排在精小葉中。
圖7表明SIRF1蛋白定位于精小葉壁的內(nèi)側(cè)細(xì)胞中。
圖8為SIRF1蛋白在赤點石斑魚喂以甲基睪丸酮3周后性腺切片雜交實驗(明亮綠色為陽性信號)，其中A、B為精小葉縱切面，C、D為精小葉橫切面；A、C為熒光染色，B、D為HE染色。此時，精巢組織與卵巢組織的比例約為7∶3。
圖8表明SIRF1蛋白定位于精小葉壁的內(nèi)側(cè)細(xì)胞中。
圖9為SIRF1蛋白在赤點石斑魚喂以甲基睪丸酮4周后性腺切片雜交實驗(明亮綠色為陽性信號)，其中A為熒光染色；B為HE染色。此時，精巢組織與卵巢組織的比例約為8∶2。
圖9表明只有少數(shù)精小葉壁的內(nèi)側(cè)細(xì)胞中可檢測到SIRF1蛋白。
圖10為SIRF1蛋白在赤點石斑魚喂以甲基睪丸酮5周后性腺中切片雜交實驗(明亮綠色為陽性信號)，其中A為熒光染色；B為HE染色。此時，為成熟精巢組織。
圖10表明檢測不到SIRF1蛋白。
具體實施例方式
1、RNA的提取和SMART cDNA質(zhì)粒文庫的構(gòu)建下丘腦總RNA用SV Total RNA Isolation System(Promega)提取，步驟具體如下取約15斤石斑魚1尾，麻醉放血，開顱取出下丘腦，加入175μl的抽提緩沖溶液，充分勻漿后，加入350μl RNA稀釋緩沖液，混勻后70℃封阻3分鐘，14 000×g離心10min。轉(zhuǎn)移上清，加入200μl 95％乙醇，吹打混勻后轉(zhuǎn)移至離心柱，14 000×g離心1min，加入600μl RNA洗滌液，14 000×g離心1min。加入50μlDNA酶I 20-25℃消化15min后加200μl DNA酶終止溶液，14 000×g離心1min。加入600μl SVRNA洗滌液，14 000×g離心1min后，再次加入250μl RNA洗滌液，高速離心2min。用250μl無RNA酶水洗脫總RNA兩次。取0.5-5μl電泳檢測總RNA濃度和質(zhì)量。其余總RNA于-70℃凍結(jié)實，真空凍干機超低溫凍干濃縮，溶解于20-30μl水中，取0.5μl電泳檢測mRNA濃度和質(zhì)量。
SMART cDNA的合成用SMART cDNA library construction Kit(Clontech)試劑盒，具體操作如下合成所用的3個引物序列為(1)CDS引物(10μmol/L)5’-AAGCA GTGGTAACAACGCAGAGTACT(30)N-1N-3’；(2)Smart II寡核苷酸(10μmol/L)5’-AAG CAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG-3’；(3)PCR引物(10μmol/L)5’-AAGCAG TGGTAACAACGCAGAGT-3’。
取下丘腦總RNA 50ng，按文庫構(gòu)建方法合成第一鏈cDNA加入CDS引物和Smart II寡核苷酸各1μl，72℃保溫2min后，冰上速冷2min；然后在終體積為10μL的反應(yīng)體系中，加入5×第一鏈反應(yīng)緩沖液(250mmol/L Tris-HCl，pH8.3；375mmol/L KCl；30mmol/L MgCl2)2μl、DTT(20mmol/L)1μl、dNTP(10mmol/L)1μl和PowerScript逆轉(zhuǎn)錄酶1μl，42℃保溫1h合成第一鏈cDNA。取2μl第一鏈cDNA加入dNTP 2μl、PCR引物4μl、和2μl 50×Advantage 2 cDNA PolymeraseMix，于100μl反應(yīng)體系中進行如下PCR循環(huán)95℃預(yù)變性1min后，以95℃5s、65℃5s、68℃6min反應(yīng)13個循環(huán)，72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取5μL電泳檢測。此PCR產(chǎn)物用于構(gòu)建質(zhì)粒文庫。合成的SMART cDNA連接入pEGM-T載體中(Promega)，并轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。
2、質(zhì)粒文庫的隨機篩選及測序鋪平板(內(nèi)含100μg/mL Amp以及5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)，37℃培養(yǎng)過夜。挑取白色菌斑于預(yù)先分裝有100μL Amp-LB的Eppendorf管中，37℃培養(yǎng)2h以上。取1μL菌液作模板，以M13+和M13-為引物(M13+CAGGAAACAGCTATGAC；M13-GTAAACGACGGCCAGT)，PCR鑒定插入片段大小。將插入片段大于500bp的克隆進行測序(上海，生工)。在隨機篩選并測序的90個克隆中，共檢測到該基因的1個克隆(編號分別為3-49)。該基因的cDNA長608bp，有一個252bp(54-305)的開放閱讀框，編碼83個氨基酸，5’非編碼區(qū)長53bp，起始于一個包含在脊椎動物起始密碼子ANNATG基元；3’非編碼區(qū)長303bp，有多聚腺苷酸加尾信號(AAUAAA)和多聚腺苷酸尾巴。在GenBank中進行氨基酸同源搜索，發(fā)現(xiàn)與本實驗室克隆到的一個原腸期特異轉(zhuǎn)錄的胚胎發(fā)育調(diào)控因子ger1具有90％的同源性。
3、組織和胚胎總RNA的提取和RT-PCR反應(yīng)提取了石斑魚的各種組織(包括肝臟、腎臟、脾臟、胰臟、心、肌、垂體、下丘腦、端腦、小腦、中腦、延腦)的RNA，提取了處于卵子發(fā)生期、卵母細(xì)胞成熟期變性期不同階段石斑魚個體的腦垂體、下丘腦及成熟卵巢和處于變性期的性腺的RNA。總RNA的提取用SV total RNA isolation system(Promega)提取。具體步驟見操作手冊。各取0.2μg的總RNA，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco BRL)和寡聚(dT)8-12反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。取第一鏈cDNA稀釋10倍后1μl作模板用該基因的特異引物(3-49-FGAATTCATATGAGACTGTACCTTGCAATTG；3-49-RGCTCGAGTTAGTTGTTGAGGTCTTCAAG)進行PCR。反應(yīng)體系的總體積為20μl，內(nèi)含1μl模板DNA，0.2μM引物，0.5單位Taq酶，0.1μM dNTP和1×Taq酶反應(yīng)緩沖液。PCR反應(yīng)在Perkin-Elmer DNA GeneAmp PCR System9600擴增儀上進行，反應(yīng)程序為在94℃預(yù)變性4分鐘后，進行28個擴增循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性40秒，62℃復(fù)性50秒，72℃延伸50秒。最后一次循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7分鐘。擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離。用α-tubulin基因(上游引物5’-GTGCACTGGTCTTCA GGGGTT-3’，下游引物5’-GGGAAGTGGATGCGTGGGTAT-3’)作為對照。
α-tubulin引物做PCR，確證各個組織逆轉(zhuǎn)錄的效率都符合要求而且cDNA的量都相差不多。而該基因的表達圖譜顯示該基因在六種腦組織和性腺中大量轉(zhuǎn)錄(圖2、3)。硬骨魚類與其它脊椎動物相似，“下丘腦—垂體—性腺”是調(diào)節(jié)生殖活動的重要內(nèi)分泌系統(tǒng)。該基因的表達譜完全符合魚類生殖的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)體系中的“下丘腦—垂體—性腺”組成的三級主干結(jié)構(gòu)，這表明該基因是調(diào)控石斑魚的由雌向雄性轉(zhuǎn)變的一個重要調(diào)控基因。
4、sirf1基因重組載體和重組株的構(gòu)建采用基因的特異引物(正向引物為5′--3′，反向引物為GCTCGAGTTAGTTGTTGAGGTCTTCAAG)擴增sirf1編碼C端73個氨基酸的cDNA片段(擴增條件與RT-PCR相同)，正向引物中含有EcoR I酶切位點和起始密碼ATG，反向引物中含有Xol I酶切位點和終止密碼TAG。
將PCR擴增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠中電泳分離后，在紫外燈下切下所要的特異DNA帶，并將之置于1.5ml指管中。DNA片段的純化參照Biostar GlassmilkDNA Purification Kit(BioStar International，Canada)使用手冊進行。所使用的試劑全由試劑盒提供。步驟如下每個指管中加入3倍體積的NaI后，55℃水浴5-10分鐘以充分溶化凝膠。加入5μl玻璃奶，充分混合后室溫放置5分鐘，此時DNA與玻璃奶結(jié)合。高速離心5秒以沉淀玻璃奶和DNA形成的混合物。棄去上清后，加入0.5ml預(yù)冷的漂洗液重懸。高速離心后棄去上清，重復(fù)漂洗二次。將所得沉淀室溫干燥10分鐘后，加入10μl無離子水懸浮沉淀，室溫放置5-10分鐘，此時DNA溶解在水中。高速離心30秒，小心吸取上清，可直接用于連接。
連接反應(yīng)的總體積為10μl，內(nèi)含大約50ng的純化DNA，50ng pGEM-T載體(Promega)，1μl T4 DNA連接酶(3 Weiss units/μl，Promega)，4℃水浴過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入含有DH5α的高效感受態(tài)細(xì)胞的指管中。將指管輕輕振蕩以混合連接產(chǎn)物與細(xì)胞后，置于冰上20分鐘。將指管置于42℃的水浴中熱休克細(xì)胞40-50分鐘后，立刻回置冰上2分鐘。往指管中加入1ml LB培養(yǎng)基37℃振蕩(150rpm)培養(yǎng)1小時。離心沉淀細(xì)胞，加入100μl LB培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并將其均勻涂于含有LB/ampicillin(50μg/ml)的平皿上。37℃培養(yǎng)平皿過夜。
挑選白色的克隆置于含有氨卞青霉素的4.5ml LB培養(yǎng)基的指管中，37℃振蕩(150rpm)培養(yǎng)過夜。質(zhì)粒DNA的提取和純化參照Min-MTMPlasmid Miniprep(Viogene)的使用手冊進行。所使用的試劑全由試劑盒提供。4000g離心5分鐘收獲細(xì)胞。加入250μl溶液I重懸細(xì)胞，250μl溶液II裂解細(xì)胞，370μl溶液III中和反應(yīng)液后，10,000g離心5分鐘。吸取上清置于純化柱中(柱子放置在一1.5ml指管中)，10,000g離心純化柱5秒。加入0.5ml漂洗緩沖液I于柱中，100,00g離心30秒，棄去指管中的廢液。加入0.7ml漂洗緩沖液II于柱中，10,000g離心30秒，取出柱子，放置于一新的1.5ml指管中。加入50μl無離子水于柱中，垂直放置30秒后，10,000g離心1分鐘。
將含有該基因片段的質(zhì)粒DNA和pGEX-KG載體分別用EcoR I(Biolabs)和Xol I(Biolabs)雙酶切37℃消化。將酶切產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠中電泳分離后，在紫外燈下切下所要的特異DNA帶，并將之置于1.5ml指管中。DNA片段的純化參照Biostar Glassmilk DNA Purification Kit(BioStar International，Canada)使用手冊進行。將線性化的質(zhì)粒DNA和pGEX-KG載體在T4 DNA連接酶(Promega)作用下4℃連接。連接反應(yīng)的總體積為10μl，內(nèi)含大約50ng的純化DNA，50ng pGEM-T載體(Promega)，1μl T4 DNA連接酶(3 Weiss units/μl)，4℃水浴過夜。獲得含有該基因的表達載體pGEX-KG-sirf1。將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)pLysS(Novagen)，挑含有表達載體的單克隆接種至含有50μg/ml氨卞青霉素37℃培養(yǎng)過夜，次日以1∶100的比例轉(zhuǎn)接至新鮮含有50μg/ml氨卞青霉素的LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8，加入終濃度為1mmoL的IPTG在37℃誘導(dǎo)表達3-6h。離心收集菌體，加入200μl of 2X Laemmli proteinsample buffer(per 10 milliliters，combine2.5ml 0.5M Tris，pH6.8，4ml 10％SDS，2ml glycerol，1mlβ-mercaptoethanol，0.01％(w/v)bromophenol blue)重新懸浮，超聲波破碎至不再混濁，12000g離心收集上清。12.5％SDS-PAGE電泳45分鐘檢測20μl樣品，用考馬思亮藍染色。表達出的sirf1融合蛋白經(jīng)鑒定是可溶蛋白，獲得重組株Ecoli BL21(pGEX-KG-SIRF1)。
5、sirf1基因多克隆抗體的制備將表達的重組蛋白切膠回收，SDS-PAGE電泳檢驗其純度。純化的蛋白制備多克隆抗體，第一次用量為200μg，與等體積弗氏完全佐劑充分混勻乳化，在家兔的背部皮下多點注射，每點注射約0.2mL。以后每隔2周加強免疫3次，每次用量為150μg，后3次以弗氏不完全佐劑乳化樣品。在第4次注射后10天自心臟抽取血液。將兔血于37℃放置1h后再在4℃放置過夜，4,000×g離心10min，吸取上層的多抗血清，分裝后于-80℃凍存。
6、SIRF1基因的冰凍切片和雜交實驗將石斑魚的性反轉(zhuǎn)進程中的性腺用30％蔗糖浸泡3小時后進行冰凍切片，厚度為7μm。將切片經(jīng)4％多聚甲醛固定30分鐘后，用3×PBS洗2次，每次10分鐘；再用1×PBS洗3次，每次10分鐘；漂洗結(jié)束后經(jīng)乙醇逐級脫水后保存于-20℃中待用。將切片先滴加PBS于4℃濕盒復(fù)水30分鐘后，用5％奶粉封閉1個小時。PBS沖洗幾次后用1％的一抗結(jié)合4℃過夜，用免疫前家兔的正常血清作對照。第二天用PBST(PBS加0.1％吐溫20)搖洗5次，每次10分鐘；10％正常羊血清封閉1個小時，再加熒光標(biāo)記(FITC)的二抗(1∶100，華美)室溫避光處理1小時后，用PBS漂洗5次，每次10分鐘。熒光顯微鏡下觀測結(jié)果。
冰凍切片和FITC標(biāo)記的熒光染色結(jié)果表明，性反轉(zhuǎn)前的性腺表現(xiàn)為卵巢，SIRF1蛋白定位于顆粒細(xì)胞中(圖5)；性反轉(zhuǎn)一周的性腺為退化的卵巢，SIRF1蛋白主要定位于顆粒細(xì)胞中(圖6)。在性反轉(zhuǎn)2周和3周的性腺中，該蛋白表達量大，主要存在于精小葉壁的內(nèi)側(cè)細(xì)胞中(圖7、8)；在性反轉(zhuǎn)4周的性腺中，該蛋白表達量減弱，僅在少數(shù)精小葉壁的內(nèi)側(cè)細(xì)胞中有表達(圖9)；在性反轉(zhuǎn)5周和6周的性腺中，檢測不到該蛋白的表達(圖10)。
鑒于已知在雌性個體中，由顆粒細(xì)胞分泌雌性激素刺激卵子的發(fā)育；在雄性個體中，精小葉壁的內(nèi)側(cè)細(xì)胞分泌雄性激素，而且該類細(xì)胞對類固醇(雌性激素雌二醇和雄性激素睪酮均為類固醇物質(zhì))的測定呈陽性反應(yīng)。考慮到該蛋白受雄性激素甲基睪丸酮誘導(dǎo)后大量在精小葉壁內(nèi)側(cè)細(xì)胞表達，在成熟精巢的精小葉壁內(nèi)側(cè)細(xì)胞中檢測不到該蛋白的存在，由此可知在受到甲基睪丸酮的誘導(dǎo)后，該蛋白大量表達，并刺激其它雄性激素分泌，該基因是調(diào)控石斑魚的由雌向雄性轉(zhuǎn)變的一個重要調(diào)控基因，在精小葉的形成中起重要作用。
序列表<110>中國科學(xué)院水生生物研究所<120>石斑魚性反轉(zhuǎn)基因蛋白及核苷酸序列和應(yīng)用<160>2<210>1<211>608<212>DNA<213>石斑魚(Epinephelus coioides)<220>
<221>mRNA<222>(1，608)<220>
<221>CDS<222>(54)...(305)<400>1gacactcgat tgttttcctc ctctgagacg gacagcagag agccacagcc aag atg aga 59Met Arg1ctg tac ctt gca att gcc gtg ctg atg ctg gct ttg gtc gca tac aca107Leu Tyr Leu Ala Ile Ala Val Leu Met Leu Ala Leu Val Ala Tyr Thr5 10 15gag gcc cag gag gag acc ttc gag cag aag ttc gcc aag ttt acc gag155Glu Ala Gln Glu Glu Thr Phe Glu Gln Lys Phe Ala Lys Phe Thr Glu20 25 30cag gtg act cag gtg ggc caa aac ctg ggt gaa agg ctc aag acc ggc203Gln Val Thr Gln Val Gly Gln Asn Leu Gly Glu Arg Leu Lys Thr Gly35 40 45ttt gat gat atc caa acc agc gac ttt gca acc aat tca aag gcc cgt251Phe Asp Asp Ile Gln Thr Ser Asp Phe Ala Thr Asn Ser Lys Ala Arg50 55 60gtc aat gac ttt ttt gag tgg gtg aag aca aaa ctt gaa gac ctc aac299Val Asn Asp Phe Phe Glu Trp Val Lys Thr Lys Leu Glu Asp Leu Asn
65 70 75aac taa acaagtccca gtctccagcc tacaacctgc cgtctgaccg ctgacctctt355Asn *80cacacaagtc atcgctctgc tcaccacgca aaatggttgt gttgcctctc tgtcagtgtt 415ttttgtagat taatttaagt gtaatctttt ggggggaaac aatgtgaaaa agtgcaataa 475agacatcaaa agaaaacatt ttattattat tatttatata tccattttaa tcactggaaa 535taatataaga attaagtgta ctgaataaaa aaagtaaaca atcaaaaaaa aaaaaaaaaa 595aaaaaaaaaa aaa 608<210>2<211>83<212>PRT<213>石斑魚(Epinephelus coioides)<220>
<221>CHAIN<222>(22，83)<220>
<221>SIGNAL<222>(1)...(21)<400>2Met Arg Leu Tyr Leu Ala Ile Ala Val Leu Met Leu Ala Leu Val1 5 10 15Thr Ala Tyr Glu Ala Gln Glu Glu Thr Phe Glu Gln Lys Phe Ala20 25 30Lys Phe Thr Glu Gln Val Thr Gln Val Gly Gln Asn Leu Gly Glu35 40 45Arg Leu Lys Thr Gly Phe Asp Asp Ile Gln Thr Ser Asp Phe Ala50 55 60Thr Asn Ser Lys Ala Arg Val Asn Asp Phe Phe Glu Trp Val Lys65 70 75Thr Lys Leu Glu Asp Leu Asn Asn80
權(quán)利要求
1.一種石斑魚性反轉(zhuǎn)基因的蛋白，其具有與SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
2.一種石斑魚性反轉(zhuǎn)基因的核苷酸，其具有與SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的包含該基因的重組載體為pGEX-KG-SIRF1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的包含該基因重組載體的重組株Ecoli BL21pLysS pGEX-KG-SIRF1。
5.一種石斑魚性反轉(zhuǎn)基因的原核表達的融合蛋白，其特征在于用1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達重組株Ecoli BL21 pGEX-KG-SIRF1，25℃誘導(dǎo)9小時可獲得表達融合蛋白GST-SIRF1。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種石斑魚性反轉(zhuǎn)基因的原核表達的融合蛋白GST-SIRF1在石斑魚的生殖調(diào)控中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種石斑魚性反轉(zhuǎn)基因的原核表達的融合蛋白GST-SIRF1在石斑魚的性腺分化中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種石斑魚性反轉(zhuǎn)基因的原核表達的融合蛋白GST-SIRF1在石斑魚的性別逆轉(zhuǎn)中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種石斑魚性反轉(zhuǎn)基因的原核表達的融合蛋白GST-SIRF1在飼料制備人工餌料中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種石斑魚性反轉(zhuǎn)基因的原核表達的融合蛋白GST-SIRF1在石斑魚的繁殖和人工控制性別中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種石斑魚性反轉(zhuǎn)相關(guān)基因序列、含有該基因的載體和重組株及其用途，該基因cDNA長608bp，有一個252bp(54－305)的開放閱讀框，編碼83個氨基酸，5’非編碼區(qū)長53bp，起始于一個包含在脊椎動物起始密碼子ANNATG基元；3’非編碼區(qū)長303bp，有多聚腺苷酸加尾信號(AAUAAA)和多聚腺苷酸尾巴。含有該基因的載體、重組株和原核表達的融合蛋白在石斑魚的生殖調(diào)控、性腺分化和性別逆轉(zhuǎn)及在飼料添加制備人工餌料以增強石斑魚的繁殖和人工控制性別中的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/12GK1640891SQ20041001263
公開日2005年7月20日 申請日期2004年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月8日
發(fā)明者汪洋, 周莉, 桂建芳 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所