專利名稱：柑橘防腐保鮮生防菌34－9，含有該菌的菌劑及發(fā)酵工藝與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于果蔬貯藏保鮮技術領域，具體地說涉及一種用于果品蔬菜特別是柑橘防腐保鮮生防菌34-9的分離篩選，含有該菌的菌劑以及該菌劑的發(fā)酵工藝與應用。
背景技術：
2001年我國柑橘面積已達132萬公頃、年產量達1160.7萬噸，面積居世界第一位，產量居世界第三位，是僅次于巴西和美國的第三大柑橘主產國。我國柑橘的成熟期主要集中在每年的9-12月，大量的柑橘果品除供應市場外需要進行貯藏保鮮。
柑橘安全防腐保鮮直接關系到我國柑橘業(yè)的內、外貿易的發(fā)展和增加橘農的收入的一個十分迫切的問題。目前柑橘貯藏中的病害主要是青霉病、綠霉病、褐腐病和蒂腐病等常見貯藏病害。目前比較肯定的效果仍以化學藥劑保鮮為主，公認多菌靈和2，4-D的組合藥劑效果最好，但是化學保鮮劑對人體健康影響和對環(huán)境的污染是一個不爭的事實，生產上急需研制一種既有良好的保鮮效果，又盡可能地減少污染的保鮮劑(鄧伯勛著，柑橘果品貯藏保鮮技術，中國農業(yè)科技出版社，1992年，北京；鄧伯勛主編，園藝產品貯藏運銷學(面向二十一世紀課程教材)，中國農業(yè)出版社，2002年，北京)。針對柑桔及其果品保鮮的安全問題，我國農業(yè)部在2001年就頒布了無公害柑桔食品的行業(yè)標準-NY5014-2001，對柑橘等果品的安全生產進行了嚴格的技術規(guī)范。
應用生防菌中的抗生菌抑制柑橘的貯藏病害國內外已有一些報道，例如已故的知名園藝學家章文才教授在上世紀七十年代初就提出了應用“5406”生防菌(一種真菌)V14抗生菌懸浮液防治柑橘黑腐病，經1972-1974年試驗證明，V14抗生菌懸浮液對于柑橘黑腐病有顯著的抑制作用(見華中農學院宜昌分院果樹專業(yè)編著，柑橘-生產技術與科學實驗，科學出版社，1977年，北京)。經檢索，在現有的專利和非專利文獻中沒有一篇涉及本發(fā)明主題的文獻報道。申請人檢索到專利申請?zhí)枮?1109245.9“一種防治果蔬采后軟腐病的生物防治拮抗菌(BAY-1)及技術使用方法”和申請?zhí)枮?11118646.1“一種防治果樹采后青霉和灰霉等主要病害的生物防治拮抗菌(BAY-2)及技術使用方法”，發(fā)明人分別從桃果實的傷口上分離得到一種BAY-1拮抗菌株和一種BAY-2拮抗菌株，屬于酵母類真菌，據稱能夠對桃軟腐病、蘋果青霉病和蘋果灰霉病有一定的保鮮效果。該發(fā)明的主題與本發(fā)明的主題明顯不同，同時該專利申請公開不充分(例如用于專利程序的菌株未送交保藏，詳細的制備方法也未完全公開)，從而使本領域的技術人員難以實施。

發(fā)明內容
本發(fā)明的第一個目的是克服現有技術存在缺陷，從自然環(huán)境中分離篩選出一株對柑橘青、綠霉病菌有特異抑制能力的酵母菌株；本發(fā)明的第二個目的是采用含有該菌株和輔助成分制備用于果蔬保鮮的生物保鮮劑；第三個目的是研制制備該生物保鮮劑方法；第四個目的是該生物保鮮劑在果品或蔬菜上的應用，以克服目前化學保鮮劑對果品和蔬菜的污染，或者現有生防菌針對性不強，以提高果品和蔬菜的保鮮效果，并提高對柑橘青霉病和綠霉病抑制的特異性。
本發(fā)明通過以下技術方案實現一種用于果蔬防腐保鮮的和對柑橘青霉病(Penicillium italium Wehmer)、綠霉病(Penicillium digitalum Sace)有抑制能力的生防菌為林德納克勒克酵母(Kloecheralindneri)34-9，保藏在CCTCC NO.M204025。
一種用于果蔬防腐保鮮的生防菌菌劑，其特征在于，1)含有對柑橘青霉病(Penicillium italium Wehmer)、綠霉病(Penicilliumdigitalum Sace)有抑制能力的生防菌為林德納克勒克酵母(Kloechera lindneri)34-9，保藏在CCTCC NO.M204025；2)將該生防菌制備成液體菌劑或者固體菌劑；3)所述的液體菌劑可以是不濃縮的或濃縮的；4)所述的液體菌劑中加入或不加入乳化劑，所述的乳化劑為1-3％農乳100；5)所述的固體菌劑是干酵母、壓榨酵母或酵母乳。
一種用于果蔬防腐保鮮的生防菌劑的制備方法，其中的液體菌劑的制備包括下列步驟1)斜面試管菌種的培養(yǎng)將保藏的34-9菌株接種于按常規(guī)方法滅菌的20％豆芽汁、5％葡萄糖、2％瓊脂配制的斜面固體培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基的pH自然，在25℃條件下培養(yǎng)4-5d，使其活化即為斜面菌種；2)液體試管培養(yǎng)將步驟1)制備的斜面菌株接種于按常規(guī)方法滅菌的并加有20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液體培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基的pH自然，在25℃條件下培養(yǎng)1-2d，即為試管菌種，然后接入三角瓶進行擴大培養(yǎng)；3)三角瓶培養(yǎng)將步驟2)的試管菌種接種于按常規(guī)方法滅菌的20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的三角瓶液體培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基的pH自然，在25℃條件下培養(yǎng)24-30小時，即為三角瓶菌種，然后接入玻璃瓶培養(yǎng)；4)玻璃瓶或卡氏罐培養(yǎng)。配制20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液體培養(yǎng)基，分裝入10L細口玻璃瓶(或卡氏罐)中，該培養(yǎng)基的pH自然，將該玻璃瓶或卡氏罐在100℃蒸煮1小時以上滅菌，冷卻后加入亞硫酸鹽最好是亞硫酸鈉，使二氧化硫含量達80mg/L，4-8小時后接種步驟3)的所述的三角瓶菌種，搖勻，于20-25℃條件下培養(yǎng)2-3天(d)，培養(yǎng)期間需搖動數次，增加其通氣，然后接入培養(yǎng)罐培養(yǎng)；5)發(fā)酵罐培養(yǎng)將200-300L帶蓋木桶或不銹鋼罐用常規(guī)的硫磺煙熏蒸殺菌，按所述木桶或不銹鋼罐容積的80％加入100-150mg/L亞硫酸鹽，最好是亞硫酸鈉、過4小時后加入20％豆芽汁、5％葡萄糖和水配制的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的pH自然，搖勻，靜置過夜，吸取上清液至另一桶中，剩余菌液放棄；再在裝有添加20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液體培養(yǎng)基接種步驟4)的菌液，在25℃條件下培養(yǎng)，每天用酒精消毒的木耙攪動1-2次，加速酵母生長繁殖，2-3天，取其中2/3菌液作為配制商業(yè)液體菌劑的母液；留下1/3的菌液作為種子液循環(huán)使用，將該種子液轉接于加有20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)基的pH自然，即成為下一次使用的用于配制商業(yè)液體菌劑的母液，循環(huán)該制備步驟；6)在步驟5)的母液中加入乳化劑所述的乳化劑為1-3％農乳100(江蘇省海安石油化工廠生產)即為商業(yè)液體菌劑產品。
在本發(fā)明中，34-9菌劑可以通過固體發(fā)酵工藝進行制備，其具體步驟是一種制備用于果蔬防腐保鮮的生防菌劑的制備方法，其中固體菌劑的制備包括下列步驟1)斜面試管菌種的培養(yǎng)將保藏的34-9菌株接種于按常規(guī)方法滅菌的20％豆芽汁、5％葡萄糖、2％瓊脂配制的斜面固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基的pH自然，在25℃條件下培養(yǎng)4-5天，使其活化即成為斜面菌種；2)菌種液體試管培養(yǎng)將步驟1)制備的斜面菌株接種于按常規(guī)方法滅菌的并加有20％豆芽汁和5％葡萄糖配制的液體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基的pH自然，在25℃條件下培養(yǎng)1-2d，即為試管菌種，然后接入三角瓶進行擴大培養(yǎng)；3)菌種的三角瓶培養(yǎng)將步驟2)的試管菌種接種于按常規(guī)方法滅菌的20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的三角瓶液體培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基的pH自然，在25℃條件下培養(yǎng)24-30小時，即為三角瓶菌種，然后接入玻璃瓶培養(yǎng)；4)制作罐頭瓶固體菌種按重量百分比稱取20％的豆芽汁作基本培養(yǎng)基，加5％的葡萄糖，再添加1-5％膨潤土，3-5％麥麩，補充適量的水，水的添加量以手捏培養(yǎng)基成團，松開后培養(yǎng)基立即分散的含水量即可；然后分裝于普通玻璃罐頭瓶，瓶口用紙和橡皮筋封口，在0.1Mpa下滅菌30min，冷卻10min后接種上述步驟3)制備的三角瓶液體菌種，28℃培養(yǎng)48小時，使之成為罐頭瓶固體菌種；5)將步驟4)的固體菌種接種到如步驟4)培養(yǎng)基成分相同的發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度控制在25-28℃，發(fā)酵48小時，即為固體菌劑；
6)在45-50℃下將步驟5)的的菌劑烘干，粉碎。
含有林德納克勒克酵母(Kloechera lindneri)34-9，CCTCC NO.M204025的菌劑，其特征在于該菌劑在柑橘和番茄上的應用。
一、菌株的分離、篩選如附圖1所示，本發(fā)明的菌株的分離、篩選和鑒定參照《微生物學實驗手冊》、《酵母菌的特征與鑒定手冊》、《微生物實驗技術教程》和《真菌鑒定手冊》，菌株34-9是從中國湖北省宜昌、湖南省石門和江西省新干等柑橘集中產區(qū)的橘園土壤和柑橘果實表面的混合菌中分離得到384個候選菌，在選擇其中的酵母菌進行分離、純化，在培養(yǎng)基上作拮抗實驗，得到34-9的酵母菌的初選株，再經過抗生素、拮抗接種(果實表面)和貯藏保鮮實驗，得到編號為34-9酵母菌，經鑒定34-9菌株為林德納克勒克酵母菌(Kloecheralindneri)，該菌對柑橘青、綠霉病菌有明顯的抑制作用，其最顯著的特點是菌株不產生抗生素，用于果蔬保鮮安全、無毒，本發(fā)明的詳細技術內容將由實施例給出。
二、34-9菌株的保藏按《微生物學實驗技術手冊》操作。
三、34-9的菌株的菌學特征34-9菌株菌體大小為0.6-1.4×0.5-1.0um，細胞卵圓形或檸檬形，細胞極性出芽，兩端芽殖、很少有假菌絲，液無環(huán)，無子囊孢子。在豆芽汁葡萄糖瓊脂平板上形成的菌落黃白色、邊緣波狀、表面隆起、有光澤。發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵蔗糖、麥芽糖、半乳糖、乳糖、蜜二糖和棉子糖；碳源同化葡萄糖、纖維二糖，不同化蔗糖、麥芽糖、半乳糖、乳糖、蜜二糖和棉子糖等；氮源同化硫酸銨，不同化硝酸鉀；醇類都為陰性；37℃不生長；在無維生素培養(yǎng)基上呈陰性；不產生淀粉；在50％和60％的葡萄糖培養(yǎng)基上不生長。
34-9菌株在分類學上屬于林德納克勒克酵母(Kloechera lindneri)，該菌株保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為NO.M204025，保藏日期2004年3月18日，用于商業(yè)貯藏保鮮的固體34-9菌劑至少含有林德納克勒克酵母活菌40-100億個/克，液體菌劑含有酵母活菌10-100億個/毫升。本發(fā)明的固體菌劑和液體菌劑可以在采收后的柑橘果品上以浸泡方式處理，也可以在柑橘采收前15天噴灑。使用時以適量自來水將含有酵母菌34-9菌劑活化2-3小時后，采前應用的使用濃度為1010加水全果面均勻噴灑(因菌液的活菌數量的不同，稀釋菌劑時添加適量的水，采前菌劑使用樹上果實的噴霧濃度最好高于采后的果實的浸泡處理的濃度。采后應用的使用濃度以108菌劑浸泡果實(因菌液的活菌數量每一批次有所不同，稀釋菌劑時根據最終要求的酵母菌的活菌數適當添加水)。貯藏設施、條件緩和日常管理按照華中農學院宜昌分院果樹專業(yè)編著《柑橘-生產技術與科學實驗》，科學出版社，1977年版執(zhí)行。
與已有技術相比本發(fā)明的積極效果是
1、本發(fā)明菌劑酵母菌34-9對柑橘青霉病和綠霉病病菌有明顯的抑制作用，初步實驗表明本發(fā)明的菌劑對采前或采后柑橘果實的柑橘青霉病和綠霉病的防病率(以好果率計)達到90％以上，對采前或采后的臍橙、番茄果實的病害的抑制也有較好效果。
2、本發(fā)明酵母菌34-9菌株不產生抗生素，因而作為一種新的生防菌在果品和蔬菜保鮮上應用將更加安全、無毒。


圖1是本發(fā)明總體技術路線圖。
圖2是本發(fā)明的固體發(fā)酵工藝流程圖。
圖3從樣品中分離篩選的酵母菌(在試管斜面上劃線貯藏備用)的狀況圖。
圖4在綠霉菌濃度為105個/ml培養(yǎng)皿中，酵母菌34-9與柑橘綠霉菌之間拮抗后的抑菌圈的大小，顯示34-9能夠明顯地抑制柑橘綠霉病菌的發(fā)生。
圖5106cfu/ml的酵母菌34-9對105spores/ml的青霉病菌的抑制效果，圖中顯示在整個培養(yǎng)皿中只生長酵母，不生長柑橘青霉病菌；圖6200mg/L的多菌靈抑制柑橘青霉(105spores/ml)的效果，圖中顯示在整個培養(yǎng)皿中不生長柑橘青霉病菌；圖7在同樣的針刺接種和培養(yǎng)條件下，本發(fā)明的菌株在柑橘表面抑制青霉病病菌的比較圖上為只接種柑橘青霉菌 圖下為接種酵母菌34-9，再接種青霉菌；圖8在培養(yǎng)皿上接種酵母菌34-9顯示不產生抗生素的情況，圖左30mg/L制霉菌素接種后的效果；圖右用酵母菌34-9離心后的上清液接種后的效果。
圖9、用本發(fā)明的生物保鮮劑噴灑在柑橘果實7天后在果實表面數量分布情況。
圖10用本發(fā)明的菌劑處理溫州蜜柑果實的防腐效果，圖示狀況表明，用本發(fā)明的菌劑處理溫州蜜柑果實，然后用薄膜單果包裝與未薄膜單果包裝的防腐效果相當。
具體實施例方式
實施例1菌株的分離、鑒定與篩選1、分離培養(yǎng)基的制備(1)豆芽汁培養(yǎng)基制備按重量計稱取黃豆芽500g，加水2500mL，煮沸0.5h，過濾后補足水分至2500mL，在0.1Mpa濕熱滅菌后存放備用，即為20％的豆芽汁。用于酵母菌34-9培養(yǎng)培養(yǎng)基配比20％豆芽汁200g、葡萄糖50g、水1000mL，自然PH；用于對照處理即柑橘青霉菌和綠霉菌的培養(yǎng)基配比20％豆芽汁200g，蔗糖50g，水1000mL，培養(yǎng)基PH自然。
2、分離方法(稀釋平板法)。
2.1樣品稀釋液的制備用1ml無菌吸管吸取富集培養(yǎng)液1ml，放入裝有9ml無菌水的試管中，振蕩混勻即成10-1稀釋液；再用1ml無菌吸管吸取10-1稀釋液1ml放入裝有9ml無菌水的試管中，吹吸三次，讓菌液混勻，即成10-2稀釋液；再換一支無菌吸管吸取10-2稀釋液1ml放入裝有9ml無菌水的試管中，吹吸三次，讓菌液混勻，即成10-3稀釋液；以次類推，每次一定要更換吸管，連續(xù)稀釋至10-4、10-5、10-6、10-7稀釋度。
2.2平板接種培養(yǎng)采用涂抹平板法；先將培養(yǎng)基融化后趁熱倒入無菌培養(yǎng)皿中，待凝固后編號，然后用無菌吸管吸取0.1ml菌液對號接種在不同稀釋度編號的瓊脂平板上(每個編號設三個重復)。再用無菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻。再每次涂抹前將刮鏟灼燒滅菌。將涂抹好的平板平放于桌上20-30分鐘，使菌液滲透于培養(yǎng)基內，然后將平板倒轉，保溫培養(yǎng)2-3天。
3、挑菌純化從培養(yǎng)過的平板中選取分離較好的酵母菌菌落轉接斜面。酵母菌落與細菌相仿，一般都有濕潤，較光滑，有一定的透明度，容易挑起等特點。酵母菌菌落的顏色比較單調，多數都呈乳白色，少數為紅色，個別為黑色。酵母菌菌落一般還會散發(fā)出一股悅人的酒香味。
4、菌株篩選4.1酵母菌與病菌之間拮抗、嗜殺作用測定采用移塊畫線法測定，評價酵母菌對柑橘貯藏主要病害青霉病Penicillum ItalicumWehmer.)綠霉病(Penicillum digitalum Sace.)的防治效果和作用，以及酵母菌與病菌之間的相互作用。試驗設計為初步用所分離的酵母菌以不同濃度的酵母菌與病菌之間和不同種類的酵母菌的組合與病菌之間的拮抗、嗜殺作用、初篩，然后對有拮抗作用的酵母菌進行鑒定、實驗。
4.2有益微生物效價的測定采用管碟法或瓊脂移塊法，評價有益微生物的遺傳性，競爭生長能力，逆境條件下的生存能力，以及柑橘果實貯藏病原菌的有效程度。
5、酵母菌的鑒定結合菌株的形態(tài)學特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征，參考《微生物學實驗手冊》、《酵母菌的特征與鑒定手冊》、《微生物實驗技術教程》和《真菌鑒定手冊》等文獻，將酵母菌鑒定到種。鑒定本發(fā)明的菌株34-9為林德納克勒克酵母(Kloechera lindneri)。
林德納克勒克酵母(Kloechera lindneri)34-9菌株的保藏培養(yǎng)基為豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基豆芽500g，葡萄糖125g，水2500ml，瓊脂50g，培養(yǎng)基pH自然。
分析、比較表明，酵母菌34-9菌株是一株在柑橘病害的生物防治方面具有重要應用價值的酵母菌，特別是對柑橘青、綠霉病菌有明顯的拮抗能力和抑制作用。其效果如圖2、圖3、圖4、圖5所示。實驗表明，在適宜的溫度和通氣條件下，該菌對柑橘青霉病和綠霉病有明顯的抑制效果。
實施例2 34--9菌劑的固體發(fā)酵工藝1、菌種的斜面試管培養(yǎng)、液體試管培養(yǎng)和三角瓶培養(yǎng)按照上述的發(fā)明步驟進行；2.罐頭瓶固體菌種擴大培養(yǎng)基本培養(yǎng)基為20kg豆芽汁，再添加膨潤土10kg，麥麩3kg、葡萄糖5kg，pH自然，(在另外的實施例中膨潤土、麥麩葡萄糖的實際添加量可按照本發(fā)明前面所述的比例范圍內加入)，水100L，調料拌勻后將培培養(yǎng)基分裝于160個罐頭瓶中，28℃培養(yǎng)48小時。
3.固體高密度發(fā)酵生產在攪拌機中按以下配方調好料，培養(yǎng)基配比豆芽汁200kg、膨潤土100kg、麥麩30kg、葡萄糖50kg、水1000kg，pH自然。將培養(yǎng)基輸送到滅菌池中滅菌，冷至28℃接種罐頭瓶固體菌種，按固體發(fā)酵工藝發(fā)酵，通無菌風，控制溫度在25-28℃，48小時發(fā)酵完成，即為固體菌劑，在45-50℃條件下烘干，粉碎，檢驗，包裝即為固體菌劑產品。
實施例334-9液體菌劑的發(fā)酵工藝1)斜面試管菌種的培養(yǎng)將保藏的34-9菌株接種于按常規(guī)方法滅菌的20％豆芽汁、5％葡萄糖、2％瓊脂配制的斜面固體培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基的pH自然，在25℃條件下培養(yǎng)4-5d，使其活化即為斜面菌種；2)液體試管菌種培養(yǎng)將步驟1)制備的斜面種株接種于按常規(guī)方法滅菌的并加有20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液體培養(yǎng)基(pH自然)上，在25℃條件下培養(yǎng)1-2d，即為試管菌種，然后接入三角瓶進行擴大培養(yǎng)；3)三角瓶菌種培養(yǎng)將步驟2)的試管菌種接種于按常規(guī)方法滅菌的20％豆芽汁、5％葡萄糖和水配制的三角瓶液體培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基的pH自然，在25℃條件下培養(yǎng)24-30小時，即為三角瓶菌種，然后接入玻璃瓶培養(yǎng)；4)菌種的玻璃瓶或卡氏罐培養(yǎng)。配制20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液體培養(yǎng)基，分裝入10L細口玻璃瓶(或卡氏罐)中，該培養(yǎng)基的pH自然，將該玻璃瓶或卡氏罐在100℃蒸煮1小時以上滅菌，冷卻后加入亞硫酸鹽最好是亞硫酸鈉，使二氧化硫含量達80mg/L，4-8小時后接種步驟3)的所述的三角瓶菌種，搖勻，于20-25℃條件下培養(yǎng)2-3d，培養(yǎng)期間需搖動數次，增加其通氣，然后接入培養(yǎng)罐培養(yǎng)；5)發(fā)酵罐培養(yǎng)將200-300L帶蓋木桶或不銹鋼罐用常規(guī)的硫磺煙熏蒸殺菌，按所述木桶或不銹鋼罐容積的80％加入100-150mg/L亞硫酸鹽，最好是亞硫酸鈉、過4小時后加入20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的pH自然，搖勻，靜置過夜，吸取上清液至另一桶中，剩余菌液放棄；再在裝有添加20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液體培養(yǎng)基接種步驟4)的菌液，在25℃條件下培養(yǎng)，每天用酒精消毒的木耙攪動1-2次，加速酵母生長繁殖，2-3天，取其中2/3菌液作為配制商業(yè)液體菌劑的母液；留下1/3的菌液作為種子液循環(huán)使用，將該種子液轉接于加有20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液體培養(yǎng)基繼作為種子液循環(huán)使用，將該種子液轉接于加有20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)基的pH自然，即成為下一次使用的用于配制商業(yè)液體菌劑的母液，循環(huán)該制備步驟；6)在步驟5)的母液中加入乳化劑即1-3％農乳100(中國江蘇省海安石油化工廠生產)即為商業(yè)液體菌劑成品。
實施例434-9菌劑在柑橘果實貯藏中的應用為了驗證酵母菌34-9菌劑對柑橘果實防腐保鮮的效果，申請人于2001-2004年度柑橘果實成熟季節(jié)，應用本發(fā)明的菌劑分別在湖北省武漢市、宜昌市、丹江口市、巴東縣和江西省新干縣等柑橘集中產區(qū)連續(xù)兩年進行了34-9菌劑的保鮮柑橘果品的實驗。貯藏保鮮的品種為無核溫州蜜柑和臍橙。其中溫州蜜柑為市場銷量最大的寬皮類柑橘，易剝皮，采后果實易感染柑橘青霉病和柑橘綠霉病，是常用的貯藏實驗品種，且實驗效果易于評價。臍橙是國際市場銷售的王牌水果，經濟價值極高，作為本發(fā)明的應用對象也是十分有價值的。
所用的酵母菌34-9液體菌劑為含酵母菌活菌數10-100億cfu/ml。實驗設每處理3箱(每箱20公斤，約160個果實)，重復處理三次，設對照1為不處理(空白)，對照2為“多菌靈”(中國江蘇省無錫農藥廠生產)藥劑處理，分別記作CK1和CK2。在柑橘基本成熟期采果，剛采下的果實及時用34-9菌液(濃度如上所述含酵母菌活菌數10-100億cfu/ml)浸果，將果實晾干，1-2天后將處理過的果實用聚乙烯薄膜單果包裝，置于紙箱內，紙箱外覆聚乙烯薄膜，貯藏室為自然室溫(貯藏室消毒和管理參照《柑橘-生產技術與科學實驗》，科學出版社，1977年版)，試驗貯藏周期定為100天。從柑橘果實處理后入庫開始，每天記錄、觀察柑橘果實感病(重點是柑橘青霉病和綠霉病)的發(fā)生時間和狀況。將上述的液體菌劑(含酵母菌活菌數10-100億cfu/ml)先用少量自來水活化2-3小時，之后將菌液稀釋至1000倍，按上面的方法浸泡果實和日常管理。如果應用34-9固體菌劑，依照上述方法在固體兌水后的浸泡洗果菌液中的保持酵母菌活菌數10-100億cfu/ml范圍即可。
表1生防菌34-9液體菌劑及相關處理采后溫州蜜柑貯藏試驗設計1

試驗品種為溫州蜜柑，采收后立即處理。
表2生防菌34-9固體菌劑和藥劑對不同產區(qū)采后溫州蜜柑貯藏試驗設計2

試驗地點為湖北宜昌、丹江口、巴東和江西新干柑橘產區(qū)，貯藏品種為采收后立即處理的溫州蜜柑果實。
表3柑橘果實感染柑橘青霉菌和綠霉病的情況處理即濃度 柑橘青霉菌柑橘綠霉菌其他的病害感染率(％)感染率(％)感染率(％)34-9(108CFU/ml) 5.3bc 4.0bc 12.7b34-9(106CFU/ml) 6.0bc 2.7bc 10.0b多菌靈 16.0b 10.0b 14.0bControl50.0a 40.0a 31.3a貯藏期為100天時記載的數據。
3、表面酵母菌的數量的測定柑橘果面施用含有本發(fā)明菌株34-9的菌劑后，立即開始測定柑橘果實表面的酵母菌的數量，以后每隔2天再測定一次，結果表明用本發(fā)明的34-9菌劑處理的柑橘果實上林德納克勒克酵母的數量在105-107cfu/ml的范圍內波動，剛剛開始時候數量很高。達到1010cfu/ml，大約10多天后數量維持在105-107cfu/ml的范圍內。測定結果如圖9所示。
4、貯藏后柑橘果實中的可溶性固形物、檸檬酸和維生素C的測定柑橘果實可溶性固性物測定采用用折光法；檸檬酸測定采用滴定法，維生素C的測定采用2，6二氯靛酚滴定法，參照華中農學院宜昌分院果樹專業(yè)編著《柑橘-生產技術與科學實驗》，科學出版社，1977年版)進行，測定結果如表4所示表4應用生防菌34-9對溫州蜜柑貯藏后的主要理化指標的影響可溶性 檸檬酸 維生素C處理 固形物 (mg/100ml(％)(％)果汁)0d 50d 100d0d 50d 100d0d 50d 100d1 10.610.211.00.540.540.4036.g32.3 32.72 10.610.810.40.540.490.3736.833.6 32.93 10.610.611.00.540.510.4536.842.7 41.64 10.610.310.30.540.560.5336.832.8 31.45 10.610.512.00.540.530.5236.833.0 32.4
6 10.610.610.50.540.510.4836.835.3 33.41010.610.410.30.540.530.2936.834.9 33.4CK10.610.210.20.540.520.4236.835.5 34.7CK為清水。
實驗表明，應用34-9菌劑處理柑橘后貯藏后的溫州蜜柑果實中的可溶性固形物基本上沒有什么變化，可溶性固形物在10.2％-12.0％之間變化，與對照沒有差異。此外在檸檬酸和維生素C的等技術指標方面的變化與對照也沒有差異。
表5應用34-9菌劑對溫州蜜柑貯藏果實感官指標的影響處理新鮮度 評分 色澤 評分 質地 評分風味評分 總分1 新鮮6.85 橙黃 6.46 脆嫩 5.56甜酸適 6.38 25.25度2 新鮮6.64 橙黃 6.36 脆嫩 5.32甜酸適 6.42 24.74度3 新鮮6.32 橙黃 6.87 脆嫩 5.24甜酸適 6.25 24.68度3 新鮮6.32 橙黃 6.55 脆嫩 5.71甜酸適 6.36 24.94度4 新鮮6.22 橙黃 6.39 脆嫩 5.26味淡5.87 23.745 新鮮6.21 橙黃 6.46 脆嫩 5.44甜酸適 6.41 24.52度6 新鮮6.63 橙黃 6.35 脆嫩 5.48甜酸適 6.43 24.89度CK 較新鮮 5.87 橙黃 6.22 脆嫩 5.28甜酸不 6.35 23.72適6、貯藏100天后溫州蜜柑主要貯藏病害的發(fā)生的情況表6應用34-9生防菌對溫州蜜柑貯藏中主要病害的影響處理腐爛率柑橘青霉病(％)及發(fā)病時間 柑橘綠霉病(％)及發(fā)病時間 其他病害1 3.33病2002-12-24 0 10.002 3.332002-12-260 16.673 3.332002-12-120 16.674 6.672002-11-303.332002-12-1320.005 6.672002-11-223.332002-12-3 26.676 6.672002-10-313.332002-11-2626.6720 6.672002-12-226.672002-12-2326.67CK 10.00 2002-11-206.672002-11-2020.00
此外，34-9生防菌還可以在柑橘果實成熟前15天左右進行噴灑果實，噴灑劑的使用濃度要大于果實浸泡處理的濃度，使用濃度參見前面的描述。此外，申請人曾在采后番茄上進行過初步保鮮實驗，表明34-9菌劑對番茄的防腐保鮮也有較好的效果。對于果皮緊密的臍橙的初步實驗也表明，34-9生防菌菌劑對于臍橙防腐保鮮效果明顯優(yōu)于溫州蜜柑果實的貯藏效果。
權利要求
1.一種用于果蔬防腐保鮮的和對柑橘青霉病(Penicillium italiumWehmer)、綠霉病(Penicillium digitalum Sace)有抑制作用的生防菌，其特征在于該菌為林德納克勒克酵母(Kloechera lindneri)34-9，CCTCCNO.M204025。
2.一種用于果蔬防腐保鮮的生防菌菌劑，其特征在于，1)含有對柑橘青霉病(Penicillium italium Wehmer)、綠霉病(Penicilliumdigitalum Sace)有抑制作用的生防菌林德納克勒克酵母(Kloechera lindneri)34-9，CCTCC NO.M204025；2)將該生防菌制備成液體菌劑或者固體菌劑；3)所述的液體菌劑可以是不濃縮的或濃縮的；4)所述的液體菌劑中加入或不加入乳化劑，所述的乳化劑為1-3％農乳100；5)所述的固體菌劑是干酵母、壓榨酵母或酵母乳。
3.一種用于果蔬防腐保鮮的生防菌菌劑的制備方法，按照以下步驟制備1)斜面試管菌種的培養(yǎng)將保藏的34-9菌株接種于按常規(guī)方法滅菌的20％豆芽汁、5％葡萄糖、2％瓊脂配制的斜面固體培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基的pH自然，在25℃條件下培養(yǎng)4-5d，使其活化即為斜面菌種；2)液體試管培養(yǎng)將步驟1)制備的斜面菌株接種于按常規(guī)方法滅菌的并加有20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基pH自然，在25℃條件下培養(yǎng)1-2d，即為試管菌種，然后接入三角瓶進行擴大培養(yǎng)；3)三角瓶培養(yǎng)將步驟2)的試管菌種接種于按常規(guī)方法滅菌的20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的三角瓶液體培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基的pH自然，在25℃條件下培養(yǎng)24-30小時，即為三角瓶菌種，然后接入玻璃瓶培養(yǎng)；4)玻璃瓶或卡氏罐培養(yǎng)配制20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液體培養(yǎng)基，分裝入10L細口玻璃瓶(或卡氏罐)中，該培養(yǎng)基的pH自然，將該玻璃瓶或卡氏罐在100℃蒸煮1小時以上滅菌，冷卻后加入亞硫酸鹽最好是亞硫酸鈉，使二氧化硫含量達80mg/L，4-8小時后接種步驟3)的所述的三角瓶菌種，搖勻，于20-25℃條件下培養(yǎng)2-3d，培養(yǎng)期間需搖動數次，增加其通氣，然后接入培養(yǎng)罐培養(yǎng)；5)發(fā)酵罐培養(yǎng)將200-300L帶蓋木桶或不銹鋼罐用常規(guī)的硫磺煙熏蒸殺菌，按所述木桶或不銹鋼罐容積的80％加入100-150mg/L亞硫酸鹽，最好是亞硫酸鈉、過4小時后加入20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的pH自然，搖勻，靜置過夜，吸取上清液至另一桶中，剩余菌液放棄；再在裝有添加20％豆芽汁、5％葡萄糖和水配制的液體培養(yǎng)基接種步驟4)的菌液，在25℃條件下培養(yǎng)，每天用酒精消毒的木耙攪動1-2次，加速酵母生長繁殖，2-3天，取其中2/3菌液作為配制商業(yè)液體菌劑的母液；留下1/3的菌液作為種子液循環(huán)使用，將該種子液轉接于加有20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)基的pH自然，即成為下一次使用的用于配制商業(yè)液體菌劑的母液，循環(huán)該制備步驟；6)在步驟5)的母液中加入或不加入乳化劑1-3％農乳100即為液體菌劑產品。
4.根據權利要求2或3所述的制備方法，按照以下步驟制備1)斜面試管菌種的培養(yǎng)將保藏的34-9菌株接種于按常規(guī)方法滅菌的20％豆芽汁、5％葡萄糖、2％瓊脂配制的斜面固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基的pH自然，在25℃條件下培養(yǎng)4-5天，使其活化即成為斜面菌種；2)菌種液體試管培養(yǎng)將步驟1)制備的斜面菌株接種于按常規(guī)方法滅菌的并加有20％豆芽汁和5％葡萄糖配制的液體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基的pH自然，在25℃條件下培養(yǎng)1-2d，即為試管菌種，然后接入三角瓶進行擴大培養(yǎng)；3)菌種的三角瓶培養(yǎng)將步驟2)的試管菌種接種于按常規(guī)方法滅菌的20％豆芽汁、5％葡萄糖配制的三角瓶液體培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基的pH自然，在25℃條件下培養(yǎng)24-30小時，即為三角瓶菌種，然后接入玻璃瓶培養(yǎng)；4)制作罐頭瓶固體菌種按重量百分比稱取20％的豆芽汁作基本培養(yǎng)基，加5％的葡萄糖，再添加1-5％膨潤土、3-5％麥麩、加適量的水，水的添加量以手捏培養(yǎng)基成團，松開后培養(yǎng)基立即分散的含水量即可；然后分裝于普通玻璃罐頭瓶，瓶口用紙和橡皮筋封口，在0.1Mpa下滅菌30min，冷卻10min后接種上述步驟3)制備的三角瓶液體菌種，28℃培養(yǎng)48小時，使之成為罐頭瓶固體菌種；5)將步驟4)的固體菌種接種到如步驟4)培養(yǎng)基成分相同的發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度控制在25-28℃，發(fā)酵48小時，即為固體菌劑；6)在45-50℃下將步驟5)的菌劑烘干，粉碎。
5.含有林德納克勒克酵母(Kloechera lindneri)34-9，CCTCCNO.M204025的菌劑，其特征在于該菌劑在柑橘和番茄上的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于果蔬保鮮技術領域。公開了一種對柑橘青霉病和綠霉病有抑制作用的生防菌即酵母菌34－9的分離篩選，還涉及用該菌株制備的保鮮劑以及該保鮮劑的制備工藝，還包括該保鮮劑的應用。其特征在于，所述的菌株為林德納克勒克酵母(Kloechera lindneri)34－9，該菌株不產生抗生素。保藏在CCTCC，NO.M204025。其制備方法包括將所述的菌株先接種于種子培養(yǎng)基，再接種于擴大培養(yǎng)基，制備出所述的液體菌劑；或者將所述的菌株接種于固體種子培養(yǎng)基，然后再接種于罐頭瓶培養(yǎng)基，生產出含有該酵母菌的固體菌劑。本發(fā)明已在柑橘和番茄貯藏保鮮中推廣應用，柑橘經90天貯藏，好果率達90％以上。本發(fā)明減少了化學保鮮劑造成的污染，對人體無毒，是一種無公害的生物保鮮技術。
文檔編號C12N1/16GK1563349SQ200410012938
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月30日 優(yōu)先權日2004年3月30日
發(fā)明者鄧伯勛, 龍超安, 鄧秀新, 何秀娟, 何紹江, 武崢, 成協設, 史輝, 楊曉平 申請人:華中農業(yè)大學