專(zhuān)利名稱(chēng)：枯草芽孢桿菌株、制備方法,制劑、制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物的菌株，更具體的說(shuō)是屬于一種枯草芽孢桿菌的菌株。
背景技術(shù)：
為了對(duì)付病蟲(chóng)害，每年全世界要生產(chǎn)農(nóng)藥200多萬(wàn)噸，其中主要是化學(xué)農(nóng)藥。但是長(zhǎng)期使用某些化學(xué)農(nóng)藥，病蟲(chóng)、害蟲(chóng)容易產(chǎn)生抗藥性；而且一些化學(xué)農(nóng)藥品種已被證實(shí)有致癌、致畸和致突變的毒性；同時(shí)農(nóng)藥殘留是制約農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)的隱患。生物農(nóng)藥的最大優(yōu)點(diǎn)就是對(duì)人畜安全，無(wú)毒害，不污染環(huán)境，也不易產(chǎn)生抗性，日益成為發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)的唯一選擇。微生物農(nóng)藥是公認(rèn)的“無(wú)公害農(nóng)藥”，防治對(duì)象不易產(chǎn)生抗藥性，不傷害天敵；繁殖快，是綜合防治農(nóng)林病蟲(chóng)害的重要手段。隨著全球農(nóng)藥公害問(wèn)題的日趨嚴(yán)重，微生物農(nóng)藥的研究已經(jīng)倍受重視。枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生多種抑制植物病原真菌的抗菌物質(zhì)，抗菌物質(zhì)包括大分子量的抗菌蛋白和低分子量的抗菌肽，同時(shí)它又是自然界廣泛存在的非致病細(xì)菌，對(duì)人畜無(wú)害，不污染環(huán)境，因而在生物防治植物病害中起著重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種枯草芽孢桿菌株及該菌株的制備方法；利用該菌株的發(fā)酵液可以制成枯草芽孢桿菌株制劑，能夠抑制多種植物病原真菌和細(xì)菌生長(zhǎng)并對(duì)紅蜘蛛有殺滅作用；發(fā)酵液的活體和離體生測(cè)實(shí)驗(yàn)均表明其強(qiáng)烈的抑菌活性，是一種較好的生物農(nóng)藥；也可用于人類(lèi)疾病的治療。
本發(fā)明的技術(shù)方案為一株枯草芽孢桿菌株(Bacillus subtilis)，菌種保藏編號(hào)為1107。
一種枯草芽孢桿菌株的制備方法，是將從土壤中分離得到的菌枯草芽孢桿菌JA經(jīng)20keV，2.6×1015～3.9×1015ions/cm2，不同劑量的N+注入誘變處理篩選到高產(chǎn)高抗菌活性菌株JA026。
該菌株與原始出發(fā)菌株相比，抗菌活性增強(qiáng)，相對(duì)效價(jià)提高10.4％；發(fā)酵條件有所改變?nèi)缟L(zhǎng)周期縮短6～8hr、需氧量降低等。
所述的枯草芽孢桿菌株的制備方法，其特征是采用N+脈沖式輻照處理，樣品置于水冷的無(wú)菌靶臺(tái)上，將枯草芽孢桿菌株JA制成菌懸液，取0.1mL菌懸液鋪于Φ90mm的空白平皿中，于超凈臺(tái)中風(fēng)干制成菌膜備用；用不同劑量N+的輻照處理后將菌膜用1mL無(wú)菌水洗脫涂布于PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24hr后挑單菌落；將經(jīng)過(guò)離子束注入處理的，從培養(yǎng)24h的斜面挑一環(huán)細(xì)胞接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)后再接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)后，測(cè)效價(jià)，篩選高產(chǎn)菌株。
所述的枯草芽孢桿菌株的制備方法，其特征是種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)的最佳種齡12hr，再按接種量1∶10接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵液的pH值為7.2，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為333r/min，溫度為30℃，發(fā)酵時(shí)間為48hr。
所述的枯草芽孢桿菌株制劑，是菌枯草芽孢桿菌發(fā)酵后的混合液，并經(jīng)過(guò)超濾后的產(chǎn)物。
所述的枯草芽孢桿菌株制劑，其特征是菌枯草芽孢桿菌發(fā)酵后的混合液，并經(jīng)過(guò)截留分子量為1000D超濾膜的超濾物，并經(jīng)5000～7000r/min離心取上清液得到的濃縮液。
所述的枯草芽孢桿菌株制劑的制備方法，是將高產(chǎn)菌枯草芽孢桿菌株進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵工藝包括對(duì)斜面保存的枯草芽孢桿菌的高產(chǎn)菌株斜面活化；種瓶培養(yǎng)；發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵液高速離心除菌體并進(jìn)行熱處理。
所述的枯草芽孢桿菌株制劑的制備方法，其特征是斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基魚(yú)蛋白胨2％，甘油1％，K2HPO40.15％，MgSO40.15％，pH7.2，最佳種齡時(shí)間為12hr；發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，K2HPO40.15％，MgSO40.15％，最適pH值6.7～7.5，最適發(fā)酵周期為40hr～48hr，最適溫度28℃～30℃，離心轉(zhuǎn)速為8000r/min，熱處理溫度為108℃，10min。
所述的枯草芽孢桿菌株制劑的用途，是用于水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌、西瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌、黃瓜菌核病菌、黃瓜灰霉病菌等多種植物病原真菌的防治；對(duì)紅蜘蛛的防治；對(duì)煙草青枯病菌和番茄青枯病菌等植物致病細(xì)菌的防治；用于胃、肝、肺、大腸、腎、皮膚、食道等腫瘤的治療。用于病毒性疾病抗病毒的治療。
同時(shí)可用于治療人畜的由真菌引發(fā)的皮膚病(如腳氣等)，其中對(duì)紅色毛癬菌、須毛癬菌作用明顯；還可用作家畜的飼料添加劑，以預(yù)防黑曲霉、黃曲霉等真菌導(dǎo)致的飼料霉變；另外對(duì)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)不良影響，但對(duì)癌細(xì)胞株，部分病毒則有明顯殺傷作用。這預(yù)示抗菌肽在治療及預(yù)防癌癥和抗病毒方面具有良好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明從土壤中篩選并分離出對(duì)小麥赤霉病菌有強(qiáng)類(lèi)抑制作用的枯草芽孢桿菌JA作為原始菌株。
原始菌株的離子注入實(shí)驗(yàn)于低能離子束細(xì)胞修飾技術(shù)和裝置上進(jìn)行，采用N+脈沖式輻照處理，該裝置的專(zhuān)利號(hào)為93103361.6。
本發(fā)明對(duì)于制備的發(fā)酵液進(jìn)行了生測(cè)試驗(yàn)與穩(wěn)定性試驗(yàn)。
枯草芽孢桿菌株發(fā)酵液的離體生測(cè)試驗(yàn)用管碟法測(cè)定發(fā)酵液對(duì)不同檢測(cè)菌的抑菌活性牛津杯內(nèi)加入粗提液200L，以抑菌圈直徑表示抑菌活性的大?。换铙w生測(cè)試驗(yàn)在一葉期黃瓜幼苗上噴灑發(fā)酵液，待發(fā)酵液干后將黃瓜灰霉病菌(B.cinerea)和菌核病菌(S.sclerotiorum)的菌絲塊(厚0.1cm，直徑為0.4cm)直接貼在黃瓜葉面中央，處理后的試材置于21℃恒溫保濕箱中培養(yǎng)發(fā)病，5d后考察各處理的防治效果。該試驗(yàn)由上海生物農(nóng)藥所協(xié)助測(cè)定。離體生測(cè)結(jié)果表明發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌、西瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌，根霉病菌和辣椒炭疽病菌等多種植物病原真菌及煙草青枯病菌和番茄青枯病菌等植物致病細(xì)菌有明顯的防治作用；活體生測(cè)實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵液均有抑制黃瓜灰霉病菌和菌核病菌的作用，同時(shí)對(duì)紅蜘蛛有殺滅作用。
枯草芽孢桿菌株發(fā)酵液的濃縮制備和穩(wěn)定性試驗(yàn)發(fā)酵液離心除菌體和熱處理后，經(jīng)1000D濾膜超濾濃縮。熱穩(wěn)定性試驗(yàn)將粗提液分別經(jīng)108℃、115℃和121℃高壓滅菌處理，以經(jīng)孔徑為0.22m的微孔濾膜過(guò)濾的樣品作為對(duì)照，用管碟法測(cè)抑菌活性，對(duì)照的抑菌活性定為100％，結(jié)果表明粗提液經(jīng)108℃、115℃和121℃分別處理10min，其抑菌活性均沒(méi)有降低，即使121℃處理60min后抑菌活性也僅下降20％，說(shuō)明熱穩(wěn)定性較好；pH穩(wěn)定性試驗(yàn)通過(guò)直接調(diào)節(jié)粗提液的pH值考察環(huán)境酸堿度對(duì)抗菌物抑菌活性的影響，以未經(jīng)酸堿調(diào)節(jié)的粗提液(pH為7.0)作為對(duì)照，其抑菌活性定為100％，試驗(yàn)表明抗菌物的最適pH范圍是6.0～7.5；蛋白酶穩(wěn)定性37℃水溶條件下，用反應(yīng)濃度均為1mg/mL的蛋白酶K和胰蛋白酶處理粗提液不同時(shí)間，測(cè)酶處理液的抑菌活性，以不加酶處理的為對(duì)照，抑菌活性定為100％，結(jié)果粗提液用兩種蛋白酶處理不同時(shí)間后，抑菌活性降低不明顯，說(shuō)明粗提液對(duì)蛋白酶K、胰蛋白酶具有一定的耐受性。
本發(fā)明的產(chǎn)生菌的發(fā)酵工藝穩(wěn)定簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境無(wú)污染。
本發(fā)明的枯草芽孢桿菌株的抗菌活性、物質(zhì)熱穩(wěn)定性好，對(duì)酸堿和蛋白酶有一定的耐受性，在生物防治領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
1、從土壤中篩選并分離出對(duì)小麥赤霉病菌有強(qiáng)類(lèi)抑制作用的枯草芽孢桿菌JA作為原始菌株。
2、始菌株的離子注入實(shí)驗(yàn)于低能離子束細(xì)胞修飾技術(shù)和裝置上進(jìn)行，該裝置的專(zhuān)利號(hào)為93103361.6。采用N+脈沖式輻照處理，經(jīng)20keV，2.6×1015～3.9×1015ions/cm2，不同劑量的N+注入，其過(guò)程是樣品置于水冷的無(wú)菌靶臺(tái)上，將JA制成菌懸液，取0.1mL菌懸液鋪于Φ90mm的空白平皿中，于超凈臺(tái)中風(fēng)干制成菌膜備用；用不同劑量N+的輻照處理后，將菌膜用1mL無(wú)菌水洗脫于固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24hr后挑單菌落；將經(jīng)過(guò)離子束注入處理的，從培養(yǎng)24h的斜面挑一環(huán)細(xì)胞接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)12hr后按接種量1∶10接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵液的pH值為7.2，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為333r/min，溫度為30℃，培養(yǎng)48hr后，管碟法測(cè)效價(jià)，篩選高產(chǎn)菌株，得到本發(fā)明的枯草芽孢桿菌株JA026，現(xiàn)于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，菌種保藏編號(hào)為1107。
3、枯草芽孢桿菌株制劑的制備。是將本發(fā)明的高產(chǎn)菌枯草芽孢桿菌株(菌種保藏編號(hào)為1107)進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵工藝包括對(duì)斜面保存的枯草芽孢桿菌的高產(chǎn)菌株斜面活化；種瓶培養(yǎng)；發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵液高速離心除菌體并進(jìn)行熱處理。斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基魚(yú)蛋白胨2％，甘油1％，K2HPO40.15％，MgSO40.15％，pH7.2，最佳種齡時(shí)間為12小時(shí)；發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，K2HPO40.15％，MgSO40.15％，最適pH值6.7～7.5，最適發(fā)酵周期為40hr～48hr，最適溫度28℃～30℃，離心轉(zhuǎn)速為8000r/min，熱處理溫度為108℃，10min，得到發(fā)酵液。
上述得到的菌枯草芽孢桿菌發(fā)酵合液，并經(jīng)過(guò)截留分子量為1000D超濾膜的超濾物，并經(jīng)5000～7000r/min離心取上清液得到的濃縮液，即可以作為生物農(nóng)藥農(nóng)藥制劑。
對(duì)多種農(nóng)作物的病原菌有明顯的抑制作用，如小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌、黃瓜菌核、灰霉病菌、西瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌、番茄青枯病菌、煙草青枯病菌等，此外對(duì)紅蜘蛛有殺滅作用。
權(quán)利要求
1.一株枯草芽孢桿菌株(Bacillus subtilis)，菌種保藏編號(hào)為1107。
2.一種枯草芽孢桿菌株的制備方法，是將從土壤中分離得到的菌枯草芽孢桿菌JA經(jīng)20keV，2.6×1015～3.9×1015ions/cm2，不同劑量的N+注入誘變處理篩選到高產(chǎn)高抗菌活性菌株JA026。
3.如權(quán)利要求2所述的枯草芽孢桿菌株的制備方法，其特征是采用N+脈沖式輻照處理，樣品置于水冷的無(wú)菌靶臺(tái)上，將枯草芽孢桿菌株JA制成菌懸液，取0.1mL菌懸液鋪于Φ90mm的空白平皿中，于超凈臺(tái)中風(fēng)干制成菌膜備用；用不同劑量N+的輻照處理后將菌膜用1mL無(wú)菌水洗脫涂布于PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24hr后挑單菌落；將經(jīng)過(guò)離子束注入處理的，從培養(yǎng)24h的斜面挑一環(huán)細(xì)胞接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)后再接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)后，測(cè)效價(jià)，篩選高產(chǎn)菌株。
4.如權(quán)利要求3所述的枯草芽孢桿菌株的制備方法，其特征是種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)的最佳種齡12hr，再按接種量1∶10接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵液的pH值為7.2，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為333r/min，溫度為30℃，發(fā)酵時(shí)間為48hr。
5.如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌株制劑，是菌枯草芽孢桿菌發(fā)酵后的混合液，并經(jīng)過(guò)超濾后的產(chǎn)物。
6.如權(quán)利要求5所述的枯草芽孢桿菌株制劑，其特征是菌枯草芽孢桿菌發(fā)酵后的混合液，并經(jīng)過(guò)截留分子量為1000D超濾膜的超濾物，并經(jīng)5000～7000r/min離心取上清液得到的濃縮液。
7.如權(quán)利要求5所述的枯草芽孢桿菌株制劑的制備方法，是將高產(chǎn)菌枯草芽孢桿菌株進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵工藝包括對(duì)斜面保存的枯草芽孢桿菌的高產(chǎn)菌株斜面活化；種瓶培養(yǎng)；發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵液高速離心除菌體并進(jìn)行熱處理。
8.如權(quán)利要求7所述的枯草芽孢桿菌株制劑的制備方法，其特征是斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基魚(yú)蛋白胨2％，甘油1％，K2HPO40.15％，MgSO40.15％，pH7.2，最佳種齡時(shí)間為12hr；發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，K2HPO40.15％，MgSO40.15％，最適pH值6.7～7.5，最適發(fā)酵周期為40hr～48hr，最適溫度28℃～30℃，離心轉(zhuǎn)速為8000r/min，熱處理溫度為108℃，10min。
9.如權(quán)利要求5所述的枯草芽孢桿菌株制劑的用途，是用于水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌、西瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌、黃瓜菌核病菌、黃瓜灰霉病菌等多種植物病原真菌的防治；對(duì)紅蜘蛛的防治；對(duì)煙草青枯病菌和番茄青枯病菌等植物致病細(xì)菌的防治；用于胃、肝、肺、大腸、腎、皮膚、食道等腫瘤的治療，用于病毒性疾病抗病毒的治療。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種枯草芽孢桿菌株、制備方法，制劑、制備方法及用途，從土壤中分離對(duì)小麥赤霉病菌具有強(qiáng)烈抑制作用的枯草芽孢桿菌JA，通過(guò)不同劑量N
文檔編號(hào)C12N1/20GK1590535SQ20041001448
公開(kāi)日2005年3月9日 申請(qǐng)日期2004年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月27日
發(fā)明者劉靜, 王軍, 余增亮 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院等離子體物理研究所