專利名稱：一種酶固定化法生產右旋糖酐用的載體材料的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物酶法工藝中的一種材料，特別是固定化酶法工藝中的載體材料，確切地說是一種酶固定化法生產右旋糖酐用的載體材料。
背景技術：
右旋糖酐(Dextran)又名葡聚糖，是一種優(yōu)良的血漿代用品，具有抗血栓、改善微循環(huán)等作用，并已廣泛地應用于醫(yī)療、食品工業(yè)、生物學等領域。
右旋糖酐傳統(tǒng)的生產工藝采用的是發(fā)酵技術，如章朝暉的“右旋糖酐的制備及應用”(《四川化工與腐蝕控制》2001，4(1)，50-52)，Mariana Santos等人在研究右旋糖酐生產時也用到了發(fā)酵技術(《Biochemical Engineering Journal》2000，(4)，177-188)。該工藝技術雖然較為成熟，但生產中乙醇消耗量大，生產環(huán)境惡劣，產品中的氮、氯等雜質或離子難以控制，分子量分布不均勻，后期分離、純化比較困難，致使其產品質量較低。王勇等人在“右旋糖酐制取新工藝研究”(《生物技術》1994，4(3)，45-46)中采用了定向發(fā)酵技術來實現(xiàn)右旋糖酐分子量的分級處理，避免了使用鹽酸降解，減少了氯離子等雜質，并降低了乙醇的使用量。但在生產過程中菌體與右旋糖酐相互纏繞，不能分開，致使產品中含有雜蛋白等雜質。CN1415631A公開的右旋糖酐生產工藝中采用了膜分離技術，該工藝盡管避免了酒精和一些有機溶劑的使用，但五級超濾膜過濾、分離處理，在工業(yè)生產中效率不高，且膜技術方法中存在著濃差極化及膜孔污染等一系列問題。右旋糖酐其它的分級、分離方法或技術，如Barker P.E.等人用色譜柱進行右旋糖酐分子量分級的研究(《Journal of Chemical Technology andBiotechnology》1989，46(3)，209-218)等，都只是對傳統(tǒng)發(fā)酵生產工藝的某一步驟進行一些技術變化或處理，而不能做出本質的改進或提高。
CN1353193A公開的右旋糖酐生產工藝采用的是酶法技術。生物酶技術相對于傳統(tǒng)的發(fā)酵技術而言，提高了右旋糖酐的產量，但用游離酶生產右旋糖酐，在生產過程中仍要使用鹽酸，還是避免不了氯等雜質離子的引入，同時雜蛋白等一些雜質還是難以除去。Monsan等人在研究右旋糖酐生產時，考察比較了游離酶與固定化酶的酶活等一些特征(《Methods in Enzymology》1987，(136)，141-157)，固定化酶要優(yōu)于游離酶。M.M.Abdel-Halim，El-Sayed等人在分批和補料分批生產右旋糖酐(《Biotechnologyand Bioengineering》1990，36(6)，338-345)以及在半連續(xù)分批補料生產右旋糖酐和右旋糖酐蔗糖酶(《Biotechnology and Bioengineering》1990，36(6)，346-351)的研究中是把腸膜明串珠菌固定在海藻酸鈣上。N.V.Sankpal，A.P.Joshi等人在用固定化技術生產右旋糖酐的研究中，把根霉菌固定在多孔纖維素上(《ProcessBiochemistry》2001，37(4)，395-403)。用海藻酸鹽充當固定化載體材料，凝膠母體的細孔易被右旋糖酐堵塞，降低了物質轉運，且海藻酸鹽的凝膠強度不高，固定化酶的海藻酸鹽凝膠粒子容易破碎，使用周期較短，從而影響了右旋糖酐的最終產量和質量以及生產過程的控制。用多孔纖維素作固定化載體材料，克服了海藻酸鹽的一些缺點，但固著率不高，右旋糖酐的最終產量及質量還是不理想。
工業(yè)化生產右旋糖酐，酶法優(yōu)于發(fā)酵法，而固定化酶法又優(yōu)于游離酶法。載體材料是影響固定化酶法工藝的重要因素。

發(fā)明內容
本發(fā)明為了避免上述各種生產方法及技術的缺陷，提高右旋糖酐的產量和質量，采用天然的和/或合成的水溶性或半水溶性的高分子與藻元酸和/或藻元酸鹽構成的復合凝膠充當固定化載體材料來固定右旋糖酐蔗糖酶，并用來生產右旋糖酐。其特征在于，各組份有以下重量百分比藻元酸和/或藻元酸鹽 75～99％天然水溶和/或半水溶性高分子 0～15％合成水溶和/或半水溶性高分子 0～10％兩種高分子材料不同時為零。
優(yōu)選配比藻元酸和/或藻元酸鹽 60～95％天然水溶和/或半水溶性高分子 1～20％合成水溶和/或半水溶性高分子 1.5～20％。
較佳配比藻元酸和/或藻元酸鹽 55～90％天然水溶和/或半水溶性高分子 4～25％合成水溶和/或半水溶性高分子 3～20％。
所述的天然水溶或半水溶性高分子材料包括明膠、殼聚糖及卡拉膠等。
所述的合成水溶或半水溶性高分子材料包括聚丙烯酸鈉、聚甲基丙烯酸鈉、聚乙烯醇和PVP等。
固定化及固定化酶反應操作過程如下取上述高分子復合載體材料加水配成2～10％濃度的凝膠溶液，向該凝膠溶液中加入一定量的細菌懸浮培養(yǎng)液并混勻，然后滴入氯化鈣(CaCl2)溶液中形成滴丸，并讓其交聯(lián)成型1～2小時。分離，無菌水洗滌滴丸。該滴丸固著有經過懸浮培養(yǎng)的細菌。
在無菌條件下將滴丸接入誘導培養(yǎng)基中，恒溫搖床培養(yǎng)，誘導生成生物酶。反應結束后過濾分離，用無菌水洗滌滴丸。該滴丸固著有右旋糖酐蔗糖酶，即固定化酶。
將固定化酶滴丸接入底物純蔗糖溶液中進行酶轉化反應生成高分子量的右旋糖酐。每一次酶轉化反應后過濾分離，滴丸用無菌水洗凈，再接入下一批底物重復使用。濾液經乙醇沉析得到右旋糖酐。
本發(fā)明從根本上避免了傳統(tǒng)工藝和其它一些工藝技術在生產過程中所帶來的氮、氯等雜質離子，降低了乙醇的使用量。同時，使用高分子復合凝膠材料充當固定化載體，酶固定化后的凝膠強度及作用效果大大增強，固定化酶及滴丸的可重復利用率提高，使用周期延長，右旋糖酐的產量及質量明顯提高，有利于實際生產操作及生產過程的控制。本固定化酶技術為簡便、快捷、高效生產右旋糖酐提供了有力的技術支撐。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點1、技術先進用培養(yǎng)分離出來的生物酶合成右旋糖酐，可消除生產過程中帶來的氮、氯等雜質或離子。
2、生產成本降低運用固定化酶技術，可使生產過程連續(xù)化，而且酶可以重復利用，使生產成本顯著降低。
3、產品質量提高，產量增加利用酶工程技術改造現(xiàn)有產業(yè)，使其技術升級換代，從而控制產品的雜質含量，使產品分子量分布均勻，質量提高。
具體實施例方式
(一)、高分子復合載體材料的配制1、取藻元酸或者藻元酸鹽99份，明膠或PVP1份，混合均勻。
2、取藻元酸75份，明膠15份，聚丙烯酸鈉10份，混合均勻。
3、取藻元酸鹽60份，卡拉膠15份，明膠10份，聚丙烯酸鈉10份，PVP5份，混合均勻。
4、取藻元酸50份，藻元酸鹽40份，殼聚糖5份，聚乙烯醇5份，混合均勻。
5、取藻元酸30份，藻元酸鹽25份，明膠10份，殼聚糖15份，聚甲基丙烯酸鈉10份，PVP10份，混合均勻。
6、取藻元酸、藻元酸鹽各40份，明膠、卡拉膠、殼聚糖、聚乙烯醇各5份，混合均勻。
7、取藻元酸、藻元酸鹽各35份，明膠10份，聚乙烯醇9份，聚丙烯酸鈉6份，PVP5份，混合均勻。
(二)、細菌的培養(yǎng)以腸膜明串珠菌為例。
取腸膜明串珠菌L.mesenteroides——1226經培養(yǎng)皿固體培養(yǎng)、液體懸浮培養(yǎng)。
培養(yǎng)基的配方液體培養(yǎng)基蔗糖≤20％、蛋白胨≤0.2％和Na2HPO4≤0.2％。
固體培養(yǎng)基蔗糖≤20％、蛋白胨≤0.2％、Na2HPO4≤0.2％和瓊脂2％。
最后得細菌懸浮培養(yǎng)液備用。
(三)、酶固定取25ml的細菌懸浮培養(yǎng)液，加入75ml由(一)制備的載體材料加水配制的5％的凝膠溶液中混勻，然后滴入到CaCl2溶液中形成滴丸，并讓其交聯(lián)1～2小時。
將滴丸用無菌水洗凈，在無菌條件下接入到酶誘導培養(yǎng)基上。在轉速≤200rpm，溫度20～30℃的恒溫搖床上培養(yǎng)，誘導酶的生成。48小時后，將反應體系過濾，用無菌水冼滌滴丸，得到固定化酶。
酶誘導培養(yǎng)基蔗糖≤20％、蛋白胨≤0.2％、Na2HPO4≤0.2％、MnSO4·7H2O≤1％和CaCO3≤15％。
(四)、生產右旋糖酐將固定化酶滴丸接入含糖量小于15％的純蔗糖溶液中，48小時后大量右旋糖酐生成。分離，濾液用95％乙醇沉析，沉析物即是右旋糖酐。固定化酶滴丸重復使用。
權利要求
1.一種酶固定化法生產右旋糖酐用的載體材料，其特征在于有以下組份和重量百分比藻元酸和/或藻元酸鹽75～99％天然水溶和/或半水溶性高分子0～15％合成水溶和/或半水溶性高分子0～10％兩種高分子材料不同時為零。
2.根據權利要求1所述的載體材料，其特征在于藻元酸和/或藻元酸鹽60～95％天然水溶和/或半水溶性高分子1～20％合成水溶和/或半水溶性高分子1.5～20％。
3.根據權利要求1或2所述的載體材料，其特征在于藻元酸和/或藻元酸鹽55～90％天然水溶和/或半水溶性高分子4～25％合成水溶和/或半水溶性高分子3～20％。
4.根據權利要求1所述的載體材料，其特征在于所述的天然水溶或半水溶性高分子包括明膠、殼聚糖、卡拉膠。
5.根據權利要求1所述的載體材料，其特征在于所述的合成水溶和/或半水溶性高分子包括聚丙烯酸鈉、聚甲基丙烯酸鈉、聚乙烯醇、PVP。
全文摘要
一種酶固定化法生產右旋糖酐用的載體材料，采用藻元酸或藻元酸鹽同天然的和/或合成的水溶性或半水溶性高分子構成的復合高分子凝膠作固定化載體材料固定右旋糖酐蔗糖酶，并用來生產右旋糖酐。本載體材料強度大、固著牢、可重復使用，明顯提高右旋糖酐的產量和質量，有利于工業(yè)生產過程控制。
文檔編號C12N11/02GK1563374SQ20041001462
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月8日 優(yōu)先權日2004年4月8日
發(fā)明者姚日生, 張洪斌, 何紅波, 徐俊福, 魯漢新, 朱慧霞 申請人:合肥工業(yè)大學, 江蘇省黃海藥業(yè)有限公司