專(zhuān)利名稱(chēng)：大蒜病毒檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于大蒜病毒RT-PCR檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，專(zhuān)用于大蒜花葉病毒(GMV)、大蒜潛隱病毒(GCLV)的檢測(cè)。
二、技術(shù)背景大蒜(Alliμm sativum L.)是我國(guó)一種重要的出口蔬菜。但大蒜屬花粉敗育型植物，生產(chǎn)中主要靠鱗莖進(jìn)行無(wú)性繁殖。因此，病毒在大蒜營(yíng)養(yǎng)器官中不斷積累增殖造成品種退化，使產(chǎn)量和質(zhì)量下降，嚴(yán)重影響我國(guó)大蒜的生產(chǎn)和出口。大蒜病毒病屬于難治療病害，迄今還沒(méi)有一種有效的藥物。大蒜花葉病毒病是大蒜花葉病毒(GMV，Garlic mosaic virus)侵染大蒜植株引起的病害，其田間植株癥狀呈現(xiàn)出顯著黃色條紋花葉，葉片呈扭曲、折疊及萎縮狀態(tài)，病毒粒子體為700～800μm，以鱗莖、汁液、蚜蟲(chóng)、薊馬及線蟲(chóng)等傳毒。大蒜潛隱病毒病是大蒜潛隱病毒(GCLV，Garlic commonlatent virus)侵染大蒜植株引起的病害，其田間植株不表現(xiàn)出任何帶毒癥狀，即無(wú)癥帶毒，并不影響產(chǎn)量；但在自然條件下，該病毒多數(shù)與大蒜花葉病毒混合侵染大蒜植株，被侵染的病株常常呈現(xiàn)出系統(tǒng)花葉癥狀。病毒粒子體為580～720μm，以鱗莖、汁液和蚜蟲(chóng)等傳毒。目前，解決大蒜病毒主要是通過(guò)組織培養(yǎng)方法來(lái)生產(chǎn)脫毒大蒜，故建立靈敏、快速、簡(jiǎn)便、商業(yè)化的檢測(cè)技術(shù)成為脫毒大蒜生產(chǎn)中應(yīng)迫切解決的問(wèn)題。
自20世紀(jì)30代以來(lái)，大蒜病毒的檢測(cè)主要是依據(jù)植株本身的外觀癥狀和指示植物來(lái)進(jìn)行，這些方法需時(shí)較長(zhǎng)，靈敏度較低，且受季節(jié)限制。20世紀(jì)70年代至80年代初期，隨著免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，其在大蒜病毒檢測(cè)上的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。免疫學(xué)方法檢測(cè)大蒜病毒的靈敏性大大提高，特異性也增強(qiáng)，檢測(cè)速度也有較大的提高，目前已成為最常用的大蒜病毒的檢測(cè)方法。
20世紀(jì)80年代中期以后，分子生物學(xué)的技術(shù)得到了快速的發(fā)展，為大蒜病毒的檢測(cè)提供了一種比上述幾種方法靈敏度更高、特異性更強(qiáng)、速度更快的方法。
RT-PCR技術(shù)檢測(cè)病毒的基本原理是首先弄清待檢病毒RNA的全部或部分序列，并以此合成一對(duì)特異性引物(也可用隨機(jī)引物)；然后對(duì)病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增；對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳、染色，產(chǎn)生特異DNA譜帶，據(jù)此即可檢測(cè)病毒。RT-PCR技術(shù)作為一種國(guó)際通用的病毒檢測(cè)技術(shù)與其它檢測(cè)方法比較具有以下優(yōu)點(diǎn)①比ELISA更靈敏，特異性更好，結(jié)果更可靠；②與核酸分子雜交技術(shù)相比無(wú)放射性危險(xiǎn)；③與dsRNA電泳技術(shù)相比可檢測(cè)fg數(shù)量級(jí)的植物病毒及大規(guī)模樣品。因此該技術(shù)在大蒜病毒檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
國(guó)內(nèi)外特別是日本近年來(lái)已開(kāi)始采用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)大蒜病毒，效果良好，報(bào)道利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)的大蒜病毒有大蒜潛隱病毒(GCLV)等(ArchVirol.1998，1431093～1107)。但是，至今沒(méi)有大蒜RT-PCR病毒檢測(cè)試劑盒出現(xiàn)，市場(chǎng)上出售的一步RT-PCR試劑盒，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)一步進(jìn)行，一旦某一環(huán)節(jié)出錯(cuò)就必須從頭開(kāi)始而造成的時(shí)間和藥品的浪費(fèi)，同時(shí)常用的RT-PCR反應(yīng)體系為100μl的大體系，造成大量藥品的浪費(fèi)，并且操作復(fù)雜容易造成污染，而導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的在于提供一種大蒜病毒RT-PCR檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，建立大蒜GMV、GCLV病毒的RT-PCR檢測(cè)試劑盒和使用方法，為大蒜病毒檢疫和大蒜脫毒苗病毒檢測(cè)提供一種快速、準(zhǔn)確、操作方便、靈敏、特異性好的檢測(cè)方法。
技術(shù)方案1一種大蒜病毒RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包括反轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR試劑盒及陽(yáng)性對(duì)照三部份1)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，含有PCR試劑管1和無(wú)RNA酶的水，其中PCR試劑管1內(nèi)含10×buffer，dNTP，MgCl2，RNA酶抑制因子，oligo-dT引物，反轉(zhuǎn)錄酶；每1支量7.5～15μl反轉(zhuǎn)錄試劑配制成分 試劑濃度 用量10×buffer15mmol/μl1～3μldNTP 10mmol/μl1～3μlMgCl225mmol/l 3～4μlRNA酶抑制因子 40U/μl 0.5～1μl
oligo-dT引物 0.1ug/μl1～2μl反轉(zhuǎn)錄酶 200U/μl 1～2μl2)PCR試劑盒，含有PCR試劑管2、試劑A及試劑B，其中PCR試劑管2內(nèi)含10×PCR buffer，MgCl2，dNTP，Taq酶，每1支量2.7～8.5μl PCR試劑配制成分 試劑濃度 用量10×PCR buffer15mmol/μl 1～3μlMgCl225mmol/μl 1～3μldNTP 10mmol/μl 0.5～2μlTaq酶 5U/μl 0.2～0.5μl試劑A配制引物GMVP15’-TGGAAGGCAAAGTTACAGGAGG-3’和引物GMVP25’-GTCAAATGCGTACCGTGCGAGA-3’用純水溶解到5～20pmol/μl；試劑B配制引物GCLVP15’-AGTTGCGACTGCTGAAGACC-3’和引物GCLVP25’-GCCATTACGCCTATTCCTAC-3’用純水溶解到5～20pmol/μl；3)陽(yáng)性對(duì)照，為從大蒜病葉中提取的，含有GMV、GCLV兩種病毒RNA的RNA。2大蒜病毒RT-PCR檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法(1)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)向PCR試劑管1中加入0.1～1μg大蒜總RNA樣品和無(wú)RNA酶的水，使總反應(yīng)體系達(dá)20μl，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA，其條件為42℃、30分鐘，95℃、5分鐘，4℃、5分鐘；(2)PCR反應(yīng)取反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，加入PCR試劑管2中，再加入試劑A或試劑B，然后加入純水使總反應(yīng)體系達(dá)20μl，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，其參數(shù)為94℃變性1分鐘，57℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；(3)電泳檢測(cè)在PCR反應(yīng)結(jié)束的PCR試劑管2中加入電泳上樣緩沖液，取反應(yīng)液在含瓊脂糖和溴化乙錠(EB)的凝膠上進(jìn)行電泳，然后在凝膠成像系統(tǒng)上拍照觀察含有GMV病毒大蒜樣品的電泳檢測(cè)結(jié)果為擴(kuò)增出327bp的電泳條帶，含有GCLV病毒大蒜樣品的電泳檢測(cè)結(jié)果為擴(kuò)增出469bp的電泳條帶。
有益效果本發(fā)明所提供的大蒜病毒RT-PCR檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果1)本發(fā)明試劑盒經(jīng)特異性和靈敏度鑒定，證明特異性和靈敏度較高。
2)試劑被分裝在兩個(gè)PCR試劑管中，避免了操作過(guò)程中的污染，使用方便。
3)試劑盒反轉(zhuǎn)錄和PCR分兩步進(jìn)行，與市場(chǎng)上出售的一步RT-PCR試劑盒相比，避免了一旦由于一部分出錯(cuò)就必須從頭開(kāi)始而造成的時(shí)間和藥品的浪費(fèi)，并且反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)可以設(shè)置重復(fù)，與一步RT-PCR試劑盒相比，增加了結(jié)果的可靠性。
4)試劑盒PCR部分采用20μl小反應(yīng)體系，與RT-PCR常用的100μl大反應(yīng)體系相比節(jié)約藥品，可降低成本。
本發(fā)明為大蒜病毒檢測(cè)提供了一種快速、準(zhǔn)確、操作方便、靈敏、特異性好的試劑盒，可以大大加速脫毒大蒜的推廣和應(yīng)用。
四

圖1大蒜GMV病毒的RT-PCR擴(kuò)增條帶M為分子量marker，1、2、3、4為含有大蒜GMV病毒的大蒜樣品圖2大蒜GCLV病毒的RT-PCR擴(kuò)增條帶M為分子量marker，1、2、3、4為含有大蒜GCLV病毒的大蒜樣品圖3大蒜GMV病毒的RT-PCR靈敏性鑒定M為分子量marker，1、2、3、4、5分別為按1∶10∶20∶50∶100比例稀釋圖4大蒜GCLV病毒的RT-PCR靈敏性鑒定M為分子量marker，1、2、3、4、5分別為按1∶10∶20∶50∶100比例稀釋五具體實(shí)施方式
1、PCR引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GMV的外殼蛋白基因(Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)AF500074)和GCLV的外殼蛋白基因(Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)AF228416)設(shè)計(jì)引物，利用DNA合成儀合成2對(duì)引物GMVP1、GMVP2和GCLVP1、GCLVP2。合成的引物GMVP1、GMVP2擴(kuò)增位于GMV外殼蛋白基因的277bp～603bp之間的核苷酸序列，長(zhǎng)度為327bp；合成的引物GCLVP1、GCLVP2擴(kuò)增位于GCLV外殼蛋白基因的402bp～870bp之間的核苷酸序列，長(zhǎng)度為469bp。
2、RT-PCR試劑盒的組裝
(1)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的組裝反轉(zhuǎn)錄試劑按表1配制，并分裝在PCR試劑管1(用DEPC處理并滅菌)中。
(2)PCR試劑盒的組裝①PCR試劑按表2配制，并分裝在PCR試劑管2中。
②試劑A配制，引物GMVP1(5’-TGGAAGGCAAAGTTACAGGAGG-3’)和引物GMVP2(5’-GTCAAATGCGTACCGTGCGAGA-3’)用純水溶解到10pmol/μl。
③試劑B配制，引物GCLVP1(5’-AGTTGCGACTGCTGAAGACC-3’)和引物GCLVP2(5’-GCCATTACGCCTATTCCTAC-3’)用純水溶解到10pmol/μl。
(3)陽(yáng)性對(duì)照，從大蒜病葉中提取，含有GMV、GCLV兩種病毒RNA的RNA。
3、大蒜病毒RT-PCR檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法(1)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，向PCR試劑管1中加入0.1～1μg大蒜總RNA樣品和無(wú)RNA酶的水，使總反應(yīng)體系達(dá)20μl，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，其條件為42℃、30分鐘，95℃、5分鐘，4℃、5分鐘。
(2)PCR反應(yīng)，取1μl反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，加入PCR試劑管2中，再加入5μl試劑A或試劑B，然后加入純水使總反應(yīng)體系達(dá)20μl，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，其參數(shù)為94℃變性1分鐘，57℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)。
(3)電泳檢測(cè)，在PCR反應(yīng)結(jié)束的PCR試劑管B中加入3μl 6倍電泳上樣緩沖液0.25％(w/w)溴酚蘭溶液，取10μl在含2.0％(w/w)瓊脂糖和10μl/100ml溴化乙錠(EB)的膠上進(jìn)行電泳，然后在凝膠成像系統(tǒng)上拍照觀察。
實(shí)施結(jié)果如下1特異性鑒定利用多種病毒(OYDV、GCLV、GMV、SLV)復(fù)合侵染的大蒜葉片檢測(cè)本試劑盒的特異性，結(jié)果表明，按照試劑盒的使用方法，GCLV和GMV都得到了清晰、準(zhǔn)確的擴(kuò)增條帶，利用Labwork4.0根據(jù)分子量marker測(cè)定的序列長(zhǎng)度與預(yù)期設(shè)計(jì)長(zhǎng)度327bp(圖1)和469bp(圖2)相吻合，證明該試劑盒有較高的特異性。
2靈敏度鑒定將含有GCLV、GMV病毒RNA的大蒜總RNA提取液按1∶10∶20∶50∶100比例稀釋?zhuān)喈?dāng)于0.8μg，0.08μg，0.04μg，0.016μg，0.008μg，利用本試劑盒并按使用方法經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3、圖4所示，由圖3、圖4可知，除了稀釋100倍的RNA不能擴(kuò)增出條帶外，其它都可以擴(kuò)增出來(lái)，表明用RT-PCR檢測(cè)大蒜病毒有較高的靈敏度。
此外，本試劑盒反轉(zhuǎn)錄和PCR分兩步進(jìn)行，與市場(chǎng)上出售的一步RT-PCR試劑盒相比，避免了一旦由于一部分出錯(cuò)就必須從頭開(kāi)始而造成的時(shí)間和藥品的浪費(fèi)，并且反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)可以設(shè)置重復(fù)，與一步RT-PCR試劑盒相比，增加了結(jié)果的可靠性。同時(shí)，本試劑盒PCR部分采用20μl小反應(yīng)體系，與RT-PCR常用的100μl大反應(yīng)體系相比節(jié)約藥品，可降低成本，本試劑盒所有試劑被分裝在兩個(gè)PCR試劑管中，與常用的RT-PCR相比避免了操作過(guò)程中的污染，使用方便。
表1反轉(zhuǎn)錄試劑成分 試劑濃度 1支(μl)10×buffer15mmol/μl2dNTP 10mmol/μl2MgCl225mmol/l 4RNA酶抑制因子 40U/μl 0.5Oligo-dT引物 0.1ug/μl 1MMLV反轉(zhuǎn)錄酶 200U/μl 1總體積 10.5表2 PCR試劑成分 試劑濃度 1支(μl)10×PCR buffer 15mmol/μl 2MgCl225mmol/μl 1.6dNTP 10mmol/μl 0.5Taq酶5U/μl 0.2總體積4.權(quán)利要求
1.一種大蒜病毒RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包括反轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR試劑盒及陽(yáng)性對(duì)照三部份1)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，含有PCR試劑管1和無(wú)RNA酶的水，其中PCR試劑管1內(nèi)含10×buffer，dNTP，MgCl2，RNA酶抑制因子，oligo-dT引物，反轉(zhuǎn)錄酶；2)PCR試劑盒，含有PCR試劑管2、試劑A及試劑B，其中PCR試劑管2內(nèi)含10×PCR buffer，MgCl2，dNTP，Taq酶，試劑A內(nèi)含引物GMVP15’-TGGAAGGCAAAGTTACAGGAGG-3’引物GMVP25’-GTCAAATGCGTACCGTGCGAGA-3’試劑B內(nèi)含引物GCLVP15’-AGTTGCGACTGCTGAAGACC-3’，引物GCLVP25’-GCCATTACGCCTATTCCTAC-3’3)陽(yáng)性對(duì)照，為從大蒜病葉中提取的，含有GMV、GCLV兩種病毒RNA的RNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大蒜病毒RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，1)每1支量7.5～15μl反轉(zhuǎn)錄試劑配制成分 試劑濃度用量10×buffer 15mmol/μl 1～3μldNTP 10mmol/μl 1～3μlMgCl225mmol/l3～4μlRNA酶抑制因子 40U/μl 0.5～1μloligo-dT引物 0.1ug/μl 1～2μl反轉(zhuǎn)錄酶 200U/μl1～2μl2)每1支量2.7～8.5μlPCR試劑配制成分 試劑濃度用量10×PCR buffer 15mmol/μl 1～3μlMgCl225mmol/μl 1～3μldNTP 10mmol/μl 0.5～2μlTaq酶 5U/μl 0.2～0.5μl試劑A配制引物GMVP15’-TGGAAGGCAAAGTTACAGGAGG-3’和引物GMVP25’-GTCAAATGCGTACCGTGCGAGA-3’用純水溶解到5～20pmol/μl；試劑B配制引物GCLVP15’-AGTTGCGACTGCTGAAGACC-3’和引物GCLVP25’-GCCATTACGCCTATTCCTAC-3’用純水溶解到5～20pmol/μl；
3.權(quán)利要求1所述大蒜病毒RT-PCR檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，包括，(1)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)向PCR試劑管1中加入0.1～1μg大蒜總RNA樣品和無(wú)RNA酶的水，使總反應(yīng)體系達(dá)20μl，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA，其條件為42℃、30分鐘，95℃、5分鐘，4℃、5分鐘；(2)PCR反應(yīng)取反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，加入PCR試劑管2中，再加入試劑A或試劑B，然后加入純水使總反應(yīng)體系達(dá)20μl，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，其參數(shù)為94℃變性1分鐘，57℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；(3)電泳檢測(cè)在PCR反應(yīng)結(jié)束的PCR試劑管2中加入電泳上樣緩沖液，取反應(yīng)液在含瓊脂糖和溴化乙錠的凝膠上進(jìn)行電泳，然后在凝膠成像系統(tǒng)上拍照觀察含有GMV病毒大蒜樣品的電泳檢測(cè)結(jié)果為擴(kuò)增出327bp的電泳條帶，含有GCLV病毒大蒜樣品的電泳檢測(cè)結(jié)果為擴(kuò)增出469bp的電泳條帶。
全文摘要
本發(fā)明涉及大蒜病毒RT－PCR檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，專(zhuān)用于大蒜花葉病毒(GMV)、大蒜潛隱病毒(GCLV)的檢測(cè)。試劑盒包括反轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR試劑盒及陽(yáng)性對(duì)照三部分。檢測(cè)方法，包括反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，PCR反應(yīng)及電泳檢測(cè)，含有GMV病毒大蒜樣品的電泳檢測(cè)結(jié)果為擴(kuò)增出327bp的電泳條帶，含有GCLV病毒大蒜樣品的電泳檢測(cè)結(jié)果為擴(kuò)增出469bp的電泳條帶。本試劑盒PCR部分采用小反應(yīng)體系，節(jié)約藥品，降低成本，使用方便。通過(guò)特異性和靈敏度鑒定，證明本試劑盒特異性和靈敏度較高。
文檔編號(hào)C12Q1/25GK1563411SQ20041001472
公開(kāi)日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月22日
發(fā)明者侯喜林, 張昌偉, 史公軍, 王建軍 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)