專利名稱：聚乙烯醇鋁鹽固定化酶/微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固定化微生物的制取方法，特別一種聚乙烯醇鋁鹽固定化酶/微生物的方法。
二 背景技術(shù)生物固定化技術(shù)是現(xiàn)代生物工程領(lǐng)域中的一項(xiàng)新興技術(shù)，是使生物催化劑(酶、微生物、動(dòng)植物細(xì)胞、細(xì)胞器等)更廣泛、更有效使用的一種重要手段。生物催化劑通過物理或化學(xué)方法固定化后，其催化性能得以改善，使用效率大大提高。現(xiàn)在，固定化生物催化劑的應(yīng)用研究已經(jīng)涉及食品與發(fā)酵工業(yè)、化學(xué)合成工業(yè)、環(huán)境污染治理與檢測(cè)等各個(gè)領(lǐng)域，充分展示了固定化生物催化劑的美好發(fā)展前景。目前常采用的生物催化劑固定化方法主要吸附法、包埋法、交聯(lián)法和截留法。而酶/微生物的固定化方法中，以包埋法最為常用。包埋法是將酶/微生物封閉在天然高分子多糖類或合成高分子凝膠的網(wǎng)絡(luò)中，從而使酶/微生物固定化。其特點(diǎn)是能將固定化酶/微生物制成各種形狀(球狀、快狀、膜狀等)，并且固定化后的微生物能增殖，應(yīng)用最廣泛。
現(xiàn)有的包埋的材料主要有瓊脂、海藻酸鈉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、卡拉膠等。以下是國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)各種包埋劑的比較各種固定化細(xì)胞載體的性能比較
通過以上比較，一般認(rèn)為聚乙烯醇和海藻酸鈉為比較合理的包埋材料。趙亞乾，楊鐳等(海藻酸鈉包埋活性炭與活性污泥的固定化技術(shù).上海環(huán)境科學(xué).1997，16(9)28～30)公開了一種海藻酸鈉固定化微生物的方法，在海藻酸鈉和微生物混合溶液中加入粉末活性炭，以增加機(jī)械性能。李花子等(聚乙烯醇—硼酸固定化方法的改進(jìn).環(huán)境科學(xué)研究.2002，15(5)25～27)公開了一種聚乙烯醇固定化微生物的方法，在聚乙烯醇溶液中加入少量海藻酸鈉，再與微生物混合，滴入飽和硼酸和氯化鈣的混合交聯(lián)劑中，固化24小時(shí)，濾出顆粒備用，此法一般稱為改進(jìn)PVA硼酸法。
上述方法各有特點(diǎn)。其中海藻酸鈉固定化微生物的方法的制作過程比較簡(jiǎn)單，傳質(zhì)性能比較好。但耐曝氣強(qiáng)度較低，只能維持一個(gè)月左右。特別是當(dāng)溶液中有磷酸根離子時(shí)，通過爭(zhēng)奪凝膠中的鈣離子使固定化微生物溶解。聚乙烯醇固定化微生物的方法制作過程相對(duì)簡(jiǎn)單，但在曝氣初期會(huì)有大量聚乙烯醇和海藻酸鈉溶出，最后完全溶解，而當(dāng)溶液中有磷酸根離子是同樣會(huì)使耐曝氣強(qiáng)度降低。特別在固定化技術(shù)用于處理水質(zhì)復(fù)雜，有毒物質(zhì)較多的廢水(例如焦化廢水)時(shí)，很難維持一個(gè)月。
三 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種聚乙烯醇鋁鹽固定化酶/微生物的方法，酶/微生物固定化以后不會(huì)流失，對(duì)熱、pH值等的穩(wěn)定性提高；提高利用效率，降低成本；對(duì)于多酶體系的催化過程和需要輔酶催化的反映具有明顯的優(yōu)越性，并且耐曝氣強(qiáng)度高，抗毒性強(qiáng)，機(jī)械強(qiáng)度高、制作簡(jiǎn)單。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的技術(shù)解決方案為一種聚乙烯醇鋁鹽固定化酶/微生物的方法，其步驟為在1％～25％的聚乙烯醇的溶液中加入0.1％～15％的海藻酸鈉，再加入一定比例的微生物，聚乙烯醇與微生物之比是0.2∶～10∶1，混合均勻；吸取上述混合液滴入飽和硼酸與0.2％～20％的鋁鹽混合的交聯(lián)劑中，用碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值，在交聯(lián)劑中固化2～50個(gè)小時(shí)，最后取出用自來水進(jìn)行清洗備用或活化，用于具體工程需要。
本發(fā)明的原理是用鋁鹽代替一般方法中的氯化鈣，進(jìn)行交聯(lián)(以下簡(jiǎn)稱聚乙烯醇鋁鹽法)。本方法能夠增強(qiáng)固定化微生物的耐曝氣強(qiáng)度、機(jī)械強(qiáng)度高，減少曝氣初期的聚乙烯醇和海藻酸鈉的溶出，抵抗溶液對(duì)固定化酶/微生物的影響，同時(shí)減少磷酸根離子等對(duì)它的機(jī)械強(qiáng)度的影響，是一種適用生物工程、生物制藥、食品發(fā)酵、釀造、制酒、廢水生物處理、能源開發(fā)等涉及固定化酶/微生物技術(shù)領(lǐng)域需要高強(qiáng)度曝氣、攪拌、進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行的新型固定化酶/微生物技術(shù)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點(diǎn)是固定化的酶/微生物耐曝氣強(qiáng)度明顯好于其他固定化方法，在大氣量曝氣池中連續(xù)運(yùn)行5個(gè)月以上，強(qiáng)度依然良好，未見溶解跡象。在曝氣初期也為未見聚乙烯醇和海藻酸鈉的溶出，同在含有高濃度的磷酸鹽溶液中依然保持原有的機(jī)械強(qiáng)度。分析原因可能是由于在高分子凝膠中鈣是以離子形式與高分子聚合物結(jié)合，而Al3+中含有空軌道，因而高分子聚合物中氧的孤對(duì)電子可以進(jìn)入Al3+的空軌道，形成配位體，能使結(jié)構(gòu)更加堅(jiān)固，而且使磷酸根離子等不能奪取凝膠中的鋁離子。當(dāng)本固定化酶/微生物在停止曝氣并保存兩個(gè)月后再重新運(yùn)行，依然能夠恢復(fù)原有活性。因此本方法與其它固定化方法相比，應(yīng)用領(lǐng)域更廣，適應(yīng)性更強(qiáng)，具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益和廣闊的應(yīng)用前景。
四


圖1是本發(fā)明的聚乙烯醇鋁鹽固定化酶/微生物的方法的工藝流程圖。
圖2是本發(fā)明的聚乙烯醇鋁鹽固定化酶/微生物的方法的固化比較曲線圖。
五具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
結(jié)合圖1、圖2，本發(fā)明的具體操作如下在實(shí)驗(yàn)中，用硝化細(xì)菌。在固定化前取富集的硝化細(xì)菌在高速離心分離機(jī)上以3000r/min離心10分鐘后，得到濃縮硝化細(xì)菌，放置到4℃的冰箱中保存待用。試驗(yàn)用的實(shí)際廢水取自該廠脫氰脫酚后的廢水。
準(zhǔn)確稱取聚乙烯醇5g，加熱溶于44ml去離子水中，然后加入1g海藻酸鈉，加熱至完全溶解，冷卻到30℃。準(zhǔn)確稱取濃縮硝化細(xì)菌25g和上述溶液混合，放置到30℃的水浴中。準(zhǔn)確稱取硫酸鋁鹽15g，溶于485ml飽和硼酸溶液中，用1％碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值＝4.5左右，制成混合交聯(lián)劑。用滴管吸取硝化細(xì)菌和聚乙烯醇的混合液滴加到混合交聯(lián)劑中，并且在滴加過程中不斷攪拌。把成形的固定化硝化細(xì)菌放置到4℃的冰箱冷藏室中固化24小時(shí)。固化完全后取出用自來水沖洗，然后放入流化床生化反應(yīng)器中進(jìn)行活化。
通過在焦化廢水中進(jìn)行長(zhǎng)期的曝氣實(shí)驗(yàn)和固定化硝化細(xì)菌的活化證明聚乙烯醇鋁鹽法和其他固定化方法相比有其優(yōu)越性。
(1)曝氣試驗(yàn)用固定化法處理廢水首要因素是強(qiáng)度大，耐曝氣性能好，能夠適應(yīng)長(zhǎng)期處理需要。由于焦化廢水的水質(zhì)復(fù)雜，含有各種有機(jī)物及無機(jī)物，毒性大，對(duì)固定化硝化細(xì)菌的強(qiáng)度影響很大。
比較各種固定化硝化細(xì)菌制作難易和在焦化廢水中的耐曝氣性能如下表2.1。
表2.1 各種包埋方法性能比較
根據(jù)上面比較結(jié)果，聚乙烯醇鋁鹽法具有較好的耐曝氣性能，并且制作相對(duì)簡(jiǎn)單，綜合性能優(yōu)于其他方法。
(2)活化試驗(yàn)。游離活性硝化細(xì)菌經(jīng)固定化以后由于試劑的毒性，包埋時(shí)pH值較低等因素會(huì)使回收率有所下降，根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，只能達(dá)到游離細(xì)菌的40％左右，因此需要進(jìn)行活化。
取硝化細(xì)菌兩等份，其中一份制成固定化顆粒后，按顆粒填充率15％確定焦化廢水量，在生物流化床中處理等量的焦化廢水，以8小時(shí)為周期測(cè)定進(jìn)出水的氨氮濃度，計(jì)算硝化速率。由圖2可以看出，開始，固定化硝化細(xì)菌經(jīng)過固定化后回收率比較低，只有游離硝化細(xì)菌的40％左右。但經(jīng)過7天的活化培養(yǎng)，能達(dá)到80％左右，以后趨于恒定。因此，固定化硝化細(xì)菌經(jīng)過活化后可以用于處理含有高濃度氨氮的焦化廢水。同樣也適用于其它水質(zhì)復(fù)雜，有毒有害物質(zhì)較多的印染、紡織、皮革等工業(yè)的廢水。
通過實(shí)驗(yàn)證明聚乙烯醇鋁鹽法與其它的固定化方法相比具有耐毒性強(qiáng)、耐曝氣強(qiáng)度好、對(duì)一些離子具有抵抗力等都優(yōu)點(diǎn)，因此具有廣闊的發(fā)展前景。
權(quán)利要求
1.一種聚乙烯醇鋁鹽固定化酶/微生物的方法，其步驟為在1％～25％的聚乙烯醇的溶液中加入0.1％～15％的海藻酸鈉，再加入一定比例的微生物，聚乙烯醇與微生物之比是0.2～10∶1，混合均勻；吸取上述混合液滴入飽和硼酸與0.2％～20％的鋁鹽混合的交聯(lián)劑中，用碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值，在交聯(lián)劑中固化2～50個(gè)小時(shí)，最后取出用自來水進(jìn)行清洗備用或活化，用于具體工程需要。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙烯醇鋁鹽固定化酶/微生物的方法，其特征在于聚乙烯醇與微生物之比是2～10∶1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的聚乙烯醇鋁鹽固定化酶/微生物的方法，其特征在于用碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值＝4.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的聚乙烯醇鋁鹽固定化酶/微生物的方法，其特征在于鋁鹽為硫酸鋁、三氯化鋁。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種聚乙烯醇鋁鹽固定化酶/微生物的方法。其步驟為在1％～25％的聚乙烯醇的溶液中加入0.1％～15％的海藻酸鈉，再加入一定比例的微生物，聚乙烯醇與微生物之比是0.2∶～10∶1，混合均勻；吸取上述混合液滴入飽和硼酸與0.2％～20％的鋁鹽混合的交聯(lián)劑中，用碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值，在交聯(lián)劑中固化2～50個(gè)小時(shí)，最后取出用自來水進(jìn)行清洗備用或活化，用于具體工程需要。本發(fā)明能夠增強(qiáng)固定化微生物的耐曝氣強(qiáng)度、機(jī)械強(qiáng)度高，減少曝氣初期的聚乙烯醇和海藻酸鈉的溶出，抵抗溶液對(duì)固定化酶/微生物的影響，同時(shí)減少磷酸根離子等對(duì)它的機(jī)械強(qiáng)度的影響，在曝氣初期也為未見聚乙烯醇和海藻酸鈉的溶出。
文檔編號(hào)C12N11/00GK1696285SQ20041001488
公開日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2004年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月14日
發(fā)明者安立超, 王劍鋒 申請(qǐng)人:南京理工大學(xué)