專利名稱：調節(jié)免疫功能、抗腫瘤的天然營養(yǎng)劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種調節(jié)免疫功能、抗腫瘤的天然營養(yǎng)劑，尤其涉及一種從牛初乳、牛奶、乳漿及其相關產品中制備乳鐵旦白和生物活性多肽作為調節(jié)免疫、抗腫瘤天然營養(yǎng)劑的方法。
發(fā)明技術背景惡性腫瘤是人類健康的頭號大敵，嚴重危害人類健康，全球每年約有850萬新生腫瘤病人，中國每年約有350萬新生腫瘤病人。目前惡性腫瘤居中國致死原因第一位。
人體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與人體免疫功能失衡有一定的關系，通常是由于人體的免疫監(jiān)視功能及免疫清除功能降低而引發(fā)腫瘤生長，因此，通過補充某些具有生物活性的天然營養(yǎng)成份，提高人體免疫功能，對抗腫瘤的發(fā)生有重要意義。
現(xiàn)代研究證實，牛奶中的乳鐵旦白和生物活性多肽有明確的調節(jié)人體免疫功能，增強人體免疫力，對抗腫瘤的作用。
乳鐵旦白是一種含鐵的糖旦白，具有明確的免疫調節(jié)功能，能有效刺激T淋巴細胞，主要是刺激CD4+、CD8+的增殖、成熟；刺激白介素，主要是刺激白介素18(IL-18)產生、釋放；刺激細胞因子，主要是刺激GM-CSF的釋放；激活自然殺傷細胞(NK-Cell)活性；刺激循環(huán)中各種免疫細胞增殖、成熟，包括嗜中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞。動物實驗證實，乳鐵旦白能有效地抑制各類腫瘤細胞成長和抑制腫瘤細胞擴散轉移，其主要機理是吸附腫瘤細胞快速生長所需的鐵離子，同時抑制腫瘤周圍血管的生長，阻止腫瘤周圍新生血管形成，從而阻礙腫瘤組織供血，并且通過激活殺傷T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞。
牛奶旦白經酶水解后，產生具有多種生物活性功能的多肽，其中含有豐富的免疫調節(jié)多肽，包括β-酪旦白f 54-59和α-乳白旦白f 51-53，β-酪旦白f 191-193，α-酪旦白f 194-199，β-酪旦白f 63-68，Tyr-Gly，Tyr-Gly-Gly，這些免疫調節(jié)多肽刺激人體免疫細胞增殖、成熟，提高免疫系統(tǒng)對抗外來抗原及腫瘤細胞的能力，激發(fā)單核細胞-巨噬細胞系統(tǒng)活性，提高免疫系統(tǒng)的功能。
綜合目前國外報導的文獻，已經證實乳鐵旦白和活性多肽可能幫助對抗結腸癌、前列腺癌、胃癌及消化道其他惡性腫瘤、乳腺癌、皮膚癌等。
牛奶是人類長久以來的主要營養(yǎng)來源之一，來源豐富，價格便宜，安全可靠，長期服用無毒付作用，從牛奶中制備具有明確調節(jié)免疫功能，對抗腫瘤的天然營養(yǎng)劑容易推廣和普及。
歐洲專利(EP-AO 253395)公布的技術中，介紹了從牛奶中制備乳鐵旦白，但該項技術不適合大規(guī)模工業(yè)化制備，也未提及從牛奶中制備活性多肽。
本發(fā)明所要解決的技術問題是，同時從牛奶中制備乳鐵旦白和活性多肽，并應用于調節(jié)人體免疫功能，對抗腫瘤。

發(fā)明內容
本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案，其特征是，以牛初乳、牛奶、乳漿及其相關產品作為原材料，分別制備乳鐵旦白和活性多肽。其程序和方法是，離心方法脫脂，用酸劑調PH至4.7～4.8并加熱凝固酪旦白，用離心或過濾方式收獲酪旦白，上清液過陽離子交換樹脂裝置的層析柱吸附乳鐵旦白，用緩沖鹽溶液洗脫乳鐵旦白，除鹽后冷凍干燥成乳鐵旦白粉；通過層析柱的乳清液體用分子量為30,000～40,000D的超微濾膜過濾分離乳清旦白，收集超濾濃縮的旦白與酪旦白合并，采用復合旦白酶水解后，用分子量為10,000D的超微濾膜過濾分離后噴霧干燥成活性多肽粉。單獨應用乳鐵旦白粉或活性多肽粉，或者兩者聯(lián)合應用，制備多種形式食品或藥劑以調節(jié)人體免疫功能，對抗腫瘤。
制備乳鐵旦白和活性多肽所用的牛奶類原料，可以是牛初乳、牛奶，也可以是制備奶酪的付產品乳漿，或者以乳漿為原料制備的乳漿粉、乳漿濃縮旦白粉(WPC)、乳漿旦白分離粉(WPI)，為了保持其生物活性，最好選用的原料是未被高溫處理過的，巴氏消毒的溫度最好不要超過72℃持續(xù)15分鐘，或者63℃持續(xù)30分鐘，否則大部份生物活性物質(乳鐵旦白)的生物活性將會喪失，最理想的原料是牛初乳，但是由于牛初乳來源相對較少，大規(guī)模工業(yè)化生產時，采用牛奶作為原料，也是一種可行的選擇。
本發(fā)明的技術特征是，收集的牛奶需經過脫脂程序去除牛奶中脂肪，通常采用已知的離心方式脫脂，脫脂牛初乳或牛奶內加入酸劑調節(jié)PH值至4.6～4.8，加熱30℃～40℃持續(xù)20～30分鐘凝固酪旦白，已凝聚的酪旦白通過離心方式收集或通過濾布過濾的方法收集備用。
本發(fā)明的技術特征是，已經脫脂和去除酪旦白的乳清液體通過陽離子交換樹脂灌裝的層析柱，當液體以較高的表面速度和以較高的液體過柱率通過層析柱時，陽離子交換樹脂吸附乳鐵旦白，在過柱過程結束后，用鹽溶液洗脫吸附在陽離子交換樹脂上的旦白質，濃縮洗脫物后干燥，即可制備乳鐵旦白的粉狀物質。
本發(fā)明的技術特征是，可采用多種類型的陽離子交換樹脂，但最好是采用在高壓高流速狀況下仍然能保持物理機械穩(wěn)定性能的產品，例如瓊脂糖凝膠(制藥等級)，就符合上述條件，選擇的陽離子交換樹脂顆粒大小范圍是100.mu.m～300.mu.m，最好范圍是125.mu.m～150.mu.m，在吸收時能提供較高表面速率。
本發(fā)明的技術特征是，離子交換樹脂最好首先用PH6.5的磷酸緩沖液(0.025molNa.sub2 PHO.sub.4/NaH.sub2 PO.sub.4)，大約采用4倍床容量的緩沖液沖洗層析柱足以平衡，在牛初乳、牛奶或乳漿通過層析柱后，乳鐵旦白被吸附在陽離子交換樹脂上，這時再用緩沖鹽溶液沖洗層析柱可洗脫已吸附的物質，洗脫層析柱的緩沖液濃度大約0.7～1.5mol NaCL，洗脫液可以除鹽，也可以直接干燥，除鹽方式包括離子交換、電透析或超濾，超濾是最首選的除鹽方式，除鹽后洗脫液采用冷凍干燥方法制備乳鐵旦白干粉備用。
本發(fā)明的技術特征是，收集已通過層析柱的乳清液，采用交錯切面流體超濾裝置，應用分子量為30,000～40,000D的超微濾膜進行過濾分離，分離小分子的乳糖、礦物質、殘余脂肪，超濾濃縮物中含有多種旦白質，包括β-乳球旦白、α-乳白旦白、免疫球旦白等，收集超濾濃縮物進一步處理。
本發(fā)明的技術特征是，合并收集已凝固沉淀的酪旦白和超濾分離的乳清旦白，加堿液(例如1N NaOH)調節(jié)PH至6.5～6.8溶解酪旦白，溶液通過稀釋或濃縮至每升液體內含旦白質10克～60克，最好是40克～60克/升，在復合旦白溶液內加入胰旦白酶和胰凝乳旦白酶的混合物，胰旦白酶量等于或大于800USP單位/mg，優(yōu)選等于或大于1000US單位/mg，最好等于或大于1800US單位/mg，胰凝乳旦白酶量等于或大于150USP單位/mg，優(yōu)選等于或大于200USP單位/mg，最好等于或大于350USP單位/mg。
本發(fā)明的技術特征是，在水解混合旦白時，胰旦白酶和胰凝乳旦白酶混合物中以上述USP單位計算的胰旦白/胰凝乳旦白酶之比約1～18，較好的選擇為1.5～12，最好的選擇為4～6，酶混合物的用量占水解旦白總量的0.4～1.2％(重量百分比)，最好是0.6～0.8％(重量百分比)。
本發(fā)明的技術特征是，水解上述旦白混合液的過程是，加熱到75℃～85℃維持10～30分鐘，降溫至30℃～50℃維持2～8小時，水解期間PH維持在6～8之間，最好是在6.5～6.8之間，在水解過程結束時，加熱至80℃～90℃，最好85℃持續(xù)10分鐘，通過熱處理使酶滅活，還可以通過超高溫滅菌(溫度130℃維持30秒)使酶滅活，旦白水解后的溶液用分子量為10,000的超微濾膜在交錯切面流體超濾設備過濾分離，去除大分子、未水解的旦白，超濾液直接噴霧干燥成為活性多肽粉。
本發(fā)明的技術特征是，制備乳鐵旦白和活性多肽還可以采用另一種改良的方法，即省略酪旦白凝集程序，將脫脂的牛初乳或牛奶直接用分子量為30,000～40,000D的超微濾膜分離小分子量的乳糖、礦物質、脂溶性成份后，直接過層析柱吸附乳鐵旦白，而通過層析柱的液體直接進行旦白水解程序，分離乳鐵旦白和旦白水解程序方法相同，在應用乳清(奶酪生產付產品)、乳清粉、乳清旦白粉等作為原料時，也應采用這一程序和方法制備乳鐵旦和活性多肽。
本發(fā)明的技術特征是，采用本發(fā)明方法制備的乳鐵旦白和活性多肽既可以各自單獨應用于調節(jié)人體免疫功能、對抗腫瘤，也可以聯(lián)合應用，最好是兩者聯(lián)合應用，發(fā)揮互補作用，聯(lián)合應用時，既可以單一制劑聯(lián)合服用，也可以兩種成份制備成復合制劑服用。
本發(fā)明的技術特征是，本發(fā)明方法制備的乳鐵旦白和活性多肽，可以應用于多種增強人體免疫功能和對抗腫瘤的天然營養(yǎng)劑中，可以讓腫瘤高危人群或有腫瘤家族史的人群服用，調節(jié)免疫功能，預防腫瘤，也可以施用于結腸癌、前列腺癌、胃癌及其他消化道腫瘤、乳腺癌、皮膚癌等多種癌癥患者，應用各類已手術切除后進行化療、放療的癌癥患者，增強免疫功能，發(fā)揮對抗腫瘤的協(xié)同作用。
本發(fā)明的技術特征是，本發(fā)明方法制備的調節(jié)人體免疫功能和對抗腫瘤的乳鐵旦白和活性多肽，可以制備成多種食物形式或者藥物形式施用，主要的應用方式為口服，可以直接以干粉形式用水沖服或以濃縮液形式直接服用，也可以作為食品添加劑添加在食品中進行施用，包括但不限于，奶粉、煉乳、速溶沖劑、速溶茶、餅干、糕點、糖果、蜂蜜等食品形式；也可以與各種醫(yī)藥等級輔料混合和制備各種藥劑形式施用，包括但不限于，片劑、膠囊、丸劑、散劑、顆粒劑、沖劑、乳劑、軟膠囊、口服液、噴劑等藥劑形式。
本發(fā)明的有益效果是，從天然原料中同時制備多種調節(jié)人體免疫功能、對抗腫瘤的天然營養(yǎng)劑，可以長期服用，無毒付作用，在有效對抗腫瘤細胞的同時增強人體免疫功能。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明實施例1從牛初乳中制備乳鐵旦白和活性多肽收集母牛分娩后三天內的牛初乳15升，采用離心方式脫脂，離心速度5000轉/分，離心時間20分鐘，脫脂牛初乳通過交錯切面流體分離過濾裝置(Pall公司生產TFF裝置)，選擇超微濾膜分子量為40,000D，收集殘余濃縮物準備過層析柱。
采用10cm自動控制生產的層析儀(Bioprocess system pharmacia)，裝置瓊脂糖凝膠陽離子交換樹酯(SP Sepharose Big Beadsion exchanger)，層析柱直徑為10cm，床高度為11cm，床容量為0.864升。
在室溫下，用3.2升0.025M，PH6.5磷酸緩沖液對層析柱進行平衡，超濾濃縮物用泵抽方式，以180升/小時的流速通過層析柱，表面速度約2300cm/小時，過柱速率約208床容量/小時。
用1.0M NaCL緩沖液沖洗，沖洗液量為2.2升，獲得乳鐵旦白洗脫液，兩種洗脫液分別用10,000D的超微濾膜超濾除鹽濃縮后冷凍干燥，得到乳鐵旦白干粉。
收集過層析柱的牛初乳，加熱旦白溶液至50℃溶解而達到4～6％的旦白質濃度，加溫至75℃下保持30分鐘，降溫至50℃時加入胰旦白酶和胰凝乳旦白酶混合物，酶混合物重量占旦白總重量0.8％(胰旦白酶為1800USP單位/mg，胰凝乳旦白酶為350USP單位/mg，購自Novo Nordisk Bioindustrids Inc.Danbury.CT.U.S.A.，胰旦白酶/胰凝乳旦白酶的USP單位之比為5)，維持溫度50℃保持6小時，PH調節(jié)在6.5，在水解結束前，向水解產物內注入130℃蒸汽45秒鐘，殺滅細菌同時使酶滅活。
已完成旦白水解過程的旦白水解液用真空泵抽入交錯切面流體超濾裝置用分子量為10,000D的超微濾膜分離過濾，收集過濾的上清液直接噴霧干燥成活性多肽干粉。
實施例2測量活性多肽分子量取實施例1制備的活性多肽粉末，用尺寸篩層析方法(SEC)，測定活性多肽分子量分布，在TSK G-2000SWXL柱中按分子尺寸將多肽分開，用UV檢測器測出214nm的吸收性，并將其與已知分子量的多肽曲線比較。
摩爾質量 ％分子量分布(g/mlo)MM＞5000 7.8％5000＞MM＞3000 13.7％3000＞MM＞2000 14.6％2000＞MM＞1000 25.8％1000＞MM＞500 18.9％MM＞50019.2％
權利要求
1.本發(fā)明涉及一種調節(jié)免疫功能、抗腫瘤的天然營養(yǎng)劑，尤其涉及一種從牛初乳、牛奶、乳漿及其相關產品中制備乳鐵旦白和生物活性多肽作為調節(jié)免疫、抗腫瘤天然營養(yǎng)劑的方法，其特征是，以牛初乳、牛奶、乳漿及其相關產品作為原材料，分別制備乳鐵旦白和活性多肽。其程序和方法是，離心方法脫脂，用酸劑調PH至4.7～4.8并加熱凝固酪旦白，用離心或過濾方式收獲酪旦白，上清液過陽離子交換樹脂裝置的層析柱吸附乳鐵旦白，用緩沖鹽溶液洗脫乳鐵旦白，除鹽后冷凍干燥成乳鐵旦白粉；通過層析柱的乳清液體用分子量為30,000～40,000D的超微濾膜過濾分離乳清旦白，收集超濾濃縮的旦白與酪旦白合并，采用復合旦白酶水解后，用分子量為10,000D的超微濾膜過濾分離后噴霧干燥成活性多肽粉。單獨應用乳鐵旦白粉或活性多肽粉，或者兩者聯(lián)合應用，制備多種形式食品或藥劑以調節(jié)人體免疫功能，對抗腫瘤。
2.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，已經脫脂和去除酪旦白的乳清液體通過陽離子交換樹脂灌裝的層析柱，當液體以較高的表面速度和以較高的液體過柱率通過層析柱時，陽離子交換樹脂吸附乳鐵旦白，在過柱過程結束后，用鹽溶液洗脫吸附在陽離子交換樹脂上的旦白質，濃縮洗脫物后干燥，即可制備乳鐵旦白的粉狀物質。
3.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，離子交換樹脂最好首先用PH6.5的磷酸緩沖液(0.025mol Na.sub2 PHO.sub.4/NaH.sub2 PO.sub.4)，大約采用4倍床容量的緩沖液沖洗層析柱足以平衡，在牛初乳、牛奶或乳漿通過層析柱后，乳鐵旦白被吸附在陽離子交換樹脂上，這時再用緩沖鹽溶液沖洗層析柱可洗脫已吸附的物質，洗脫層析柱的緩沖液濃度大約0.7～1.5mol NaCL，洗脫液可以除鹽，也可以直接干燥，除鹽方式包括離子交換、電透析或超濾，超濾是最首選的除鹽方式，除鹽后洗脫液采用冷凍干燥方法制備乳鐵旦白干粉備用。
4.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，收集已通過層析柱的乳清液，采用交錯切面流體超濾裝置，應用分子量為30,000～40,000D的超微濾膜進行過濾分離，分離小分子的乳糖、礦物質、殘余脂肪，超濾濃縮物中含有多種旦白質，包括β-乳球旦白、α-乳白旦白、免疫球旦白等，收集超濾濃縮物進一步處理。
5.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，合并收集已凝固沉淀的酪旦白和超濾分離的乳清旦白，加堿液(例如1N NaOH)調節(jié)PH至6.5～6.8溶解酪旦白，溶液通過稀釋或濃縮至每升液體內含旦白質10克～60克，最好是40克～60克/升，在復合旦白溶液內加入胰旦白酶和胰凝乳旦白酶的混合物，胰旦白酶量等于或大于800USP單位/mg，優(yōu)選等于或大于1000US單位/mg，最好等于或大于1800US單位/mg，胰凝乳旦白酶量等于或大于150USP單位/mg，優(yōu)選等于或大于200USP單位/mg，最好等于或大于350USP單位/mg。
6.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，在水解混合旦白時，胰旦白酶和胰凝乳旦白酶混合物中以上述USP單位計算的胰旦白/胰凝乳旦白酶之比約1～18，較好的選擇為1.5～12，最好的選擇為4～6，酶混合物的用量占水解旦白總量的0.4～1.2％(重量百分比)，最好是0.6～0.8％(重量百分比)。
7.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，制備乳鐵旦白和活性多肽還可以采用另一種改良的方法，即省略酪旦白凝集程序，將脫脂的牛初乳或牛奶直接用分子量為30,000～40,000D的超微濾膜分離小分子量的乳糖、礦物質、脂溶性成份后，直接過層析柱吸附乳鐵旦白，而通過層析柱的液體直接進行旦白水解程序，分離乳鐵旦白和旦白水解程序方法相同，在應用乳清(奶酪生產付產品)、乳清粉、乳清旦白粉等作為原料時，也應采用這一程序和方法制備乳鐵旦和活性多肽。
8.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，水解上述旦白混合液的過程是，加熱到75℃～85℃維持10～30分鐘，降溫至30℃～50℃維持2～8小時，水解期間PH維持在6～8之間，最好是在6.5～6.8之間，在水解過程結束時，加熱至80℃～90℃，最好85℃持續(xù)10分鐘，通過熱處理使酶滅活，還可以通過超高溫滅菌(溫度130℃維持30秒)使酶滅活，旦白水解后的溶液用分子量為10,000的超微濾膜在交錯切面流體超濾設備過濾分離，去除大分子、未水解的旦白，超濾液直接噴霧干燥成為活性多肽粉。
9.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，本發(fā)明方法制備的乳鐵旦白和活性多肽，可以應用于多種增強人體免疫功能和對抗腫瘤的天然營養(yǎng)劑中，可以讓腫瘤高危人群或有腫瘤家族史的人群服用，調節(jié)免疫功能，預防腫瘤，也可以施用于結腸癌、前列腺癌、胃癌及其他消化道腫瘤、乳腺癌、皮膚癌等多種癌癥患者，應用各類已手術切除后進行化療、放療的癌癥患者，增強免疫功能，發(fā)揮對抗腫瘤的協(xié)同作用。
10.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，本發(fā)明方法制備的調節(jié)人體免疫功能和對抗腫瘤的乳鐵旦白和活性多肽，可以制備成多種食物形式或者藥物形式施用，主要的應用方式為口服，可以直接以干粉形式用水沖服或以濃縮液形式直接服用，也可以作為食品添加劑添加在食品中進行施用，包括但不限于，奶粉、煉乳、速溶沖劑、速溶茶、餅干、糕點、糖果、蜂蜜等食品形式；也可以與各種醫(yī)藥等級輔料混合和制備各種藥劑形式施用，包括但不限于，片劑、膠囊、丸劑、散劑、顆粒劑、沖劑、乳劑、軟膠囊、口服液、噴劑等藥劑形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種調節(jié)免疫功能、抗腫瘤的天然營養(yǎng)劑，尤其涉及一種從牛初乳、牛奶、乳漿及其相關產品中制備乳鐵蛋白和生物活性多肽作為調節(jié)免疫、抗腫瘤天然營養(yǎng)劑的方法及應用。
文檔編號C12P21/00GK1557482SQ20041001610
公開日2004年12月29日 申請日期2004年2月4日 優(yōu)先權日2004年2月4日
發(fā)明者高春平 申請人:高春平