專(zhuān)利名稱(chēng)：用于皮膚角質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的無(wú)血清培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種培養(yǎng)基，尤其涉及一種用于從皮膚組織分離得到的表皮角質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的化學(xué)成分明確的無(wú)血清培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
皮膚燒傷患者和其它皮膚病患者以前都是通過(guò)自體皮膚移植或尸體皮膚移植，皮膚來(lái)源十分有限。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，目前可以用組織工程的方法體外構(gòu)建人工皮膚，從而解決皮膚來(lái)源的問(wèn)題。
皮膚組織構(gòu)建需要大量的種子細(xì)胞，其中表皮角質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)是一個(gè)難點(diǎn)。角質(zhì)細(xì)胞是一種定向干細(xì)胞，在體外培養(yǎng)過(guò)程中很容易衰老并分化，從而影響細(xì)胞增殖；其次由于生長(zhǎng)環(huán)境的改變，從皮膚組織分離得到的角質(zhì)細(xì)胞在體外失去了體內(nèi)的三維環(huán)境，失去了多種細(xì)胞的支持和協(xié)同作用，加之目前的體外培養(yǎng)環(huán)境很難模擬細(xì)胞體內(nèi)生存環(huán)境，因此難以獲得大量種子細(xì)胞。所以在體外培養(yǎng)過(guò)程中如何調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)環(huán)境、延緩角質(zhì)細(xì)胞的分化和衰老，使之在體外擴(kuò)增更多的倍數(shù)是角質(zhì)細(xì)胞體外大規(guī)模擴(kuò)增需要解決的“瓶頸”問(wèn)題。
自1975年Rheinwald和Green體外培養(yǎng)角質(zhì)細(xì)胞獲得成功以來(lái)，研究和開(kāi)發(fā)了一系列用于角質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的培養(yǎng)系統(tǒng)和培養(yǎng)基，但這些培養(yǎng)系統(tǒng)大都需要以3T3細(xì)胞作為滋養(yǎng)層[Rheinwald，J.G.，et al.，Nature，265，p.421-424(1977)]，或在培養(yǎng)皿底部預(yù)鋪胞外基質(zhì)[Gilchrest，J.CellPhysiol.112，p.197-206(1982)]，而培養(yǎng)基中往往要添加血清和化學(xué)成分不明確的蛋白(如牛腦垂體抽提物、霍亂毒素等)[Johnson，E.W，et al.，Invitro Cell.Dev.Biol.28(A)，p.429-435(1992)；Auger，F(xiàn).A.，et al.，In vitro Cell.Dev.Biol.31，p.432-439(1995)]，以支持和刺激角質(zhì)細(xì)胞貼壁、生長(zhǎng)以及保持正常的細(xì)胞形態(tài)和蛋白分泌能力。但是用這些培養(yǎng)系統(tǒng)和培養(yǎng)基培養(yǎng)的角質(zhì)細(xì)胞在基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用中存在種種問(wèn)題培養(yǎng)基中添加血清，一方面造成成纖維細(xì)胞的污染，影響角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)，加速角質(zhì)細(xì)胞分化，另一方面由于血清和成分不明的蛋白的存在，對(duì)細(xì)胞生物學(xué)、毒理學(xué)、病理學(xué)等基礎(chǔ)研究(如研究細(xì)胞因子、藥物對(duì)角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的影響等)形成干擾；同時(shí)采用上述培養(yǎng)系統(tǒng)和培養(yǎng)基構(gòu)建的人工皮膚組織進(jìn)行體內(nèi)移植，可能引起免疫反應(yīng)或引入不安全因素(如病毒或其它病原體等)，因此需要開(kāi)發(fā)化學(xué)成分明確的無(wú)血清培養(yǎng)基。
為了開(kāi)發(fā)一種無(wú)需添加不確定成分的補(bǔ)充物，且能支持角質(zhì)細(xì)胞克隆形成、生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，人們研究了各種基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量元素、多種激素和生長(zhǎng)因子等對(duì)角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，在199、F12等培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，通過(guò)優(yōu)化克隆生長(zhǎng)來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的組成，構(gòu)成了新的培養(yǎng)基MCDB151，在此培養(yǎng)基中補(bǔ)充1.0mg/mL胎牛血清蛋白(大分子蛋白)后能支持人的表皮角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)，但飼養(yǎng)層技術(shù)對(duì)于原代培養(yǎng)仍是必需的，且傳代培養(yǎng)的克隆形成率較低[Peehl，D.M.，et al.，In Vitro，Vol.16(6)，pp.526-538(1980)]。
此后，文獻(xiàn)[Tsao，M.C.，et al.，J.Cell.Physiol.，110，pp.219-229(1982)]報(bào)道，在MCDB151中添加微量元素，發(fā)明了一種新的培養(yǎng)基——MCDB152，在這種新的培養(yǎng)基中進(jìn)一步添加了表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白、氫化可的松、乙醇胺、磷酸乙醇胺、黃體酮、鎂和鍶。乙醇胺和磷酸乙醇胺的作用是代替牛腦垂體提取物。原代培養(yǎng)時(shí)，角質(zhì)細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到含有添加劑的MCDB152中，雖然培養(yǎng)基中沒(méi)有不確定的成分，角質(zhì)細(xì)胞還是能生長(zhǎng)，但不能進(jìn)一步傳代，而且克隆形成率很低，只有2％左右，得到的細(xì)胞無(wú)法冷凍并復(fù)蘇。另外在原代培養(yǎng)時(shí)仍然要求使用滋養(yǎng)層細(xì)胞。繼MCDB152后，文獻(xiàn)[Boyce，S.C.，Ham，R.G.，J.Invest.Dermatol.81，pp.33S-40S(1983)；J.Tiss.Cult.Meth.9，pp.83-93(1985)]披露了由Boyce和Ham進(jìn)一步改善其中的鈣離子濃度，并正式命名為MCDB153培養(yǎng)基，但是MCDB153也不是一個(gè)優(yōu)秀的角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，其局限性表現(xiàn)在繁殖和擴(kuò)增細(xì)胞的能力有限，如果角質(zhì)細(xì)胞在MCDB153中生長(zhǎng)至完全匯合，則將快速喪失其傳代能力。
由于在無(wú)血清培養(yǎng)基組成方面存在嚴(yán)重不足，因此在利用這些培養(yǎng)基培養(yǎng)角質(zhì)細(xì)胞時(shí)，不得不添加透析過(guò)的血清、腦垂體抽提物、霍亂毒素或使用生長(zhǎng)基質(zhì)等，難以真正實(shí)現(xiàn)角質(zhì)細(xì)胞體外無(wú)血清培養(yǎng)，細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中容易發(fā)生老化，從而影響細(xì)胞的大量擴(kuò)增。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是公開(kāi)一種用于皮膚角質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的無(wú)血清培養(yǎng)基，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。
本發(fā)明的構(gòu)思一種培養(yǎng)基是由各種營(yíng)養(yǎng)成分包括氨基酸、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽、維生素、激素、生長(zhǎng)因子、微量元素等眾多成分組成，在培養(yǎng)過(guò)程中任何一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗竭都會(huì)限制細(xì)胞生長(zhǎng)，情況嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但是如果營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過(guò)剩，在培養(yǎng)環(huán)境中也會(huì)積累大量副產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，并引起細(xì)胞死亡，因此要求培養(yǎng)基中各種營(yíng)養(yǎng)成分必須均衡，以滿(mǎn)足細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝和維持功能的需求。
角質(zhì)細(xì)胞屬于一種干細(xì)胞，在體外培養(yǎng)過(guò)程中很容易分化和衰老，影響細(xì)胞大量擴(kuò)增，培養(yǎng)基中的各種成分對(duì)細(xì)胞老化有很大影響，因此在角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中添加一些延緩細(xì)胞老化、促進(jìn)細(xì)胞增殖的成分，可延長(zhǎng)細(xì)胞在體外的培養(yǎng)時(shí)間并提高增殖能力。例如氧化損傷是導(dǎo)致細(xì)胞衰老的一個(gè)重要因素，在現(xiàn)有的角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中都沒(méi)有添加抗氧化劑[US Pat.No.5712163，US Pat.No.4940666]，本發(fā)明通過(guò)添加抗氧化劑，一定程度上延緩了角質(zhì)細(xì)胞的衰老，使之在體外擴(kuò)增更多的倍數(shù)。
本發(fā)明用于皮膚角質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的無(wú)血清培養(yǎng)基，其特征在于此無(wú)血清培養(yǎng)基為一種水溶液，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和以下的組分基礎(chǔ)培養(yǎng)基12-18g/L組氨酸0.1-1.0mmol/L異亮氨酸 0.1-0.6mmol/L色氨酸0.05-0.3mmol/L苯丙氨酸 0.3-0.6mmol/L賴(lài)氨酸0.7-1.2mmol/L甲硫氨酸 0.05-0.3mmol/L酪氨酸0.3-0.6mmol/L角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子 20-200ng/L和/或表皮生長(zhǎng)因子5-20ng/L泛酸鹽0.02-0.04mmol/L氯化膽堿 0.1-0.5mmol/L葉酸 0.01-0.03mmol/L肌糖 0.1-0.4mmol/L煙酰胺0.05-0.5mmol/L維生素B6 0.02-0.06mmol/L核黃素0.001-0.01mmol/L硫胺 0.01-0.03mmol/L胰島素1-20μg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白 1-20μg/L乙醇胺0.01-0.05mmol/L磷酸乙醇胺0.01-0.05mmol/L氯化鍶1-5mmol/L
牛血清白蛋白 5-20μg/L氫化可的松0.1-1μg/L三碘甲狀腺胺 10-40pmol/L氯化鈣0.03-0.5mmol/L氯化鎂5-10mmol/L抗氧化劑 適量青霉素50-200U/L鏈霉素50-200U/L所說(shuō)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括MCDB153、無(wú)鈣DMEM或無(wú)鈣DMEM與Ham′s F12以體積比為1∶0.3～3的混合物。
所說(shuō)的抗氧化劑包括巰基乙醇0.01-0.05mmol/L和/或過(guò)氧化氫酶50-150U/L和/或超氧化物歧化酶50-150U/L和/或亞硒酸鈉0.01-0.05mmol/L；所說(shuō)的MCDB153在文獻(xiàn)[Boyce，S.C.，Ham，R.G.，J.Invest.Dermatol.81，pp.33S-40S(1983)；J.Tiss.Cult.Meth.9，pp.83-93(1985)]和SIGMA公司的產(chǎn)品目錄中已有公開(kāi)報(bào)道；所說(shuō)的無(wú)鈣DMEM在SIGMA公司的產(chǎn)品目錄中已有公開(kāi)報(bào)道；所說(shuō)的Ham′s F12在SIGMA公司的產(chǎn)品目錄中已有公開(kāi)報(bào)道；本發(fā)明的培養(yǎng)基的制備方法是十分容易的，將所述及的組分在常溫下攪拌，溶解混合均勻，經(jīng)0.2μm過(guò)濾膜過(guò)濾除菌后，即可用于角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)。
利用本發(fā)明的培養(yǎng)基對(duì)角質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，由于添加氨基酸、維生素、激素、生長(zhǎng)因子、微量元素和抗氧化劑，不需要滋養(yǎng)層細(xì)胞，也無(wú)需在培養(yǎng)瓶底部預(yù)鋪膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)幫助角質(zhì)細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)，同時(shí)在一定程度上促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞增殖，延緩細(xì)胞衰老，使之在體外擴(kuò)增更多的倍數(shù)。


圖1為原代培養(yǎng)至匯合角質(zhì)細(xì)胞。
圖2比較了鼠角質(zhì)細(xì)胞在本發(fā)明的無(wú)血清培養(yǎng)基和傳統(tǒng)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1以MCDB153作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其組分如下(以1L計(jì))MCDB153 17.61g組氨酸 0.3mmol異亮氨酸0.6mmol色氨酸 0.2mmol苯丙氨酸0.3mmol賴(lài)氨酸 0.7mmol甲硫氨酸0.2mmol酪氨酸 0.3mmol氯化鈣 0.1mmol氯化鎂 5mmol角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子100ng泛酸鹽 0.021mmol氯化膽堿0.171mmol葉酸0.024mmol肌糖0.211mmol煙酰胺 0.082mmol維生素B60.049mmol核黃素 0.003mmol
硫胺0.03mmol牛胰島素5μg轉(zhuǎn)鐵蛋 10μg乙醇胺 0.05mmol氯化鍶 1mmol牛血清白蛋白10μg氫化可的松 0.1μg三碘甲狀腺胺40pmol巰基乙醇0.05mmol青霉素100U鏈霉素100U將上述組分溶解在1L水中，攪拌混合，即為本發(fā)明所說(shuō)的培養(yǎng)基。經(jīng)0.2μm過(guò)濾膜過(guò)濾除菌后，可用于角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)。
實(shí)施例2取新生1天的SD大鼠皮膚或人的包皮，剪成1cm2左右的皮膚塊，用含有200U/mL慶大霉素的PBS清洗3遍，75％酒精清洗2遍，再用PBS清洗2遍。將皮膚組織加入到200U/mL的中性蛋白酶中，4℃消化18hr，使真皮和表皮分離，然后將表皮剪碎，用0.025％的胰酶/0.02％EDTA共6mL作用5min，2000rpm離心5min，并加10mg/mL大豆胰酶抑制劑2-3mL中和胰酶活性。150目篩網(wǎng)過(guò)濾，除去皮膚碎塊。2000rpm離心5min，倒去上清，PBS清洗2遍，加入實(shí)施例1的角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基。細(xì)胞接種量為2×104cells/cm2，每個(gè)25cm2的培養(yǎng)瓶中加培養(yǎng)基5mL，在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每三天換液一次。角質(zhì)細(xì)胞經(jīng)7-10天長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底部70％-80％后，可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。附圖1是利用本發(fā)明的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)原代角質(zhì)細(xì)胞至匯合的照片。
實(shí)施例3原代培養(yǎng)后的角質(zhì)細(xì)胞加3mL 0.025％胰酶/0.02％EDTA進(jìn)行消化，當(dāng)細(xì)胞變圓、脫落后2000rpm離心5min，棄消化液，加入2-3mL 10mg/mL大豆胰酶抑制劑中和胰酶活性。2000rpm離心5min后倒去上清，PBS清洗兩遍，以2×104cells/mL接種量接種，每個(gè)培養(yǎng)瓶加入本發(fā)明所涉及的無(wú)血清培養(yǎng)基5mL，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。附圖2比較了鼠角質(zhì)細(xì)胞在本發(fā)明的無(wú)血清培養(yǎng)基和傳統(tǒng)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。本發(fā)明的無(wú)血清培養(yǎng)基采用實(shí)施例1的培養(yǎng)基。
實(shí)施例4角質(zhì)細(xì)胞是一種分化能力比較強(qiáng)的細(xì)胞，其分化過(guò)程分成多個(gè)階段，一般把角質(zhì)細(xì)胞的交聯(lián)衣殼蛋白(Cross-linked Envelope，CE)的形成認(rèn)為是其分化的最終階段。用0.25％(w/v)胰酶溶液消化方瓶中培養(yǎng)的細(xì)胞，PBS清洗后計(jì)細(xì)胞數(shù)，然后離心棄上清液，加入5mL含有1％十二烷基硫酸鈉(SDS)、20mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)的PBS溶液，90℃水浴10分鐘，離心，計(jì)衣殼蛋白數(shù)。角質(zhì)細(xì)胞衣殼蛋白比例＝(衣殼蛋白個(gè)數(shù)/總的細(xì)胞數(shù))×100％。衰老的角質(zhì)細(xì)胞可以通過(guò)β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性來(lái)判別。在每代的培養(yǎng)末期，細(xì)胞用PBS緩沖液洗兩遍，然后在室溫下用3％的福爾馬林固定 分鐘。再用PBS緩沖液和雙蒸水清洗，加入新鮮配制的 半乳糖苷酶染色液1mg/mL X-Gal，40mM檸檬酸，12mM磷酸鈉，5mM亞鐵氰化鉀，5mM鐵氰化鉀，150mM氯化鈉，2mM氯化鎂，在37℃下過(guò)夜。計(jì)數(shù)細(xì)胞中藍(lán)色細(xì)胞的比例，每個(gè)樣品中最少計(jì)數(shù)700個(gè)細(xì)胞，衰老細(xì)胞的比例就是藍(lán)色細(xì)胞占總細(xì)胞量的比例。附表1比較了人皮膚角質(zhì)細(xì)胞在實(shí)施例1的無(wú)血清培養(yǎng)基和傳統(tǒng)培養(yǎng)基中的分化和老化情況。
表1.人皮膚角質(zhì)細(xì)胞在本發(fā)明的無(wú)血清培養(yǎng)基和傳統(tǒng)培養(yǎng)基中的分化和老化情況培養(yǎng)基衰老細(xì)胞比例(％) 分化細(xì)胞比例(％)傳統(tǒng)的無(wú)血清培養(yǎng)基 48±539±1實(shí)施例1的培養(yǎng)基 33±328±2傳統(tǒng)的無(wú)血清培養(yǎng)基采用[Yang，E.K.，et al.，Artificial Organs，24(1)，pp7-17(2000)；Hansbrough，J.F.，Epidermal Cells.InRicordi，C.，eds.Methods in cell transplantation.AustinR.G.Landes Company Press，pp111-121(1995)]文獻(xiàn)公開(kāi)的角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基。
權(quán)利要求
1.用于皮膚角質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的無(wú)血清培養(yǎng)基，其特征在于為一種水溶液，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和以下組分基礎(chǔ)培養(yǎng)基12-18g/L組氨酸0.1-1.0mmol/L異亮氨酸 0.1-0.6mmol/L色氨酸0.05-0.3mmol/L苯丙氨酸 0.3-0.6mmol/L賴(lài)氨酸0.7-1.2mmol/L甲硫氨酸 0.05-0.3mmol/L酪氨酸0.3-0.6mmol/L角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子20-200ng/L和/或表皮生長(zhǎng)因子 5-20ng/L泛酸鹽0.02-0.04mmol/L氯化膽堿 0.1-0.5mmol/L葉酸 0.01-0.03mmol/L肌糖 0.1-0.4mmol/L煙酰胺0.05-0.5mmol/L維生素B6 0.02-0.06mmol/L核黃素0.001-0.01mmol/L硫胺 0.01-0.03mmol/L胰島素1-20μg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白 1-20μg/L乙醇胺0.01-0.05mmol/L磷酸乙醇胺0.01-0.05mmol/L氯化鍶1-5mmol/L午血清白蛋白 5-20μg/L氫化可的松0.1-1μg/L三碘甲狀腺胺 10-40pmol/L氯化鈣0.03-0.5mmol/L氯化鎂5-10mmol/L抗氧化劑 適量青霉素50-200U/L鏈霉素50-200U/L
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于皮膚角質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的無(wú)血清培養(yǎng)基，其特征在于，所說(shuō)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括MCDB153、無(wú)鈣DMEM或無(wú)鈣DMEM與Ham′s F12體積比為1∶0.3～3的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于皮膚角質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的無(wú)血清培養(yǎng)基，其特征在于，所說(shuō)的抗氧化劑包括巰基乙醇0.01-0.05mmol/L和/或過(guò)氧化氫酶50-150U/L和/或超氧化物歧化酶50-150U/L和/或亞硒酸鈉0.01-0.05mmol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于皮膚角質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的無(wú)血清培養(yǎng)基，其特征在于，所說(shuō)的抗氧化劑包括巰基乙醇0.01-0.05mmol/L和/或過(guò)氧化氫酶50-150U/L和/或超氧化物歧化酶50-150U/L和/或亞硒酸鈉0.01-0.05mmol/L。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于皮膚角質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的無(wú)血清培養(yǎng)基。本發(fā)明通過(guò)添加氨基酸、維生素、激素、生長(zhǎng)因子、微量元素和抗氧化劑，可在一定程度上促進(jìn)細(xì)胞增殖，延緩角質(zhì)細(xì)胞的衰老，使之在體外擴(kuò)增更多的倍數(shù)。利用本發(fā)明的培養(yǎng)基對(duì)角質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，不需要滋養(yǎng)層細(xì)胞，也無(wú)需在培養(yǎng)瓶底部預(yù)鋪膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)幫助角質(zhì)細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)C12N5/02GK1560235SQ20041001636
公開(kāi)日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2004年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月17日
發(fā)明者譚文松, 周燕, 朱宏慶, 華平 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)