專利名稱：可變鹽單胞菌高抗草苷膦的epsp合酶及其編碼序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物學領域，具體地說，本發(fā)明涉及從一株分離自草甘膦極端污染環(huán)境土壤的可變鹽單胞菌(Halomonas variabilis)中克隆5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)基因及獲得其蛋白產物。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。本發(fā)明的多肽是一種具有抗草甘膦抗性的酶。
背景技術：
草甘膦(Glyphosate)為內吸傳導型、廣譜滅生性除草劑，其作用機制是通過抑制植物體內5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)活性，干擾植物體內芳香族氨基酸的生物合成，導致植物死亡。
應用化學誘變細菌產生的aroA突變體，抗藥性機理研究確證了aroA基因是草甘膦作用靶標EPSP合酶的編碼基因。近年來包括美國和中國在內的國家草甘膦產量急劇增加還與系列轉基因抗草甘膦品種的選育和大面積的推廣有直接的關系。美國Mosanto和Calegene等公司在EPSP合酶的編碼基因aroA及其抗草甘膦轉基因植物等方面已申請了100余份專利，獲得轉基因抗草甘膦大豆、玉米、油菜、甜菜和棉花等作物系列品種，其中大豆等多種轉基因作物已進入商品化生產。
我國在轉基因抗草甘膦作物方面的研究已取得一定進展，但目前尚無轉抗草甘膦基因作物進入商品化階段的報道。同時，由于沒有配套出口轉基因抗除草劑種子的優(yōu)勢和抗草甘膦基因專利，與國外大公司在市場銷售競爭中處于極為不利的地位。
因此，本領域迫切需要開發(fā)新的抗草甘膦的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種新的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(簡稱為“EPSP合酶”)以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途，尤其是在提高植物抗草甘膦抗性方面的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的EPSP合酶多肽，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個(較佳地1-20個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼上述EPSP合酶多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2或3所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中1-1347位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1350位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養(yǎng)上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有活性的多肽。在本發(fā)明的第五方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第六方面，提供了一種改變植物抗草甘膦抗性的方法，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有EPSP合酶DNA編碼序列，所述的EPSP合酶選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使EPSP合酶DNA編碼序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入EPSP合酶DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；
(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
具體實施例方式
本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，首次從草甘膦極端污染環(huán)境土壤樣品分離鑒定的可變鹽單胞菌中克隆獲得了新的EPSP合酶，并且通過實驗證實了它具有高抗草甘膦抗性，并且轉入植物后，可導致植物抗草甘膦抗性的提高。在此基礎上完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明中，術語“EPSP合酶”、“EPSP多肽”或“5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶”可互換使用，都指具有5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶EPSPS氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的EPSP合酶。
如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的EPSP合酶或多肽”是指EPSP多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化EPSP合酶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據(jù)重組生產方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括EPSP合酶的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然EPSP合酶相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列)。根據(jù)本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術語“EPSP多肽”指具有EPSP合酶活性的SEQ ID NO2序列的多肽。該術語還包括具有與EPSP合酶相同功能的、SEQ ID NO2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括EPSP合酶的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與EPSPS DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗EPSP多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含EPSP多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了EPSP多肽的可溶性片段。通常，該片段具有EPSP多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供EPSP合酶或多肽的類似物。這些類似物與天然EPSP多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到。
在本發(fā)明中，“EPSP合酶保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產生。
表1

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼EPSP合酶的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發(fā)明的EPSPS核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂萌斯ず铣伞CR擴增法、或重組法的方法獲得。例如首先根據(jù)SEQ ID NO1的序列進行全序列合成。
對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用人工合成的EPSPS核苷酸全長序列或其片段作為模板，擴增而得有關序列。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段和衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或EPSP合酶編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的EPSP多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼EPSP多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發(fā)明中，EPSP合酶多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體?？傊灰茉谒拗黧w內復制和穩(wěn)定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含EPSP合酶編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。轉化植物也可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法。對于轉化的植物細胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得抗草甘膦抗性提高的植物。
獲得的轉化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群螅煤线m的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
另一方面，本發(fā)明還包括對EPSP合酶DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。較佳地，指那些能與EPSP合酶基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結合并抑制EPSP合酶的分子，也包括那些并不影響EPSP合酶功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的EPSP合酶基因產物結合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段、或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的EPSP合酶基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達EPSP合酶或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備。本發(fā)明的各類抗體可以利用EPSP合酶基因產物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與EPSP合酶基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得?？笶PSP合酶的抗體可用于檢測樣品中的EPSP合酶。
多克隆抗體的生產可用EPSP合酶或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測EPSP合酶水平的測試方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。
一種檢測檢測樣品中是否存在EPSP合酶的方法是利用EPSP合酶的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與EPSP合酶特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在EPSP合酶。
本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于基因的表達分析。用EPSP合酶特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測EPSP合酶的轉錄產物。
在本發(fā)明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是根據(jù)測序結果人工全合成的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長為1350個堿基，其開放讀框位于1-1347位，編碼全長為449個氨基酸的EPSP合酶(SEQ ID NO2)。
本發(fā)明的EPSP合酶具有如下特性A)草苷膦抗性功能明確，且顯示了高于以前報道5-10倍的抗草苷膦能力；B)結構新，在核酸水平上與已見報道的EPSP合酶編碼基因無任何同源性，在氨基酸水平上與Monsanto公司專利報道的根瘤農桿菌CP4的同源性為44％，且不含有專利保護序列和突變位點。
EPSP合酶為改變植物的抗草甘膦抗性提供了新的途徑，因而具有巨大的應用前景?？梢酝ㄟ^將EPSP合酶的編碼基因導入，改變現(xiàn)有優(yōu)良農作物品種的抗草甘膦抗性，可獲得抗草甘膦的小麥、水稻或其它農作物品種，解決農業(yè)生產中存在的實際問題。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1高抗草苷膦的DNA片段克隆1、草苷膦極端污染環(huán)境中土壤樣品的采集自然環(huán)境中特別是在長期使用草甘膦等除草劑地區(qū)的土壤中，存在種類繁多的能耐受草甘膦或其它除草劑的細菌菌株。從被50％左右草苷膦污染達十年以上的土壤中(河北奇峰化工有限公司草甘膦生產工廠開放式分裝點)采集樣品。
2、從草苷膦極端污染土壤樣品中分離鑒定可變鹽單胞菌樣品接種在草苷膦終濃度(100mmol/L，200mmol/L，300mmol/L，350mmol/L，400mmol/L，450mmol/L，500mmol/L，550mmol/L，600mmol/L，650mmol/L，700mmol/L，800mmol/L，900mmol/L，1000mmol/L)的MOPs液體培養(yǎng)基中，30℃，200r/min搖瓶振蕩培養(yǎng)2d，稀釋菌液，然后在草苷膦濃度為200mmol/L的MOPs固體培養(yǎng)基上涂板，挑取單菌落反復劃線純化后接種在LB固體培養(yǎng)基上。對篩選出的單一菌株進行細菌形態(tài)、生理生化綜合特征表型鑒定。
提取細菌總DNA，以DNA為模板，用引物F275′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′(SEQ ID NO3)，引物R1492 5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID NO4)，PCR擴增出16SrDNA。產物經純化，用pGEM-Teasy連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。16SrDNA測序由上?；倒就瓿?。將測序結果用BLAST軟件與Genebank中16SrDNA序列進行同源性比較，并用DNAMAN V4軟件的Multiple Sequence Alignment進行同源性分析。
菌株為革蘭氏陰性菌，細胞呈桿狀，無芽孢。將菌株的16SrDNA序列在Genebank中進行同源性檢索，結果發(fā)現(xiàn)，在最相近的100個序列中，有48個為可變鹽單胞菌屬細菌，同源性為95-99％，所篩選的菌株與Halomonas variabilis的16SrDNA的同源性達99％，初步鑒定為Halomonas variabilis。
3、可變鹽單胞菌總DNA粘粒文庫的構建粘粒文庫的構建按Stratagene公司說明書進行；DNA片段用Clontech公司的Gel-extract Kit純化。菌株染色體DNA用Sau3AI部分酶切，回收30-40kb的片段，去磷酸化；與經Xba I酶切，去磷酸化，再用Bam I酶切的Super Cosl Cosmid載體(Stratagene公司)相連，噬菌體蛋白Gigapack packing包裝轉染大腸桿菌JM109，將轉染后的細胞涂板在Amp 100μg/ml LB平板上。
4、篩選草甘膦抗性轉化子從Amp 100μg/ml LB平板上挑單菌落，劃板在草苷膦濃度20mmol/L的MOPs培養(yǎng)基固體平板上，篩選得到陽性克隆?？寺∑斡肊coRI消化，與經EcoRI酶切pACYC184載體(ATCC 37033)相連，轉化JM109后，在Tc 50μg/ml和草苷膦20mmol/L雙重抗性的MOPs固體培養(yǎng)基上篩選得到8kb亞克隆片段，該片段用HindIII酶切后，與經HindIII酶切的pGEM-3zf(-)載體(Promega)相連，轉化JM109后，在Amp 100μg/ml和草苷膦20mmol/L雙重抗性的MOPs固體培養(yǎng)基上篩選得到包括3.5kb亞克隆片段的草甘膦抗性轉化子。
5.高抗草苷膦的DNA片段的亞克隆及抗性驗證為確定草苷膦抗性基因的編碼區(qū)，以3.5kb片段為模板，以引物I(5′-ctg gaa ttcatg caa cca cag gg-3′，SEQ ID NO5，含Eco RI位點))和引物II(5′-gtc cga att cgg cacgtc aaa cgt cat-3，SEQ ID NO6，含Eco RI位點))進行PCR擴增得到1.35kb EPSPs基因(SEQ ID NO1中1-1347bp)。PCR循環(huán)為94℃，5min→94℃，30sec→57℃，1min 20sec→72℃，30sec；30個循環(huán)。
將PCR產物經Eco RI酶切與經相同酶切去磷酸化的pACYC184相連，連接產物轉化JM109。在四環(huán)素50μg/ml和草苷膦10mmol/L雙重抗性的MOPs固體培養(yǎng)基上篩選得到陽性克隆。重組質粒命名為1.35-pACYC184。
1.35-pACYC184轉化JM109后在不同草苷膦濃度(0至160mmol/L)的MOPs液體培養(yǎng)基中觀察發(fā)現(xiàn)它能在草苷膦濃度為80mmol/L的MOPs液體培養(yǎng)基中很好的生長。
實施例2高抗草苷膦的DNA片段的序列分析及其EPSP合酶功能驗證1、高抗草苷膦的DNA片段的序列分析對實施例1中所亞克隆的高抗草苷膦DNA片段進行全核苷酸序列測定。分析結果表明，它有一個完整的閱讀框架，編碼EPSP合酶其序列如SEQ ID NO1所示，編碼包括終止密碼子在內的449個氨基酸的EPSP合酶(SEQ ID NO2)。
將所亞克隆的高抗草苷膦編碼序列與已報道的EPSP合酶編碼基因(aroA)比較，在核苷酸水平幾乎沒有任何同源性。
氨基酸序列同源性分析結果表明，與已知的Class I EPSP合酶(來源于大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌等)氨基酸同源性同源性并不高，與大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌來源的EPSP合酶氨基酸同源性分別為26.15％和24.84％。與Achromobacter sp.strain LBAA的EPSP合酶同源性為42.42％，與Agrobacteriumtumefaciens sp.strain CP4的EPSP合酶同源性為44.54％，與Psedomonas sp.StrainPG2982的EPSP合酶同源性為42.42％，且沒有美國專利(專利號為6,225,114和6,248,876)所保護的位點。
2、高抗草苷膦的DNA片段的EPSP合酶功能驗證序列分析結果顯示抗性克隆中含有EPSP合酶，為了證實其具有EPSP合酶活性，本實驗以大腸桿菌EPSP合酶缺陷型菌株為受體菌株，采用CaCl2法將1.35-pACYC184轉化大腸桿菌EPSPs缺陷型菌株ER2799(購自New EnglandBiolabs，Inc)，涂板在Tc 50μg/mlLB固體平板上，用牙簽點取所有的轉化子到草苷膦20mmol/L MOPs固體培養(yǎng)基上，受體菌株ER2799、含有載體質粒(pACYC184、pGEM-3zf)的ER2799為陰性對照，如抗草甘膦亞克隆含有可表達的EPSP合酶基因，互補了受體菌的缺陷，則能夠利用限制性培養(yǎng)基的無機物合成氨基酸并生長，否則就不能生長。
試驗結果表明，發(fā)現(xiàn)其在功能上與EPSP合酶缺陷型菌株互補，能在限制性培養(yǎng)基MOPs固體平板上生長，而空白質粒pACYC184及缺陷菌株都不能在MOPs固體平板上生長。說明該基因具有完整的EPSP合酶的功能。
利用pET-28a(+)(Novagen)構建含His-Tag，T7-Tag和EPSP合酶的融合蛋白，對轉入的大腸桿菌BL21裂解物進行電泳，發(fā)現(xiàn)在約51KD處有一條帶，與預測的融合蛋白分子量相符。
實施例3高抗草苷膦的EPSP合酶基因的人工合成根據(jù)測定的含1350bp編碼區(qū)的核苷酸序列，首先分8個區(qū)段分別根據(jù)正鏈和副鏈序列，分別合成出長度150-200bp、具有粘性末端的單鏈寡核苷酸片段。將正鏈和副鏈各一一對應的8個互補的單鏈寡核苷酸片段分別退火，形成8個帶有粘性末端的雙鏈寡核苷酸片段?；旌想p鏈寡核苷酸片段，經T4 DNA連接酶催化組裝成一個完整的EPSP合酶基因。經測序驗證，該合成的DNA片段含有SEQ ID NO1中1-1347位的核苷酸序列，并且合成基因的兩端含XbaI和SacI位點。
將上述人工合成的5’和3’端酶切位點為XbaI和SacI位點EPSP基因，用于下面高抗草苷膦的EPSP合酶基因植物表達載體的構建。
實施例4高抗草苷膦的EPSP合酶基因植物表達載體的構建高抗草苷膦的EPSP合酶基因植物表達載體構建的具體方法如下A.pBI121(ClonTech公司)和pCAMBIA2301(ClonTech公司)用HindIII和EcoRI雙酶切，將pBI121帶有p35S-GUS-Nos-ter的片段連入pCAMBIA2301，形成中間載體p35S-2301-GUS；B.用XbaI和SacI雙切p35S-2301-GUS和上述人工合成的EPSP基因，用EPSP置換p35S-2301-GUS相應酶切位點的GUS，從而獲得高抗草苷膦的EPSP合酶基因植物表達載體。再將其轉入農桿菌中，用于轉化模式植物煙草。
實施例5利用葉盤法轉化構建抗草苷膦的轉基因煙草(1)用無菌牙簽挑取YPE選擇平板上的實施例5中制備的陽性克隆，接種于2ML YPE液體(Sm+，Kan+)，28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24-36小時；(2)室溫下4,000g離心10分鐘；(3)棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌體的OD600在0.5左右；(4)取生長兩周左右的煙草的無菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約1cm2見方的小葉片；(5)將葉片放入制備好的菌液中，浸泡2-5分鐘，在無菌濾紙上吸干菌液；把經浸染的葉片放于MS培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)48小時；(6)將葉片轉到愈傷培養(yǎng)基(MS+6-BA 1.0mg/l+NAA 0.1mg/l+Kan50mg/l+羧芐青霉素250mg/l)上，25-28℃光照下培養(yǎng)，7-15天可見愈傷組織的形成；(7)約20天后可見分化芽長出，待芽長大后，切下，置于生根培養(yǎng)基(1/2MS+NAA 0.5mg/l+Kan 25mg/l)上進行生根培養(yǎng)，2-7天左右生根；(8)待根系發(fā)達后，將植株取出，用無菌水洗凈附著著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始幾天用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，轉移至在含10mM的草苷膦的固體培養(yǎng)基中篩選草苷膦抗性的植株。
(9)抗性植株經Southern、Northern雜交以及Westhern blot驗證為轉基因的抗性植株。
(10)用濃度為1.6％草甘膦鹽水劑噴非轉基因煙草苗，發(fā)現(xiàn)非轉基因煙草苗萎焉，而在同樣濃度下，轉EPSP基因的煙草苗卻能正常生長。為了進一步檢測轉基因煙草的抗性，采用幾個梯度的草甘膦銨鹽水劑0.25％，1％，1.6％，2.5％，5％，10％，發(fā)現(xiàn)非轉基因煙草苗在0.25％草甘膦銨鹽水劑下就不能生長，而轉基因煙草在5％草甘膦銨鹽水劑下能正常生長，而在10％草甘膦銨鹽水劑下能正常生長兩周，然后，莖部開始腐爛最后死亡。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國農業(yè)科學院生物技術研究所<120>可變鹽單胞菌高抗草苷膦的EPSP合酶及其編碼序列<130>035622<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1350<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(1347)<223>
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1350)<223>EPSP合酶<400>1atg caa cca cag ggt aaa gtt acc tat cgg gtg agt ccc ggt ggc cag48Met Gln Pro Gln Gly Lys Val Thr Tyr Arg Val Ser Pro Gly Gly Gln1 5 10 15gcg caa ggt cgc ttg cgc gtt ccg ggc gat aaa tgc atg tct cac cgt96Ala Gln Gly Arg Leu Arg Val Pro Gly Asp Lys Cys Met Ser His Arg20 25 30tcc att atg ctg ggt gct ttg gca gag ggt gtg acc gag gta aaa ggg144Ser Ile Met Leu Gly Ala Leu Ala Glu Gly Val Thr Glu Val Lys Gly35 40 45ttt ctt gaa ggt gaa gat agc ctg gca aca ctg caa gca ttc cgc gag192Phe Leu Glu Gly Glu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Gln Ala Phe Arg Glu50 55 60atg ggc gtc gct att gaa ggt cct cac cag ggg cga gtg aca atc cat240Met Gly Val Ala Ile Glu Gly Pro His Gln Gly Arg Val Thr Ile His65 70 75 80ggt gtg gga atg cat ggg ctc aaa gcg cca gct ggt cca ctt tac gtg288Gly Val Gly Met His Gly Leu Lys Ala Pro Ala Gly Pro Leu Tyr Val85 90 95
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<221>misc_feature<222>(1)..(1350)<223>EPSP合酶
<400>2Met Gln Pro Gln Gly Lys Val Thr Tyr Arg Val Ser Pro Gly Gly Gln1 5 10 15Ala Gln Gly Arg Leu Arg Val Pro Gly Asp Lys Cys Met Ser His Arg20 25 30Ser Ile Met Leu Gly Ala Leu Ala Glu Gly Val Thr Glu Val Lys Gly35 40 45Phe Leu Glu Gly Glu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Gln Ala Phe Arg Glu50 55 60Met Gly Val Ala Ile Glu Gly Pro His Gln Gly Arg Val Thr Ile His65 70 75 80Gly Val Gly Met His Gly Leu Lys Ala Pro Ala Gly Pro Leu Tyr Val85 90 95Gly Asn Ser Gly Thr Ala Met Arg Leu Phe Ala Gly Leu Leu Ala Gly100 105 110Gln Ala Phe Asp Ser Glu Leu Thr Gly Asp Glu Ser Leu Thr Lys Arg115 120 125Pro Met Gly Arg Val Ala Asp Pro Leu Arg Leu Met Gly Ala Ala Ile130 135 140Glu Thr Ala Glu Gly Gly Arg Pro Pro Leu Ser Ile Lys Gly Gly Ala145 150 155 160Pro Leu Lys Gly Ile Phe Tyr Asp Met Pro Met Ala Thr Ala Gln Val165 170 175Lys Ser Cys Leu Leu Leu Ala Gly Leu Tyr Ala Glu Gly Glu Thr Arg180 185 190Val Arg Glu Pro Ala Pro Thr Leu Asp His Thr Glu Arg Met Leu Asn195 200 205Gly Phe Gly Tyr Val Val Ser Arg Glu Gly Asp Thr Cys Trp Leu Gln210 215 220Gly Gly Gly Lys Leu Thr Ala Gly Pro Ile Asp Val Pro Ser Asp Ile225 230 235 240Ser Ser Ala Thr Phe Phe Leu Val Ala Ala Ala Ile Thr Pro Gly Ala245 250 255
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<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物<400>3agagtttgat catggctcag20
<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(22)<223>引物<400>4tacggttacc ttgttacgac tt 22<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(23)<223>引物<400>5ctggaattca tgcaaccaca ggg 23<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(27)<223>引物<400>6gtccgaattc ggcacgtcaa acgtcat 2權利要求
1.一種分離的EPSP合酶多肽，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中1-1347位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1350位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求6所述的載體。
8.一種具有EPSP合酶活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養(yǎng)權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有EPSP合酶活性的多肽。
9.一種能與權利要求1所述的EPSP合酶特異性結合的抗體。
10.一種改變植物抗草甘膦抗性的方法，其特征在于，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有EPSP合酶DNA編碼序列，所述的EPSP合酶選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使EPSP合酶DNA編碼序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入EPSP合酶DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的5－烯醇丙酮酸莽草酸－3－磷酸合酶(簡稱為“EPSP合酶”)，編碼EPSP合酶的多核苷酸和經重組技術產生這種EPSP合酶的方法。本發(fā)明還公開了編碼這種EPSP合酶的多核苷酸的用途。
文檔編號C12N5/04GK1664095SQ20041001663
公開日2005年9月7日 申請日期2004年3月1日 優(yōu)先權日2004年3月1日
發(fā)明者林敏 , 劉柱 申請人:中國農業(yè)科學院生物技術研究所