專利名稱：一種抗菌肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗菌肽的制備方法，更具體地說涉及抗菌肽Adenoregulin的一種基因工程制備方法。
背景技術(shù)：
抗菌肽是具有廣譜殺菌、抑病毒或抑殺腫瘤細(xì)胞等作用的一類膜活性多肽，其獨(dú)特的作用機(jī)制不易使細(xì)菌出現(xiàn)耐藥性，有望開發(fā)成為新一代的抗菌、抗病毒、抗癌藥物。Adenoregulin是于1992年從南美樹蛙Phyllomedusa bicolor的皮膚分泌液中提取出來的一種廣譜抗菌肽，由33個(gè)氨基酸組成，與Dermaseptin b具有相似的前體結(jié)構(gòu)和抗菌譜，是抗菌肽Dermaseptin家族中的一員。另外，Adenoregulin具有其他類抗菌肽不普遍存在的抗絲狀真菌作用，這更加吸引人們對(duì)其進(jìn)行研究以期開發(fā)出新一類抗菌藥物。
但是，多肽抗生素Adenoregulin從天然資源中提取成本高、工序繁，不宜大規(guī)模生產(chǎn)以滿足研究醫(yī)療等應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于公開一種利用基因工程技術(shù)制備抗菌肽Adenoregulin的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中多肽合成工序復(fù)雜、成本高、不宜大規(guī)模生產(chǎn)的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的方法包括如下步驟①化學(xué)方法合成單鏈抗菌肽Adenoregulin基因，序列如SEQ ID NO1所述。
②設(shè)計(jì)并合成引物③運(yùn)用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒④用克隆方法構(gòu)建Adenoregulin基因串聯(lián)多聚體⑤將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，獲得融合表達(dá)抗菌肽Adenoregulin的工程菌⑥發(fā)酵培養(yǎng)融合表達(dá)抗菌肽Adenoregulin的工程菌⑦純化分離得到抗菌肽Adenoregulin其中所述引物可以是，但不局限于是本發(fā)明的實(shí)施例中例舉的引物，包括引物1(SEQ ID NO2)，引物2(SEQ ID NO3)，引物3(SEQ ID NO4)，引物4(SEQ ID NO5)；所述引入的酶切位點(diǎn)為BamHI，XhoI，EcoRI，SalI，NotI等。
所述的表達(dá)載體可以是原核表達(dá)載體，也可以是真核表達(dá)載體，優(yōu)選的為pET32a(+)質(zhì)?；騪PIC質(zhì)粒。
所述的宿主細(xì)胞可以是原核宿主細(xì)胞，如大腸桿菌，枯草桿菌；也可以是真核宿主細(xì)胞，如酵母細(xì)胞。
本發(fā)明中的表達(dá)載體在轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后可融合表達(dá)Adenoregulin或非融合表達(dá)Adenoregulin。
本發(fā)明提供的抗菌肽Adenoregulin的制備方法，具有下述優(yōu)點(diǎn)1)實(shí)現(xiàn)了在原核生物體內(nèi)以融合形式表達(dá)重組蛋白，減弱或避免了天然抗菌肽對(duì)宿主的毒害作用。
2)通過重復(fù)克隆得到目的基因的串聯(lián)多聚體，得到含有確定串聯(lián)數(shù)量的多聚體，減少篩選工作的繁瑣，保證目的基因序列的正確。
3)通過對(duì)培養(yǎng)基的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了外源基因的高效表達(dá)，減弱蛋白酶對(duì)目的蛋白的降解作用，提高目的蛋白的穩(wěn)定性，為大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
4)所表達(dá)的融合蛋白易于分離純化，由于融合蛋白帶有His-Tag，可以使用鎳性的親和層析柱簡單、快捷地分離純化。
5)通過人工設(shè)計(jì)化學(xué)試劑斷裂位點(diǎn)，可以低成本地獲得目的多肽。
6)實(shí)現(xiàn)了通過真核系統(tǒng)分泌表達(dá)抗菌肽，簡化后續(xù)純化工作。
7)與傳統(tǒng)的多肽合成方法及從天然資源提取多肽的方法相比，本發(fā)明的制備方法突破了以往僅從天然資源中提取多肽或以氨基酸合成方法獲得Adenoregulin多肽的禁錮，使得大批量、低成本的規(guī)模生產(chǎn)成為可能。是生物技術(shù)運(yùn)用于大規(guī)模生產(chǎn)的又一成功范例。


圖1 pET32a(+)載體物理圖譜。
圖2 Adenoregulin基因的獲得及克隆圖3 大腸桿菌的重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建示意4 Adenoregulin基因多拷貝串聯(lián)體的構(gòu)建圖5 Adenoregulin的融合表達(dá)1.分子量Marker2.誘導(dǎo)前3.誘導(dǎo)表達(dá)BL21(DE3)/pET32a(+)-ADR4.空質(zhì)粒對(duì)照BL21(DE3/pET32a(+)圖6 E.coli表達(dá)的Adenoregulin純化電泳圖，其中，
1.分子量Marker2.全菌體表達(dá)融合蛋白3.菌體破壁后上清4.Ni+Chelating Sepharose(BBST NTA Resin)柱層析純化的融合蛋白；圖7 RP-HPLC柱層析分離譜8 大腸桿菌畢赤酵母穿梭質(zhì)粒pPIC9K的物理圖譜圖9 Adenoregulin基因的酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建圖10 Adenoregulin在畢赤酵母GS115中的分泌表達(dá)具體實(shí)施方法本發(fā)明內(nèi)容通過以下的實(shí)施例和附圖作進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。
實(shí)施例1ADR多肽的制備方法本方案利用Novagen公司的pET表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)Adenoregulin，pET32a(+)質(zhì)粒為表達(dá)載體，宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
1按照SEQ ID NO1的序列(GENEBANK ACCESSION X70278 S58040)，按照大腸桿菌偏愛密碼子加以修改，用化學(xué)方法合成抗菌肽Adenoregulin基因。
2設(shè)計(jì)并合成引物引物1(SEQ ID NO2)引入BamHI酶切位點(diǎn)，同時(shí)在結(jié)構(gòu)基因上游加入甲硫氨酸編碼基因即溴化氰識(shí)別位點(diǎn)。引物2(SEQ ID NO3)引入XhoI酶切位點(diǎn)，同時(shí)在結(jié)構(gòu)基因下游引入甲硫氨酸編碼基因即溴化氰識(shí)別位點(diǎn)。
3 PCR擴(kuò)增Adenoregulin基因1)反應(yīng)組成10xBuffer(上海生工) 5μL4種dNTP混合物，每種濃度10mM 4μL引物1(5μM) 5μL引物2(5μM) 5μL模板(序列1)(0.1μM) 5μLTaq酶(5u/μL) 1μL加水至終體積50μL2)放入PCR儀，設(shè)置反應(yīng)條件94oC預(yù)變性5分鐘，94oC30秒，55oC30秒，72oC1分鐘，設(shè)置30個(gè)循環(huán)，72oC保溫3分鐘，PCR擴(kuò)增基因。Adenoregulin基因擴(kuò)增完成后，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5a，在含X-gal+IPTG的LB+Amp平板上挑選白色克隆，經(jīng)測(cè)序正確后，用于后續(xù)的亞克隆。用BamHI和XhoI酶切pMD18-adr，電泳回收得到BamHI和XhoI酶切后的Adenoregulin基因片段。
4構(gòu)建重組質(zhì)粒(參見圖1，圖2，圖3)1)用BamHI和XhoI酶切開表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)pET32a(+) 5μL10x緩沖液 2μL
BamHI 0.5μLXhoI 0.5μL無 12μL37℃反應(yīng)2小時(shí)2)電泳回收經(jīng)BamHI和XhoI酶切的pET32a(+)質(zhì)粒3)將用BamHI和XhoI酶切開的表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)與BamHI和XhoI酶切后的Adenoregulin基因片斷連接(1μL10′緩沖液(大連寶生物公司)，1μL步驟2)獲得的產(chǎn)物，3μL步驟3)獲得的小片段，0.5μL連接酶，加超純水至10μL)，14oC，反應(yīng)20小時(shí)。
4)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，涂布在帶氨芐青霉素的LB平板上。
5)長出的菌落即為含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，挑選單菌落，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒。
6)經(jīng)DNA序列分析與設(shè)計(jì)序列相同5.重組質(zhì)粒在宿主細(xì)胞(大腸桿菌)中融合表達(dá)(參見圖5)1)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用氨芐青霉素抗性篩選得陽性克隆，為Adenoregulin的表達(dá)工程菌(pET32a(+)-ADR/BL21(DE3))。
2)將篩選的Adenoregulin工程菌劃線含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上37℃培養(yǎng)過夜。挑選生長良好的單菌落接種于LB培養(yǎng)液中(含100μg/ml氨芐青霉素)37℃培養(yǎng)過夜。將過夜菌以1∶50接種于2xYT培養(yǎng)液中(含100μg/ml氨芐青霉素)37℃振蕩培養(yǎng)。當(dāng)OD600達(dá)0.8～1.0時(shí)加IPTG至終濃度1mM，誘導(dǎo)4小時(shí)，菌液經(jīng)12,000rpm、30s離心，去培養(yǎng)基上清，沉淀菌體加入1x上樣緩沖液，100℃水浴10min，離心后進(jìn)行SDS-PAGE電泳(濃縮膠5％，分離膠12％)，染色、脫色、掃描分析，因融合蛋白含204個(gè)氨基酸，理論分子量約為22.44KD，SDS-PAGE結(jié)果表明在20KD和31KD之間有明顯表達(dá)條帶與預(yù)期相符，融合蛋白占菌體總蛋白20％左右。
6發(fā)酵培養(yǎng)融合表達(dá)Adenoregulin多肽的工程菌自平板上挑一單菌落接種于LB培養(yǎng)液中，30℃250rpm搖瓶培養(yǎng)過夜后按5％接種量接入LB+M9培養(yǎng)液中，30℃250rpm搖瓶培養(yǎng)6小時(shí)。將種子液按5％接入量加入裝有LB+M9培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中；30℃培養(yǎng)，控制pH值7.0左右，溶解氧(DO)30％以上，培養(yǎng)至4-6小時(shí)，DO值開始上升時(shí)開始補(bǔ)加葡萄糖，至OD600約為20時(shí)，加入IPTG至終濃度為1mM，誘導(dǎo)4小時(shí)停止發(fā)酵。
7分離純化Adenoregulin多肽(參見圖6，圖7)離心(10,000rpm×5min)發(fā)酵產(chǎn)物以收集菌體。按1∶7的比例將菌體重懸于NTA-0緩沖液中(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％甘油)，超聲破壁，10000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘得到裂解上清液，利用安法瑪西亞公司AKTA層析系統(tǒng)，將離心后的上清液過預(yù)平衡的Ni++Chelating SepharoseFF柱，淋洗至基線后進(jìn)行線性洗脫，咪唑濃度范圍為0～600mM，洗脫總體積為柱床的10倍。純化產(chǎn)物Trx-ADR純度約為85％，經(jīng)透析或過SephadexG25柱脫鹽，去除咪唑和氯化鈉，然后凍干。凍干的融合蛋白溶解于70％甲酸溶液，用溴化乙氰常溫裂解24h，裂解產(chǎn)物抽干后用RP-HPLC進(jìn)行分離。純化產(chǎn)物用質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定同時(shí)進(jìn)行活性分析。
實(shí)施例2ADR多肽的制備方法本方案利用Novagen公司的pET表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)Adenoregulin，pET32a(+)質(zhì)粒為表達(dá)載體，宿主細(xì)胞為大腸桿菌，將ADR基因進(jìn)行多拷貝串聯(lián)表達(dá)。
1.設(shè)計(jì)并合成引物設(shè)計(jì)引物3、4，引物3(SEQ ID NO4)中引入限制性內(nèi)切酶EcoRI、SalI識(shí)別位點(diǎn)和甲硫氨酸密碼子，引物4(SEQ ID NO5)中引入甲硫氨酸密碼子和XhoI、NotI識(shí)別位點(diǎn)。
2.用PCR方法擴(kuò)增ADR基因1)反應(yīng)組成10xBuffer(上海生工) 5μL4種dNTP混合物，每種濃度10mM 4μL引物3(5μM) 5μL引物4(5μM) 5μL模板pET32a-adr(0.1μM)5μLTaq酶(5u/μL) 1μL加水至終體積50μL2)放入PCR儀，設(shè)置反應(yīng)條件94oC預(yù)變性5分鐘，94oC30秒，55oC30秒，72oC1分鐘，設(shè)置30個(gè)循環(huán)，72oC保溫3分鐘，PCR擴(kuò)增基因。Adenoregulin基因擴(kuò)增完成后，與pMD18-T載體連接，在含有氨芐青霉素的LB平板上挑選陽性克隆，經(jīng)測(cè)序正確后，用于后續(xù)的亞克隆，并稱之為pMD18-adr’。
3.ADR串聯(lián)多拷貝基因的構(gòu)建(參見圖4)
1)用SalI和NotI酶切pMD18-adr’，電泳回收得到SalI和NotI酶切后得到Adenoregulin基因片斷。用XhoI和NotI酶切pMD18-adr，用酚氯仿抽提后，以乙醇沉淀回收DNA片段。
2)將pMD18-adr’/SalI+NotI小片段和pMD18-adr’/XhoI+NotI大片段連接，轉(zhuǎn)化DH5a，用載體多克隆位點(diǎn)兩端引物M13 primers(5’agcggataacaatttcacacagg 3’和5’cgccagggttttcccagtcacgac 3’)進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，經(jīng)1％瓊脂糖電泳檢測(cè)，有大小為300bp片段的菌落為含有2個(gè)ADR基因拷貝的pMD18-adr2質(zhì)粒的克隆。
3)抽提純化pMD18-adr2質(zhì)粒，用SalI和NotI酶切pMD18-adr2，電泳回收得到SalI和NotI酶切后得到adr2基因片斷。用XhoI和NotI酶切pMD18-adr2，用酚氯仿抽提后，以乙醇沉淀回收DNA片段。
4)將adr2/SalI+NotI和pMD18-adr2/XhoI+NotI大片段連接，轉(zhuǎn)化DH5a，用載體多克隆位點(diǎn)兩端引物M13 primers進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，經(jīng)1％瓊脂糖電泳檢測(cè)，有大小為500bp片段的菌落為含有4個(gè)ADR基因拷貝的pMD18-adr2質(zhì)粒的克隆。
5)選用適當(dāng)ADR基因拷貝數(shù)的大小片段，用上述方法可以得到含有任意數(shù)目ADR基因的串聯(lián)體。
4.構(gòu)建重組質(zhì)粒1)用EcoRI和XhoI酶切開表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)pET32a(+) 5μL10x緩沖液 2μLEcoRI 0.5μL
XhoI 0.5μL無菌水 12μL37℃反應(yīng)2小時(shí)2)電泳回收經(jīng)EcoRI和XhoI酶切的pET32a(+)質(zhì)粒3)將用EcoRI和XhoI酶切開的表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)與EcoRI和XhoI酶切后的adr2，adr4基因片斷連接(1μL10′緩沖液，(大連寶生物公司)，1μL步驟2)獲得的產(chǎn)物，3μL步驟3獲得的小片段，0.5μL連接酶，加超純水至10μL)，14oC，反應(yīng)20小時(shí)。
4)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，涂布在帶氨芐青霉素的LB平板上。
5)長出的菌落即為含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，挑選單菌落，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，EcoRI+NotI酶切檢驗(yàn)外源基因的插入與否。
5.重組質(zhì)粒在宿主細(xì)胞(大腸桿菌)中融合表達(dá)多拷貝ADR基因的融合表達(dá)方法，與前述的單拷貝ADR基因表達(dá)方式相同。
實(shí)施例3ADR多肽的制備方法本實(shí)施例用Invitrogen公司畢赤酵母表達(dá)載體，如pPIC9K質(zhì)粒，以酵母為宿主細(xì)胞表達(dá)ADR基因。
1.構(gòu)建重組質(zhì)粒(參見圖8，圖9)1)用EcoRI和NotI酶切pPIC9K質(zhì)粒，(5mLpPIC9K質(zhì)粒，2mL10′緩沖液(羅氏試劑公司)，0.5mL EcoRI，0.5mL NotI，12mL超純水，37℃，2小時(shí))。
2)用EcoRI和NotI酶切pMD18-adr’，(5mL pMD18-adr’質(zhì)粒，2mL10′緩沖液(羅氏試劑公司)，0.5mL EcoRI，0.5mL NotI，12mL超純水，37℃，2小時(shí))3)電泳回收1)的大片段，2)的小片段。
4)片段1)和片段2)連接(2.5mL超純水，1mL10′連接緩沖液(大連寶生物公司)，1mL片段1)，5mL片段2)，0.5mL連接酶，14℃，20小時(shí)).
5)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在帶氨芐青霉素的LB平板上。
6)篩選轉(zhuǎn)化子的重組質(zhì)粒。
7)經(jīng)測(cè)序證明序列正確。
2.重組質(zhì)粒在宿主細(xì)胞(酵母)中的表達(dá)9參見圖10)大量抽提質(zhì)粒pPIC9K-adr，用SacI酶線性化，然后以無水乙醇沉淀，70％乙醇洗滌后抽干，重溶于適量TE溶液中(濃度約為1mg/mL)，然后電轉(zhuǎn)化GS115宿主，涂布MD平板，30℃培養(yǎng)48小時(shí)，得到轉(zhuǎn)化子。從MD平板上挑選菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定陽性克隆，每個(gè)菌落接于10mLTE緩沖液中，經(jīng)冷凍—煮沸—冷凍處理后，取1mL上清液作為模板，引物為AOX1primer(5’gactggttccaattgacaagc 3’)和AOX1 primer(5’ggcaaatggcattctgacatcct 3’)，經(jīng)過30個(gè)循環(huán)，1％瓊脂糖電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物，有600bp條帶的為陽性克隆，無外源基因的PCR產(chǎn)物有大小為492bp的片段，乙醇氧化酶I的基因大小為2200bp，PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)2200bp條帶的，為甲醇利用快的表型Mut+，否則為甲醇利用慢的表型Muts。挑選陽性克隆接于5mLBMGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48小時(shí)后，離心收集菌體，重懸于25mLBMMY培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，表達(dá)120小時(shí)，菌液進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)和抑菌試驗(yàn)，挑選抑菌活性強(qiáng)的工程菌株。
序列表<110>華東理工大學(xué)<120>一種抗菌肽的制備方法<130>SPI0<160>1<170>Patent In Version 2.1<210>1<211>99<212>DNA<213>Adenoregulin(GENEBANK ACCESSION X70278 S58040)<220>
<221>CDS<400>1gggctttgga gtaaaatcaa agaagtagga aaagaagcag ctaaagctgc agctaaagct 60gcaggtaaag cggctttagg tgcagtttcg gaggcggtg99
權(quán)利要求
1.一種制備抗菌肽Adenoregulin的方法，其特征在于該方法包括如下步驟①合成如SEQ ID NO1所述的單鏈抗菌肽Adenoregulin基因；②基因片段擴(kuò)增；③構(gòu)建重組表達(dá)載體；④構(gòu)建Adenoregulin基因串聯(lián)多聚體；⑤將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，獲得表達(dá)抗菌肽Adenoregulin的工程菌；⑥發(fā)酵培養(yǎng)表達(dá)抗菌肽Adenoregulin的工程菌；⑦純化分離得到抗菌肽Adenoregulin。
2.一種如權(quán)利要求1所述的制備抗菌肽Adenoregulin的方法，其特征在于所述的載體為原核表達(dá)載體或真核表達(dá)載體。
3.一種如權(quán)利要求2所述的制備抗菌肽Adenoregulin的方法，其特征在于所述的載體為pET32a(+)質(zhì)粒或pPIC質(zhì)粒。
4.一種如權(quán)利要求1所述的制備抗菌肽Adenoregulin的方法，其特征在于所述的宿主細(xì)胞為原核宿主細(xì)胞或真核宿主細(xì)胞。
5.一種如權(quán)利要求1所述的制備抗菌肽Adenoregulin的方法，其特征在于所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌、枯草桿菌或酵母細(xì)胞中的一種。
6.一種如權(quán)利要求1所述的制備抗菌肽Adenoregulin的方法，其特征在于Adenoregulin基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)為融合表達(dá)或非融合表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種制備抗菌肽Adenoregulin的方法，所述方法通過化學(xué)合成目的基因，PCR進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，獲得融合表達(dá)Adenoregulin多肽的工程菌，并發(fā)酵培養(yǎng)該工程菌，最后純化分離得到抗菌肽Adenoregulin。本發(fā)明的制備方法與傳統(tǒng)方法相比，具有降低生產(chǎn)成本，滿足大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1560258SQ20041001691
公開日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2004年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月12日
發(fā)明者周宇荀, 曹魏, 魏東芝, 馬昱澍, 王錦之 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)