專利名稱：實(shí)時(shí)定量檢測(cè)erbB2表達(dá)水平的試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種癌基因erbB2 mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
分子靶向治療(Molecular targeting Therapy)是當(dāng)前腫瘤界普遍關(guān)注的一項(xiàng)腫瘤治療新技術(shù)。所謂靶向治療是指根據(jù)腫瘤細(xì)胞的特定分子進(jìn)行有針對(duì)性的攻擊，其優(yōu)點(diǎn)是在選擇性地殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，把對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞的傷害降低到最低程度。近年來(lái)已有多種靶向藥物進(jìn)入臨床，其中癌基因erbB2產(chǎn)物ErbB2/HER2特異性抗體Herceptin尤為令人矚目。
erbB2是人體腫瘤中較常見(jiàn)的一種癌基因，該基因編碼一種受體酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase，RTK)，該受體屬于人上皮生長(zhǎng)因子受體(HermanEpidermal Growth Factor Receptor，HER)基因家族，在多種惡性實(shí)體腫瘤中表達(dá)增高(表1)。根據(jù)上海市腫瘤研究所的最新統(tǒng)計(jì)資料，這些腫瘤的發(fā)病率居上海市區(qū)惡性腫瘤的前10位，占惡性腫瘤總發(fā)病率的80％。
表1癌基因erbB2在惡性實(shí)體腫瘤中的表達(dá)

HER基因家族由四個(gè)成員組成，分別稱為EGFR/ErbB1/HER1，erbB2/HER2，erbB3/HER3和erbB4/HER4。這類受體的蛋白結(jié)構(gòu)大體可以分為3個(gè)功能區(qū)，即細(xì)胞表面的配基結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)。這些受體在生理狀態(tài)下以單體形式存在，但與配基結(jié)合時(shí)可以形成同源或異源二聚體。同源二聚體是指2個(gè)相同的受體(如EGFR/EGFR)聚合，而異源二聚體則為不同受體成員間的聚合。受體二聚體形成后其酪氨酸激酶即被活化，使受體發(fā)生自身磷酸化，磷酸化的受體可以與含有SH2(Src同源區(qū)2)功能區(qū)的信號(hào)傳遞蛋白結(jié)合并通過(guò)磷酸化使其活化，其中最主要的信號(hào)傳遞蛋白包括c-Src，JAK和STAT。上述信號(hào)傳遞蛋白均為酪氨酸蛋白激酶，其活化后借助磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)MAPK-ERK、PI3K-AKT和Src-STAT三個(gè)不同的信號(hào)通路將受體信號(hào)傳遞到核內(nèi)，從而啟動(dòng)基因表達(dá)。
HER受體有10余種不同的配基，這些多肽生長(zhǎng)因子按其受體結(jié)合特性可以分成3組。第一組配基只能與EGFR結(jié)合，包括上皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor，EGF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(Transforming growth factor-α，TGFα)和二性調(diào)節(jié)素(Amphiregulin，AR)。第二組配基能與ErbB3和ErbB4結(jié)合，如神經(jīng)調(diào)節(jié)素(Neuregulin，NRG)。第三組配基能與EGFR及ErbB4結(jié)合，包括β-細(xì)胞素(Betacellulin，BTC)，上皮調(diào)節(jié)素(Epiregulin，EPR)和結(jié)合肝素的EGF樣生長(zhǎng)因子(Heparin-binding EGF-like growth factor，HB-EGF)。但是，ErbB2沒(méi)有特異性配基但具有酪氨酸激酶，erbB3具有配基結(jié)合能力但缺乏酪氨酸激酶，這二個(gè)受體只有與其他成員形成異源二聚體后才具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。
ErbB2受體活化的主要生物學(xué)效應(yīng)是刺激細(xì)胞增殖。當(dāng)細(xì)胞惡變時(shí)ErbB2受體過(guò)表達(dá)，從而刺激細(xì)胞形成失控性增殖。此外，ErbB2過(guò)度活化還可以啟動(dòng)多種蛋白水解酶和促血管生成因子(如VEGF)的表達(dá)，從而加速癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。有報(bào)道指出，ErbB2過(guò)表達(dá)還可能與癌細(xì)胞對(duì)化療和放療產(chǎn)生抗性有關(guān)。因此，ErbB2過(guò)表達(dá)者通常預(yù)后較差。
Herceptin是人源化的ErbB2特異性抗體，其作用機(jī)理是抑制受體二聚體形成，從而阻斷受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Herceptin的一個(gè)重要特性是與多種細(xì)胞毒化療藥物如順鉑、泰素、泰素蒂、諾維本、健擇等合用具有協(xié)同效應(yīng)，其機(jī)理是Herceptin阻斷ErbB2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起抗凋亡蛋白如Bcl-2和Survivin表達(dá)下調(diào)，使得癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒化療藥物的敏感性提高。此外，Herceptin與細(xì)胞表面受體結(jié)合后，還可以通過(guò)抗體依賴性細(xì)胞毒(ADCC)效應(yīng)發(fā)揮抗癌作用。
Herceptin的用藥適應(yīng)癥是腫瘤中ErbB2高表達(dá)的病例，因而在治療前應(yīng)對(duì)ErbB2表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。在乳腺癌中，erbB2基因擴(kuò)增是導(dǎo)致其過(guò)表達(dá)的主要原因，通過(guò)HercepTest免疫組化或熒光原位分子雜交(FISH)技術(shù)可以將此類患者篩選出來(lái)。在免疫組化3+或FISH陽(yáng)性患者中，Herceptin的有效率可以達(dá)到35％左右，當(dāng)與泰素聯(lián)合應(yīng)用時(shí)有效率可以達(dá)到40-60％。近年來(lái)Herceptin聯(lián)合細(xì)胞毒化療藥物治療其他惡性腫瘤已引起普遍關(guān)注。
目前ErbB2靶向治療面臨的一個(gè)主要障礙是如何采集腫瘤組織進(jìn)行檢測(cè)，因?yàn)樯鲜鰴z測(cè)技術(shù)需要較大的組織(通常要求直徑＞5mm)，而晚期腫瘤(尤其是肺癌和肝癌等臟器的腫瘤)多處于破裂出血等高危狀態(tài)，對(duì)其進(jìn)行活檢獲取所需的腫瘤組織有可能出現(xiàn)嚴(yán)重的醫(yī)療意外，患者可能因此不愿承擔(dān)風(fēng)險(xiǎn)。此外，對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)病人，一些轉(zhuǎn)移病灶因處于特殊的解剖部位(如腦轉(zhuǎn)移等)而不適宜這類手術(shù)。因此，本領(lǐng)域中迫切需要能夠客觀地反映原發(fā)腫瘤中的受體表達(dá)狀況的替代材料和方法。

發(fā)明內(nèi)容
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供了一種體外定量檢測(cè)靶細(xì)胞中erbB2基因表達(dá)水平的方法，該方法包括以下步驟(1)從靶細(xì)胞中抽提RNA并獲得cDNA；(2)在erbB2基因序列第2641-2724位核苷酸區(qū)間內(nèi)選擇引物和Taqman探針，并根據(jù)erbB2基因序列第2474-2903位核苷酸制備標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用Taqman技術(shù)對(duì)erbB2基因表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。
本發(fā)明另一方面提供了一種用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)靶細(xì)胞中癌基因erbB2表達(dá)水平的試劑盒，所述試劑盒包含特異性上游引物、下游引物、DNA標(biāo)準(zhǔn)品以及Taqman探針，其中所述特異性上游和下游引物和Taqman探針在erbB2基因序列第2641-2724位核苷酸區(qū)間內(nèi)進(jìn)行選擇，所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)erbB2基因序列第2474-2903位核苷酸進(jìn)行制備。
針對(duì)本發(fā)明所要解決的上述問(wèn)題，本發(fā)明者研究并開(kāi)發(fā)出高度敏感和特異性的實(shí)時(shí)定量PCR方法，該方法能夠?qū)?個(gè)癌細(xì)胞以上腫瘤組織進(jìn)行erbB2 mRNA檢測(cè)，從而解決腫瘤穿刺活檢標(biāo)本中微量癌細(xì)胞的檢測(cè)問(wèn)題。利用該方法，約四分之三的晚期腫瘤病人血液可以檢出游離癌細(xì)胞。將這些微轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞分離純化后應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法進(jìn)行erbB2 mRNA檢測(cè)，從而可以解決無(wú)法獲得腫瘤穿刺活檢標(biāo)本病人的檢測(cè)問(wèn)題。因而本發(fā)明專利適用于對(duì)微量腫瘤活檢材料以及血液微轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞中erbB2基因表達(dá)進(jìn)行定量分析，有助于臨床醫(yī)生有針對(duì)性地采取分子靶向治療措施。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了ErbB2基因表達(dá)的RT-PCR分析結(jié)果，其中泳道1為引物1反應(yīng)產(chǎn)物(以cDNA為模板)(430bp)；泳道2為引物2反應(yīng)產(chǎn)物(以引物1反應(yīng)產(chǎn)物為模板)(84bp)；泳道3為引物2反應(yīng)產(chǎn)物(以cDNA為模板)(84bp)；M表示DNA分子量標(biāo)記，橫線由上而下依次表示500bp，200bp和100bp。
圖2顯示了SPC-A1和SK-BR3細(xì)胞ErbB2受體表達(dá)的流式細(xì)胞分析結(jié)果。
圖3顯示了erbB2基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果。
圖4顯示了GAPDH的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施方案本發(fā)明第一方面提供了一種體外定量檢測(cè)靶細(xì)胞中erbB2基因表達(dá)水平的方法，該方法包括以下步驟(1)從靶細(xì)胞中抽提RNA并獲得cDNA；(2)在erbB2基因序列第2641-2724位核苷酸區(qū)間內(nèi)選擇引物和Taqman探針，并根據(jù)erbB2基因序列第2474-2903位核苷酸制備標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用Taqman技術(shù)對(duì)erbB2基因表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。
實(shí)時(shí)定量PCR是根據(jù)Taqman技術(shù)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新穎的基因檢測(cè)方法，其原理是將靶基因特異性的一組引物和熒光標(biāo)記的Taqman探針與模板cDNA進(jìn)行雜交，然后在多聚酶鏈反應(yīng)過(guò)程中利用Taq酶的3’-核酸外切酶活性水解探針3’-端的熒光淬滅基團(tuán)，獲得熒光激發(fā)信號(hào)，后者與模板量呈正相關(guān)。Taqman探針的制備以及熒光淬滅基團(tuán)和熒光報(bào)告基團(tuán)的選擇對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的。
本發(fā)明者根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中公開(kāi)發(fā)表的erbB2(X03363)和GAPDH(M33197)基因序列，采用美國(guó)賽百盛公司提供的引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)erbB2基因序列第2641-2724位核苷酸以及第2474-2903位核苷酸分別設(shè)計(jì)了2組引物，PCR擴(kuò)增后獲得了相應(yīng)的條帶。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，結(jié)果證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物序列與文獻(xiàn)報(bào)道完全一致，這表明上述引物對(duì)選定的基因具有高度特異性。
本發(fā)明方法能對(duì)靶細(xì)胞中erbB2表達(dá)水平進(jìn)行絕對(duì)定量的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。具體而言，本發(fā)明者采用引物1(例如表2中的SEQ ID NO6和7)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到雙鏈DNA片段，經(jīng)純化后作為定量PCR分析的標(biāo)準(zhǔn)品。以引物2(例如表2中的SEQ ID NO8和9)及探針(例如表2中的SEQ ID NO10)組合進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，經(jīng)過(guò)反應(yīng)條件優(yōu)化，獲得了線性結(jié)果。實(shí)驗(yàn)證明，采用該項(xiàng)技術(shù)對(duì)erbB2和GAPDH基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R)均大于0.999。上述試劑保存于-70℃在6個(gè)月內(nèi)非常穩(wěn)定，不同實(shí)驗(yàn)間的誤差小于5％。
然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠理解，列舉上述具體的兩組引物和探針僅僅是為了描述本發(fā)明，它們并不起任何限制性的作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀了本說(shuō)明書(shū)后，能夠采用常規(guī)的手段在erbB2基因序列第2474-2903位核苷酸區(qū)間內(nèi)通過(guò)適當(dāng)選擇其他引物來(lái)合成DNA標(biāo)準(zhǔn)品，也能夠在erbB2基因序列第2641-2724位核苷酸區(qū)間內(nèi)選擇其它合適的引物和探針。
應(yīng)用上述試劑對(duì)4個(gè)人體腫瘤細(xì)胞株(SK-BR3、SPC-A1、SPC-L1和H460)進(jìn)行了檢測(cè)，證明這些細(xì)胞表達(dá)不同水平的erbB2基因。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞儀對(duì)上述細(xì)胞表面ErbB2蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，證實(shí)定量PCR檢測(cè)到的mRNA表達(dá)與蛋白表達(dá)一致。
本發(fā)明者還對(duì)55例原發(fā)肺癌組織、10例肺癌活檢組織和60例肺癌病人外周血進(jìn)行了定量PCR分析，結(jié)果顯示上述樣本中erbB2高表達(dá)比例分別為29.1％，37.5％和30.2％。erbB2高表達(dá)的檢出率在不同來(lái)源的樣本中基本相同，說(shuō)明以微量活檢組織和外周血癌細(xì)胞為材料進(jìn)行erbB2基因表達(dá)分析，可以作為判斷原發(fā)腫瘤中該基因表達(dá)水平的依據(jù)。
因此，本發(fā)明另一方面還提供了一種用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)靶細(xì)胞中癌基因erbB2表達(dá)水平的試劑盒，所述試劑盒包含特異性上游引物、下游引物、DNA標(biāo)準(zhǔn)品以及Taqman探針，其中所述特異性上游和下游引物以及Taqman探針在erbB2基因序列第2641-2724位核苷酸區(qū)間內(nèi)進(jìn)行選擇，所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)erbB2基因序列第2474-2903位核苷酸進(jìn)行制備。
以下借助非限制性實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。
實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)及PCR產(chǎn)物測(cè)序1.1材料與方法人體乳腺癌細(xì)胞株SK-BR3和肺癌細(xì)胞株SPC-A1購(gòu)自中科院上海生化細(xì)胞所。胎牛血清及RMMI 1640、DMEM培養(yǎng)液為GIBCO公司產(chǎn)品。Trizol RNA抽提試劑盒購(gòu)自上海申能博采生物科技有限公司。RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒購(gòu)自立陶宛MBI Fermentas公司。PCR引物由上海申友生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。10mM dNTP、Pfu高保真DNA聚合酶購(gòu)自上海申能博采公司。PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海申友公司完成。
根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中公開(kāi)發(fā)表的erbB2(X03363)和GAPDH(M33197)基因序列，采用美國(guó)賽百盛公司提供的引物設(shè)計(jì)軟件，分別設(shè)計(jì)了2組引物(表2)。
表2 PCR引物及探針序列

選擇活躍增殖期細(xì)胞按試劑盒要求抽提總RNA，采用紫外分光光度計(jì)(Biophotometer，德國(guó)Eppendorf公司)測(cè)定A260及A280。
取2μg RNA按試劑盒要求合成cDNA，反應(yīng)體積為20μl。
PCR反應(yīng)混合液為1μl cDNA，上游及下游引物1(50μM)各1μl，dNTP 1μl，Pfu酶1μl，加DEPC-H2O至50μl，石臘油30μl覆蓋。PCR反應(yīng)條件為95℃變性5min；95℃1min，56或60℃1min，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。
PCR產(chǎn)物經(jīng)1.6％瓊脂糖電泳100V 30min，RB染色攝片。陽(yáng)性產(chǎn)物的測(cè)序采用上游引物，由上海申友公司協(xié)助完成。
1.2結(jié)果圖1結(jié)果顯示，在給定的反應(yīng)條件下，引物1能擴(kuò)增出單一條帶。取引物1的PCR產(chǎn)物，采用引物2進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，也獲得了單一條帶，其PCR產(chǎn)物大小與應(yīng)用cDNA直接擴(kuò)增所得結(jié)果相同，說(shuō)明引物2對(duì)所選定的基因也具有高度特異性。測(cè)序后證實(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列與預(yù)期序列完全一致。
實(shí)施例2腫瘤細(xì)胞中erbB2基因和蛋白表達(dá)的相關(guān)性2.1材料與方法人體肺癌細(xì)胞株SPC-A1及SPC-L1，人體乳腺癌細(xì)胞株SK-BR3購(gòu)自中科院上海生化細(xì)胞所。人體肺癌細(xì)胞株H460由美國(guó)德州大學(xué)MD Anderson癌癥中心Paul JChiao教授惠贈(zèng)。H460及SK-BR3細(xì)胞采用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，SPC-A1及SPC-L1細(xì)胞采用含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。
PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自上海申能博彩公司。定量PCR引物及熒光素標(biāo)記探針由上海申友公司合成。熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程公司。
ErbB2特異性抗體Ab2及熒光素FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自美國(guó)NeoMarker公司。
(1)應(yīng)用引物1對(duì)SK-BR3細(xì)胞RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定雙鏈DNA含量，純化產(chǎn)物中的基因拷貝數(shù)按下述公式計(jì)算基因拷貝數(shù)/μl＝[A260/13.2×片斷長(zhǎng)度(kb)]×6.02×1011(2)定量PCR反應(yīng)母液10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μl，250mM MgCl20.75μl，100μM上游及下游引物2各0.1μl(400nM)，50μM熒光素標(biāo)記探針0.1μl(200nM)，10mM dNTP 0.5μl，熱啟動(dòng)Taq(TaKaRa Ex Taq HS)酶0.25μl(1.25U)，加DEPC-H20至23μl。上述反應(yīng)母液保存于-70℃。
(3)定量PCR反應(yīng)液23μl反應(yīng)母液中加入2μl cDNA。
(4)定量PCR反應(yīng)條件50℃預(yù)熱300秒；95℃變性300秒；95℃20秒，60℃60秒，40個(gè)循環(huán)，60℃檢測(cè)；37℃30秒。
定量PCR儀為L(zhǎng)ightCycler(瑞士Roche公司)。
(5)流式細(xì)胞分析取活躍增殖期細(xì)胞，調(diào)整至107細(xì)胞/ml。在5ml塑料離心管內(nèi)分別加入100μl細(xì)胞及1μg抗體，置冰浴30min后用磷酸緩沖液(PBS，pH7.4)離心洗滌2次，重懸細(xì)胞于100μl PBS中(內(nèi)含10％牛血清及5μg熒光素FITC標(biāo)記的羊抗鼠Ig G)，冰浴30min后用PBS離心洗滌2次，上機(jī)分析(美國(guó)Beckman-Coulter公司EPICS XL型流式細(xì)胞儀)。
2.3結(jié)果A、標(biāo)準(zhǔn)曲線分析在基因拷貝數(shù)為105-108范圍內(nèi)，應(yīng)用本方法能夠給出線性結(jié)果，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R均＞0.999，結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4)。此外，反應(yīng)母液保存于-70℃條件下在6個(gè)月內(nèi)非常穩(wěn)定，不同實(shí)驗(yàn)間誤差≤5％。
B、腫瘤細(xì)胞中erbB2基因及ErbB2蛋白表達(dá)分析不同的人體腫瘤細(xì)胞表達(dá)erbB2基因有明顯差異。若以內(nèi)參照基因GAPDH拷貝數(shù)作為基準(zhǔn)，各細(xì)胞株的表達(dá)值(erbB2拷貝數(shù)/103GAPDH拷貝數(shù))見(jiàn)表3。
為了進(jìn)一步分析mRNA表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性，本發(fā)明者采用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)了上述細(xì)胞表面ErbB2蛋白的表達(dá)(圖2例舉了ErbB2陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞SPC-A1和SK-BR3的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果)。表3結(jié)果表明，細(xì)胞表面ErbB2蛋白的熒光指數(shù)(FI)和陽(yáng)性細(xì)胞百分率與實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)到的基因表達(dá)值之間存在較好的相關(guān)性。因此，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)erbB2的mRNA表達(dá)，可以反映其蛋白的表達(dá)水平。
表3腫瘤細(xì)胞中erbB2基因及蛋白表達(dá)的相關(guān)性

*熒光指數(shù)(FI)＝(實(shí)驗(yàn)組熒光峰值/對(duì)照組熒光峰值)-1實(shí)施例3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的敏感性分析3.1材料與方法人體肺癌細(xì)胞SK-BR3培養(yǎng)在含10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)液中。Trizol RNA抽提試劑盒及糖原購(gòu)自上海申能博采生物科技有限公司。RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒購(gòu)自立陶宛MBI Fermentas公司。erbB2及GAPDH定量PCR分析試劑見(jiàn)取活躍增殖期細(xì)胞，調(diào)整至1×105，1×104，1×103及1×102細(xì)胞/ml。各濃度細(xì)胞分別取50μl，加入800μl Trizol及10μl糖原(20mg/ml)，按試劑盒方法抽提RNA。所得的RNA溶解于10μl DEPC-H2O中供cDNA合成，反應(yīng)體積為20μl。
各取2μl cDNA進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件見(jiàn)實(shí)施例2。
3.2結(jié)果表4結(jié)果顯示，應(yīng)用本方法在5-5000個(gè)腫瘤細(xì)胞范圍內(nèi)能夠獲得線性檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，定量PCR檢測(cè)erbB2基因表達(dá)的敏感性為5個(gè)腫瘤細(xì)胞/樣本。
表4 erbB2基因表達(dá)的定量PCR檢測(cè)

實(shí)施例4肺癌組織erbB2基因表達(dá)的定量PCR分析4.1材料與方法55例非小細(xì)胞肺癌，男性42例，女性13例。所有腫瘤組織均經(jīng)病理檢查證實(shí)，組織類型為腺癌22例，鱗癌20例，腺鱗癌13例。病理分期為I期18例，II期12例，III期25例。
10例正常肺組織取自距離肺癌病灶5cm以上的手術(shù)切除肺葉，經(jīng)病理檢查不含癌組織。
實(shí)驗(yàn)所用試劑及方法詳見(jiàn)實(shí)施例2和3。
4.2結(jié)果10例正常肺組織中erbB2表達(dá)值為105.48±129.36(單位拷貝數(shù)/103GAPDH拷貝)。55例肺癌組織中erbB2表達(dá)值為3169.66±17906.0。以正常肺組織erbB2均數(shù)+2標(biāo)準(zhǔn)差(365)作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，則肺癌中erbB2陽(yáng)性率為49.1％(27/55例)，其中erbB2表達(dá)值大于陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)3倍(1100)的高表達(dá)者16例，占29.1％。
實(shí)施例5肺癌活檢組織中erbB2基因表達(dá)的定量PCR分析5.1材料與方法10例肺癌患者在知情同意下接受活檢手術(shù)，其中5例為纖維支氣管鏡下獲得的活檢及毛篩樣本，2例為鎖骨上淋巴結(jié)穿刺樣本，3例為胸水。所有活檢材料均經(jīng)病理檢查，其中1例氣管鏡活檢組織和1例胸水中未找到癌細(xì)胞，其余組織均為肺腺癌。
活檢材料保存在生理鹽水中，經(jīng)1500rpm離心2min后去上清，組織材料于-70℃保存待測(cè)。胸水經(jīng)1500rpm離心10min后去上清，細(xì)胞沉淀重懸于5ml生理鹽水中，然后每樣本中加入50μl EPCAM(上皮細(xì)胞粘附分子)抗體交聯(lián)的免疫微球(挪威Dynal Biotech ASA公司)，在室溫下以30rpm轉(zhuǎn)速顛倒混勻2小時(shí)，按試劑盒要求分離陽(yáng)性細(xì)胞組分。-70℃保存待測(cè)。
實(shí)驗(yàn)所用試劑及方法詳見(jiàn)實(shí)施例2和3。
5.2結(jié)果活檢材料首先進(jìn)行GAPDH和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)mRNA檢測(cè)，若未檢測(cè)到GAPDH mRNA，表明其中不含細(xì)胞成分。GAPDH mRNA檢測(cè)陽(yáng)性的樣本進(jìn)行hTERTmRNA檢測(cè)，若hTERT mRNA高于正常肺組織陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)(10拷貝/103GAPDH拷貝)，則表明為癌性組織(資料未列)。
10例樣本1例胸水中不含細(xì)胞成分，1例氣管鏡活檢組織不含癌細(xì)胞，檢測(cè)結(jié)果與病理檢查吻合。8例癌性活檢組織中4例erbB2表達(dá)低于陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，4例為陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為50.0％，其中3例為高表達(dá)，占37.5％。
實(shí)施例6肺癌病人外周血微轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞中erbB2基因表達(dá)的定量PCR分析6.1材料與方法60例IIIb-IV期肺癌患者，男性38例，女性22例，組織類型為腺癌55例，肺泡細(xì)胞癌5例，其中40例未接受過(guò)手術(shù)治療，20例為術(shù)后復(fù)發(fā)。
27例健康志愿者，男性20例，女性7例，均為在校大學(xué)生。
所有人員均在知情同意下采集外周血5ml，10U/ml肝素抗凝。
血液樣本經(jīng)1500rpm離心10min后去血漿，用生理鹽水加至5ml，然后每樣本中加入50μl EPCAM抗體交聯(lián)的免疫微球(挪威Dynal Biotech ASA公司)，在室溫下以30rpm轉(zhuǎn)速顛倒混勻2小時(shí)，按試劑盒要求分離陽(yáng)性細(xì)胞組分。-70℃保存待測(cè)。
實(shí)驗(yàn)所用試劑及方法詳見(jiàn)實(shí)施例2和3。
6.2結(jié)果27例健康人血液樣本中20例不含細(xì)胞成分，其余7例樣本不含癌細(xì)胞。
60例肺癌血液樣本11例不含細(xì)胞成分，其余49例中6例不含癌細(xì)胞，因而癌細(xì)胞檢出率為71.7％(43/60例)。此43例中erbB2低于陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)的有24例，占55.8％，陽(yáng)性表達(dá)的有19例，占44.2％，其中高表達(dá)的有13例，占30.2％。
表5列舉了腫瘤原發(fā)組織、活檢組織和外周血癌細(xì)胞中erbB2基因表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示，erbB2的陽(yáng)性檢出率在不同來(lái)源的樣本中基本相同，說(shuō)明以微量活檢組織和外周血癌細(xì)胞為材料進(jìn)行erbB2基因表達(dá)分析，可以作為判斷原發(fā)腫瘤中該基因表達(dá)水平的依據(jù)。
表5腫瘤原發(fā)組織、活檢組織和外周血癌細(xì)胞中erbB2基因表達(dá)

注erbB2正常范圍為＜365；陽(yáng)性表達(dá)為≥365；高表達(dá)為≥1100。
雖然上面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了具體描述，但是熟悉本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員均了解，在不違背本發(fā)明的原則和精神的情況下，根據(jù)本說(shuō)明書(shū)及所附權(quán)利要求書(shū)中公開(kāi)的內(nèi)容，可對(duì)本發(fā)明做出各種變動(dòng)和改進(jìn)。因此，所有這些變動(dòng)和改進(jìn)均應(yīng)包括在所附權(quán)利要求書(shū)中所要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
序列表<110>董，強(qiáng)剛<120>實(shí)時(shí)定量檢測(cè)erbB2表達(dá)水平的試劑盒和方法<130>041068<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1cacatcgctc agacaccatg 20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2aggcattgct gatgatcttg a 21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3ggaaggtgaa ggtcggagtc 20
<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4gaagatggtg atgggatttc 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>探針<400>5caagcttccc gttctcagcc 20<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6tcttagacga agcatacgtg a 21<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>探針<400>7acaccataac tccacacatc a 21
<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8ctgaactggt gtatgcagat tgc 23<210>9<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>9gttccgagcg gccaagt 17<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>探針<400>10tgtgtacgag ccgcacatcc tcca 2權(quán)利要求
1.一種體外定量檢測(cè)靶細(xì)胞中erbB2基因表達(dá)水平的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)從靶細(xì)胞中抽提RNA并獲得cDNA；(2)在erbB2基因序列第2641-2724位核苷酸區(qū)間內(nèi)選擇引物和Taqman探針，并根據(jù)erbB2基因序列第2474-2903位核苷酸制備標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用Taqman技術(shù)對(duì)erbB2基因表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶細(xì)胞是癌細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述靶細(xì)胞來(lái)自活檢標(biāo)本。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述靶細(xì)胞來(lái)自胸水或外周血。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，該方法還包括這樣一個(gè)步驟在步驟1)之前，先用磁性分選方法從胸水或外周血中分離出靶細(xì)胞。
6.一種用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)靶細(xì)胞中癌基因erbB2表達(dá)水平的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含特異性上游引物、下游引物、DNA標(biāo)準(zhǔn)品以及Taqman探針，其中所述特異性上游和下游引物和Taqman探針在erbB2基因序列第2641-2724位核苷酸區(qū)間內(nèi)進(jìn)行選擇，所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)erbB2基因序列第2474-2903位核苷酸進(jìn)行制備。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中所述引物具有SEQ ID NO8、9所示的序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中所述Taqman探針具有SEQ ID NO10所示的序列，且其5′端與熒光報(bào)告基團(tuán)相連，3′端與熒光淬滅基團(tuán)相連。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品用具有SEQ ID NO6和7所示序列的引物擴(kuò)增獲得。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種體外定量檢測(cè)靶細(xì)胞中erbB2基因表達(dá)水平的方法，該方法包括以下步驟從靶細(xì)胞中抽提RNA并獲得cDNA；在erbB2基因序列第2641－2724位核苷酸區(qū)間內(nèi)選擇引物和Taqman探針，并根據(jù)erbB2基因序列第2474－2903位核苷酸制備標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用Taqman技術(shù)對(duì)erbB2基因表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。本發(fā)明還提供了用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)靶細(xì)胞中癌基因erbB2表達(dá)水平的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1673386SQ200410017148
公開(kāi)日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2004年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月24日
發(fā)明者董強(qiáng)剛 申請(qǐng)人:董強(qiáng)剛