專利名稱：實(shí)時(shí)定量檢測(cè)上皮生長(zhǎng)因子受體基因表達(dá)水平的試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明描述了一種上皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)新方法。
背景技術(shù)：
腫瘤細(xì)胞失控性增殖和侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為是一個(gè)需要多基因參與的復(fù)雜事件，這些基因在時(shí)間和空間上的協(xié)同作用受細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞鏈的調(diào)控。因而選擇性地控制若干關(guān)鍵性信號(hào)分子的作用、干擾信號(hào)傳遞鏈的正常運(yùn)行，是二十一世紀(jì)腫瘤化療的一個(gè)發(fā)展方向。
上皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)是上述信號(hào)傳遞鏈的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。EGFR屬于I型受體酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase，RTK)家族，該受體在多種惡性實(shí)體腫瘤中表達(dá)增高(表1)。根據(jù)上海市腫瘤研究所的最新統(tǒng)計(jì)資料，這些腫瘤的發(fā)病率居上海市區(qū)惡性腫瘤的前10位，占惡性腫瘤總發(fā)病率的80％。
表1 EGFR在惡性實(shí)體腫瘤中的表達(dá)

EGFR與erbB2，erbB3和erbB4共同組成RTK家族的一個(gè)分支，稱為EGFR家族。這類受體的蛋白結(jié)構(gòu)大體可以分為3個(gè)功能區(qū)，即細(xì)胞表面的配基結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)。這些受體在生理狀態(tài)下以單體形式存在，但與配基結(jié)合時(shí)可以形成同源或異源二聚體。同源二聚體是指2個(gè)相同的受體(如EGFR/EGFR)聚合，而異源二聚體則為不同受體成員間的聚合。EGFR受體可與多種配基特異性結(jié)合，這些多肽生長(zhǎng)因子包括上皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor，EGF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(Transforming growth factor-α，TGFα)，二性調(diào)節(jié)素(Amphiregulin，AR)，β-細(xì)胞素(Betacellulin，BTC)，上皮調(diào)節(jié)素(Epiregulin，EPR)和結(jié)合肝素的EGF樣生長(zhǎng)因子(Heparin-binding EGF-like growth factor，HB-EGF)。EGFR與配基結(jié)合形成受體二聚體后其酪氨酸激酶即被活化，使受體發(fā)生自身磷酸化，磷酸化的受體可以與含有SH2(Src同源區(qū)2)功能區(qū)的信號(hào)傳遞蛋白結(jié)合并通過磷酸化使其活化，其中最主要的信號(hào)傳遞蛋白包括c-Src，JAK和STAT。上述信號(hào)傳遞蛋白均為酪氨酸蛋白激酶，其活化后借助磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過MAPK-ERK、PI3K-AKT和Src-STAT三個(gè)不同的信號(hào)通路將受體信號(hào)傳遞到核內(nèi)，從而啟動(dòng)基因表達(dá)。EGFR受體活化的主要生物學(xué)效應(yīng)是刺激細(xì)胞增殖。當(dāng)細(xì)胞惡變時(shí)EGFR受體或其配基過表達(dá)，從而通過自分泌(Autocrine)或旁分泌(Paracrine)方式刺激細(xì)胞形成失控性增殖。此外，EGFR過度活化還可以啟動(dòng)多種蛋白水解酶和促血管生成因子(如VEGF)的表達(dá)，從而加速癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。因此，EGFR過表達(dá)者通常預(yù)后較差。
近年來，以EGFR為治療靶點(diǎn)的分子靶向治療(Molecular Targeting Therapy)引起了國(guó)內(nèi)外腫瘤界的普遍關(guān)注，目前已有多種靶向藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)(表2)，這些靶向藥物大致可以分為2類(1)受體特異性單抗，如IMC-C225(Erbitux)。(2)小分子受體酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，如ZD1839(Iressa或Gefitinib)。這類藥物的主要作用機(jī)理是抑制受體聚合或TK磷酸化，從而阻斷受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。它們與細(xì)胞毒化療藥物的不同之處是對(duì)治療靶點(diǎn)具有高度選擇性，因而必須選擇受體陽性腫瘤進(jìn)行治療才能獲得預(yù)期療效，尤其是抗體類靶向藥物，其療效與受體表達(dá)水平呈正相關(guān)。多數(shù)學(xué)者主張?jiān)谟盟幥皯?yīng)進(jìn)行受體檢測(cè)，選擇受體高表達(dá)腫瘤進(jìn)行治療。
目前EGFR的檢測(cè)技術(shù)大體分為二類，一是檢測(cè)受體的蛋白表達(dá)，如免疫組化和免疫印跡，二是檢測(cè)受體的信使RNA(mRNA)表達(dá)，如逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative Real-time PCR)。這些方法的一個(gè)共同點(diǎn)是需要足夠大小(直徑＞5mm)的腫瘤組織才能進(jìn)行檢測(cè)，但晚期腫瘤多處于破裂出血等高危狀態(tài)，對(duì)其進(jìn)行活檢獲取所需的腫瘤組織有可能出現(xiàn)嚴(yán)重的醫(yī)療意外，患者可能因此不愿承擔(dān)風(fēng)險(xiǎn)。此外，對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)病人，一些轉(zhuǎn)移病灶因處于特殊的解剖部位(如腦轉(zhuǎn)移等)而不適宜這類手術(shù)。因而有必要尋找替代(Surrogate)材料，能夠客觀地反映原發(fā)腫瘤中的受體表達(dá)狀況。
表2 EGFR受體特異性靶向藥物

發(fā)明內(nèi)容為了解決上述問題，本發(fā)明第一方面提供了一種體外定量檢測(cè)靶細(xì)胞中上皮生長(zhǎng)因子受體EGFR基因表達(dá)水平的方法，該方法包括以下步驟(1)從靶細(xì)胞中抽提RNA并獲得cDNA；(2)在EGFR基因序列第1744-1871位核苷酸區(qū)間內(nèi)選擇引物和Taqman探針，并根據(jù)EGFR基因序列第1520-2016位核苷酸制備標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用Taqman技術(shù)對(duì)EGFR基因表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。
本發(fā)明另一方面提供了一種用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)靶細(xì)胞中EGFR基因表達(dá)水平的試劑盒，所述試劑盒包含特異性上游引物、下游引物、DNA標(biāo)準(zhǔn)品以及Taqman探針，其中所述特異性上游和下游引物和Taqman探針在EGFR基因序列第1744-1871位核苷酸區(qū)間內(nèi)進(jìn)行選擇，所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)EGFR基因序列第1520-2016位核苷酸進(jìn)行制備。
針對(duì)上述問題本發(fā)明者研究并開發(fā)出了高度敏感和特異性的實(shí)時(shí)定量PCR方法和試劑盒，該方法能夠?qū)?個(gè)癌細(xì)胞以上腫瘤組織進(jìn)行EGFR mRNA檢測(cè)，從而解決腫瘤穿刺活檢標(biāo)本中微量癌細(xì)胞的檢測(cè)問題。約四分之三的晚期腫瘤病人血液可以檢出游離癌細(xì)胞。將這些微轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞分離純化后應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法進(jìn)行EGFR mRNA檢測(cè)，可以解決無法獲得腫瘤穿刺活檢標(biāo)本病人的檢測(cè)問題。因而本發(fā)明專利適用于對(duì)微量腫瘤活檢材料以及血液微轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞中EGFR基因表達(dá)進(jìn)行定量分析，有助于臨床醫(yī)生有針對(duì)性地采取分子靶向治療措施。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了EGFR基因表達(dá)的RT-PCR分析結(jié)果，其中泳道1為引物1的反應(yīng)產(chǎn)物(以cDNA為模板)(504bp)；泳道2為引物2反應(yīng)產(chǎn)物(以引物1反應(yīng)產(chǎn)物為模板)(176bp)；泳道3為引物2反應(yīng)產(chǎn)物(以cDNA為模板)(176bp)；M為分子量標(biāo)記，其中橫線從上到下依次表示500bp，200bp和100bp。
圖2顯示了SPC-A1肺癌細(xì)胞EGFR受體表達(dá)的流式細(xì)胞分析結(jié)果。
圖3A和3B顯示了EGFR基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖4A和4B顯示了GAPDH的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方案本發(fā)明第一方面提供了一種體外定量檢測(cè)靶細(xì)胞中上皮生長(zhǎng)因子受體EGFR基因表達(dá)水平的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)從靶細(xì)胞中抽提RNA并獲得cDNA；(2)在EGFR基因序列第1744-1871位核苷酸區(qū)間內(nèi)選擇引物和Taqman探針，并根據(jù)EGFR基因序列第1520-2016位核苷酸制備標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用Taqman技術(shù)對(duì)EGFR基因表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。
實(shí)時(shí)定量PCR是根據(jù)Taqman技術(shù)發(fā)展起來的一項(xiàng)新穎的基因檢測(cè)方法，其原理是將靶基因特異性的一組引物和熒光標(biāo)記的Taqman探針與模板cDNA進(jìn)行雜交，然后在多聚酶鏈反應(yīng)過程中利用Taq酶的3’-核酸外切酶活性水解探針3’-端的熒光淬滅基團(tuán)，獲得熒光激發(fā)信號(hào)，后者與模板量呈正相關(guān)。Taqman探針的制備以及熒光淬滅基團(tuán)和熒光報(bào)告基團(tuán)的選擇對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的。
本發(fā)明者根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中公開發(fā)表的EGFR(X00588)和GAPDH(M33197)基因序列，采用美國(guó)賽百盛公司提供的引物設(shè)計(jì)軟件，通過在EGFR基因序列第1744-1871位核苷酸區(qū)間和第1520-2016位核苷酸區(qū)間分別設(shè)計(jì)了2組引物，PCR擴(kuò)增后獲得了相應(yīng)的條帶。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物序列與文獻(xiàn)報(bào)道完全一致，說明上述引物對(duì)選定的基因具有高度特異性。
本發(fā)明的方法能對(duì)EGFR表達(dá)進(jìn)行絕對(duì)定量的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法。具體而言，本發(fā)明者采用引物1(例如表3中的SEQ ID NO6、7)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到雙鏈DNA片段，經(jīng)純化后作為定量PCR分析的標(biāo)準(zhǔn)品。以引物2(例如表3中的SEQ ID NO8、9)及探針(例如表3中的SEQ ID NO10)組合進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，經(jīng)過反應(yīng)條件優(yōu)化，獲得了線性結(jié)果。實(shí)驗(yàn)證明，采用該項(xiàng)技術(shù)對(duì)EGFR和GAPDH基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R)均大于0.999。上述試劑保存于-70C在6個(gè)月內(nèi)非常穩(wěn)定，不同實(shí)驗(yàn)間的誤差小于5％。
然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠理解，列舉上述具體的兩組引物和探針僅僅是為了描述本發(fā)明，它們并不起任何限制性的作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀了本說明書后，能夠采用常規(guī)的手段在EGFR基因序列第1744-1871位核苷酸區(qū)間內(nèi)通過適當(dāng)選擇其他引物來合成DNA標(biāo)準(zhǔn)品，也能夠在EGFR基因序列第1744-1871位核苷酸區(qū)間內(nèi)選擇其它合適的引物和探針來達(dá)到本發(fā)明的目的。
應(yīng)用上述試劑對(duì)4個(gè)人體腫瘤細(xì)胞株(SK-BR3、H460、H1299和A549)進(jìn)行了檢測(cè)，證明這些細(xì)胞表達(dá)不同水平的EGFR基因。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞儀對(duì)上述細(xì)胞表面EGFR蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，證實(shí)定量PCR檢測(cè)到的mRNA表達(dá)與蛋白表達(dá)一致。
本發(fā)明者還對(duì)55例原發(fā)肺癌組織、10例肺癌活檢組織和60例肺癌病人外周血進(jìn)行了定量PCR分析，結(jié)果顯示上述樣本中EGFR陽性表達(dá)率分別為43.6％，50.0％和51.2％，說明以微量活檢組織和外周血癌細(xì)胞為材料進(jìn)行EGFR基因表達(dá)分析，可以作為判斷原發(fā)腫瘤中該基因表達(dá)水平的依據(jù)。
因此，本發(fā)明第二方面還提供了一種用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)靶細(xì)胞中EGFR基因表達(dá)水平的試劑盒，所述試劑盒包含特異性上游引物、下游引物、DNA標(biāo)準(zhǔn)品以及Taqman探針，其中所述特異性上游和下游引物和Taqman探針在EGFR基因序列第1744-1871位核苷酸區(qū)間內(nèi)進(jìn)行選擇，所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)EGFR基因序列第1520-2016位核苷酸進(jìn)行制備。
以下借助非限制性實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。
實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)及PCR產(chǎn)物測(cè)序1.1材料與方法人體肺癌細(xì)胞株SPC-A1及SPC-L1購(gòu)自中科院上海生化細(xì)胞所。胎牛血清及RPMI1640培養(yǎng)液為GIBCO公司產(chǎn)品。Trizol RNA抽提試劑盒購(gòu)自上海申能博采生物科技有限公司提供。RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒購(gòu)自立陶宛MBI Fermentas公司。PCR引物由上海申友生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。10mM dNTP、Pfu高保真DNA聚合酶(5Unit/μl)購(gòu)自上海申能博采公司。PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海申友公司完成。
根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中公開發(fā)表的EGFR(X00588)和GAPDH(M33197)基因序列，采用美國(guó)賽百盛公司提供的引物設(shè)計(jì)軟件，分別設(shè)計(jì)了2組引物(表3)。
表3 PCR引物及探針序列

選擇活躍增殖期細(xì)胞按試劑盒要求抽提總RNA，采用紫外分光光度計(jì)(Biophotometer，德國(guó)Eppendorf公司)測(cè)定A260及A280。
取2μg RNA按試劑盒要求合成cDNA，反應(yīng)體積為20μl。
PCR反應(yīng)混合液為1μl cDNA，上游及下游引物1(50μM)各1μl，dNTP 1μl，Pfu酶1μl，加DEPC-H2O至50μl，石臘油30μl覆蓋。PCR反應(yīng)條件為95℃變性5min；95℃1min，56或60℃1min，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。
PCR產(chǎn)物經(jīng)1.6％瓊脂糖電泳100V 30min，RB染色攝片。陽性產(chǎn)物的測(cè)序采用上游引物，由上海申友公司協(xié)助完成。
1.2結(jié)果圖1結(jié)果顯示，在給定的反應(yīng)條件下，引物1能擴(kuò)增出單一條帶。取引物1PCR產(chǎn)物，采用引物2進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，也獲得了單一條帶，其PCR產(chǎn)物大小與應(yīng)用cDNA直接擴(kuò)增所得結(jié)果相同，說明引物2對(duì)所選定的基因具有高度特異性。測(cè)序后證實(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列與預(yù)期序列完全一致。
實(shí)施例2腫瘤細(xì)胞中EGFR基因和蛋白表達(dá)的相關(guān)性2.1材料與方法人體肺癌細(xì)胞株H460由美國(guó)德州大學(xué)MD Anderson癌癥中心Paul J Chiao教授惠贈(zèng)。人體肺癌細(xì)胞株SPC-A1及SPC-L1，人體乳腺癌細(xì)胞株SK-BR3購(gòu)自中科院上海生化細(xì)胞所。H460及SK-BR3細(xì)胞采用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，SPC-A1及SPC-L1細(xì)胞采用含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。
PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自上海申能博彩公司。定量PCR引物(引物2)及熒光素標(biāo)記探針由上海申友公司合成。熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程公司。
EGFR特異性抗體C225及熒光素FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自美國(guó)NeoMarker公司。
應(yīng)用引物1對(duì)SPC-A1細(xì)胞RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定雙鏈DNA含量，純化產(chǎn)物中的基因拷貝數(shù)按下述公式計(jì)算基因拷貝數(shù)/μl＝[A260/13.2×片斷長(zhǎng)度(kb)]×6.02×1011定量PCR反應(yīng)母液10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μl，250mM MgCl20.75μl，100μM上游及下游引物2各0.1μl(400nM)，50μM熒光素標(biāo)記探針0.1μl(200nM)，10mM dNTP 0.5μl，熱啟動(dòng)Taq(TaKaRa Ex Taq HS)酶0.25μl(1.25U)，加DEPC-H2O至23μl。上述反應(yīng)母液保存于-70℃。
定量PCR反應(yīng)液23μl反應(yīng)母液中加入2μl cDNA。
定量PCR反應(yīng)條件50℃預(yù)熱300秒；95℃變性300秒；95℃20秒，60℃60秒，40個(gè)循環(huán)，60℃檢測(cè)；37℃30秒。
定量PCR儀為L(zhǎng)ightCycler(瑞士Roche公司)。
流式細(xì)胞分析取活躍增殖期細(xì)胞，調(diào)整至107細(xì)胞/ml。在5ml塑料離心管內(nèi)分別加入100μl細(xì)胞及1μg抗體，置冰浴30min后用磷酸緩沖液(PBS，pH7.4)離心洗滌2次，重懸細(xì)胞于100μl PBS中(內(nèi)含10％牛血清及5μg熒光素FITC標(biāo)記的羊抗鼠Ig G)，冰浴30min后用PBS離心洗滌2次，上機(jī)分析(美國(guó)Beckman-Coulter公司EPICS XL型流式細(xì)胞儀)。
2.3結(jié)果A、標(biāo)準(zhǔn)曲線分析在基因拷貝數(shù)為105-108范圍內(nèi)，應(yīng)用本方法能夠給出線性結(jié)果，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R均＞0.999(見圖3和圖4)。此外，反應(yīng)母液保存于-70℃條件下在6個(gè)月內(nèi)非常穩(wěn)定，不同實(shí)驗(yàn)間誤差≤5％。
B、腫瘤細(xì)胞中EGFR基因及蛋白表達(dá)分析不同的人體腫瘤細(xì)胞表達(dá)EGFR基因有明顯差異。若以內(nèi)參照基因GAPDH拷貝數(shù)作為基準(zhǔn)，各細(xì)胞株的表達(dá)值(EGFR拷貝數(shù)/103GAPDH拷貝數(shù))見表4。
為了進(jìn)一步分析mRNA表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性，本發(fā)明者采用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)了上述細(xì)胞表面EGFR蛋白的表達(dá)(圖2例舉了陽性表達(dá)細(xì)胞SPC-A1的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果)。表4結(jié)果表明，細(xì)胞表面EGFR蛋白的熒光指數(shù)(FI)和陽性細(xì)胞百分率與實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)到的基因表達(dá)值之間存在較好的相關(guān)性。因此，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)上述基因的mRNA表達(dá)，可以反映其蛋白的表達(dá)水平。
表4腫瘤細(xì)胞中EGFR基因及蛋白表達(dá)的相關(guān)性

實(shí)施例3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的敏感性分析3.1材料與方法人體肺癌細(xì)胞SPC-A1培養(yǎng)在含10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)液中。Trizol RNA抽提試劑盒及糖原購(gòu)自上海申能博采生物科技有限公司。RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒購(gòu)自立陶宛MBI Fermentas公司。EGFR及GAPDH定量PCR分析試劑見實(shí)施例2。
取活躍增殖期細(xì)胞，調(diào)整至1×105，1×104，1×103及1×102細(xì)胞/ml。各濃度細(xì)胞分別取50μl，加入800μl Trizol及10μl糖原，按試劑盒方法抽提RNA。所得的RNA溶解于10μl DEPC-H2O中供cDNA合成，反應(yīng)體積為20μl。
各取2μl cDNA進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件見實(shí)施例2。
3.2結(jié)果表5結(jié)果顯示，應(yīng)用本方法在5-5000個(gè)腫瘤細(xì)胞范圍內(nèi)能夠獲得線性檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，定量PCR檢測(cè)EGFR基因表達(dá)的敏感性為5個(gè)腫瘤細(xì)胞/樣本。
表5 EGFR基因表達(dá)的定量PCR檢測(cè)

實(shí)施例4肺癌組織EGFR基因表達(dá)的定量PCR分析4.1材料與方法55例非小細(xì)胞肺癌，男性42例，女性13例。所有腫瘤組織均經(jīng)病理檢查證實(shí)，組織類型為腺癌22例，鱗癌20例，腺鱗癌13例。病理分期為I期18例，II期12例，III期25例。
10例正常肺組織取自距離肺癌病灶5cm以上的手術(shù)切除肺葉，經(jīng)病理檢查不含癌組織。
實(shí)驗(yàn)所用試劑及方法詳見實(shí)施例2和3。
4.2結(jié)果
10例正常肺組織中EGFR表達(dá)值為244.89±146.73(單位拷貝數(shù)/103GAPDH拷貝)。55例肺癌組織中EGFR表達(dá)值為768.47±1128.92。以正常肺組織EGFR均數(shù)+2標(biāo)準(zhǔn)差(540)作為陽性標(biāo)準(zhǔn)，則肺癌中EGFR陽性率為43.6％(24/55例)，其中EGFR表達(dá)值大于陽性標(biāo)準(zhǔn)2倍(1080)的高表達(dá)者8例，占14.5％。
實(shí)施例5肺癌活檢組織中EGFR基因表達(dá)的定量PCR分析5.1材料與方法10例肺癌患者在知情同意下接受活檢手術(shù)，其中5例為纖維支氣管鏡下獲得的活檢及毛篩樣本，2例為鎖骨上淋巴結(jié)穿刺樣本，3例為胸水。所有活檢材料均經(jīng)病理檢查，其中1例氣管鏡活檢組織和1例胸水中未找到癌細(xì)胞，其余組織均為肺腺癌。
活檢材料保存在生理鹽水中，經(jīng)1500rpm離心2min后去上清，組織材料于-70℃保存待測(cè)。胸水經(jīng)1500rpm離心10min后去上清，細(xì)胞沉淀重懸于5ml生理鹽水中，然后每樣本中加入50μl EPCAM(上皮細(xì)胞粘附分子)抗體交聯(lián)的免疫微球(挪威Dynal Biotech ASA公司)，在室溫下以30rpm轉(zhuǎn)速顛倒混勻2小時(shí)，按試劑盒要求分離陽性細(xì)胞組分。-70℃保存待測(cè)。
實(shí)驗(yàn)所用試劑及方法詳見實(shí)施例2和3。
5.2結(jié)果活檢材料首先進(jìn)行GAPDH和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)mRNA檢測(cè)，若未檢測(cè)到GAPDHmRNA，表明其中不含細(xì)胞成分。GAPDH mRNA檢測(cè)陽性的樣本進(jìn)行hTERT mRNA檢測(cè)，若hTERT mRNA高于正常肺組織陽性標(biāo)準(zhǔn)(10拷貝/103GAPDH拷貝)，則表明為癌性組織(資料未列)。
10例樣本1例胸水中不含細(xì)胞成分，1例氣管鏡活檢組織不含癌細(xì)胞，檢測(cè)結(jié)果與病理檢查吻合。8例癌性活檢組織中4例EGFR表達(dá)低于陽性標(biāo)準(zhǔn)，4例為陽性表達(dá)，陽性率為50.0％，其中2例為高表達(dá)，占25.0％。
實(shí)施例6肺癌病人外周血微轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞中EGFR基因表達(dá)的定量PCR分析6.1材料與方法60例IIIb-IV期肺癌患者，男性38例，女性22例，組織類型為腺癌55例，肺泡細(xì)胞癌5例，其中40例未接受過手術(shù)治療，20例為術(shù)后復(fù)發(fā)。
27例健康志愿者，男性20例，女性7例，均為在校大學(xué)生。
所有人員均在知情同意下采集外周血5ml，10U/ml肝素抗凝。
血液樣本經(jīng)1500rpm離心10min后去血漿，用生理鹽水加至5ml，然后每樣本中加入50μl EPCAM抗體交聯(lián)的免疫微球(挪威Dynal Biotech ASA公司)，在室溫下以30rpm轉(zhuǎn)速顛倒混勻2小時(shí)，按試劑盒要求分離陽性細(xì)胞組分。-70℃保存待測(cè)。
實(shí)驗(yàn)所用試劑及方法詳見實(shí)施例2和3。
6.2結(jié)果27例健康人血液樣本中20例不含細(xì)胞成分，其余7例樣本不含癌細(xì)胞。
60例肺癌血液樣本11例不含細(xì)胞成分，其余49例中6例不含癌細(xì)胞，因而癌細(xì)胞檢出率為71.7％(43/60例)。此43例中EGFR低于陽性標(biāo)準(zhǔn)的有21例，占48.8％，陽性表達(dá)的有22例，占51.2％，其中高表達(dá)的有18例，占41.9％。
表6列舉了腫瘤原發(fā)組織、活檢組織和外周血癌細(xì)胞中EGFR基因表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示，EGFR的陽性檢出率在不同來源的樣本中基本相同，說明以微量活檢組織和外周血癌細(xì)胞為材料進(jìn)行EGFR基因表達(dá)分析，可以作為判斷原發(fā)腫瘤中該基因表達(dá)水平的依據(jù)。但外周血癌細(xì)胞中EGFR高表達(dá)的比例顯著高于原發(fā)腫瘤和活檢組織，提示腫瘤組織中EGFR高表達(dá)的癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。
表6腫瘤原發(fā)組織、活檢組織和外周血癌細(xì)胞中EGFR基因表達(dá)

注EGFR正常范圍為＜540；陽性表達(dá)為≥540；高表達(dá)為≥1080。
雖然上面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了具體描述，但是熟悉本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員均了解，在不違背本發(fā)明的原則和精神的情況下，根據(jù)本說明書及所附權(quán)利要求書中公開的內(nèi)容，可對(duì)本發(fā)明做出各種變動(dòng)和改進(jìn)。因此，所有這些變動(dòng)和改進(jìn)均應(yīng)包括在所附權(quán)利要求書中所要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
序列表<110>董，強(qiáng)剛<120>實(shí)時(shí)定量檢測(cè)上皮生長(zhǎng)因子受體基因表達(dá)水平的試劑盒和方法<130>041069<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1cacatcgctc agacaccatg 20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2aggcattgct gatgatcttg a 21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3ggaaggtgaa ggtcggagtc 20<210>4<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4gaagatggtg atgggatttc 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>探針<400>5caagcttccc gttctcagcc 20<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6taacatcctt gggattacgc t 21<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7gtacttccag accagggtgt t 21<210>8<211>18
<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8cccagggact gcgtctct 18<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>9cactctgggt ggcactgtat g 21<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>探針<400>10ccggaatgtc agccgaggca g 2權(quán)利要求
1.一種體外定量檢測(cè)靶細(xì)胞中上皮生長(zhǎng)因子受體EGFR基因表達(dá)水平的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)從靶細(xì)胞中抽提RNA并獲得cDNA；(2)在EGFR基因序列第1744-1871位核苷酸區(qū)間內(nèi)選擇引物和Taqman探針，并根據(jù)EGFR基因序列第1520-2016位核苷酸制備標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用Taqman技術(shù)對(duì)EGFR基因表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶細(xì)胞是癌細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述靶細(xì)胞來自活檢標(biāo)本。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述靶細(xì)胞來自胸水或外周血。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，該方法還包括這樣一個(gè)步驟在步驟(1)之前，先用磁性分選方法從胸水或外周血中分離出靶細(xì)胞。
6.一種用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)靶細(xì)胞中EGFR基因表達(dá)水平的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含特異性上游引物、下游引物、DNA標(biāo)準(zhǔn)品以及Taqman探針，其中所述特異性上游和下游引物和Taqman探針在EGFR基因序列第1744-1871位核苷酸區(qū)間內(nèi)進(jìn)行選擇，所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)EGFR基因序列第1520-2016位核苷酸進(jìn)行制備。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中所述引物具有SEQ ID NO8、9所示的序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中所述Taqman探針具有SEQ ID NO10所示的序列，且其5′端與熒光報(bào)告基團(tuán)相連，3′端與熒光淬滅基團(tuán)相連。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品用具有SEQ ID NO6和7所示序列的引物擴(kuò)增獲得。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種體外定量檢測(cè)靶細(xì)胞中上皮生長(zhǎng)因子受體EGFR基因表達(dá)水平的方法，該方法包括以下步驟從靶細(xì)胞中抽提RNA并獲得cDNA；在EGFR基因序列第1744－1871位核苷酸區(qū)間內(nèi)選擇引物和Taqman探針，并根據(jù)EGFR基因序列第1520－2016位核苷酸制備標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用Taqman技術(shù)對(duì)EGFR基因表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。本發(fā)明還提供了用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)靶細(xì)胞中EGFR基因表達(dá)水平的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1673388SQ200410017150
公開日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2004年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月24日
發(fā)明者董強(qiáng)剛 申請(qǐng)人:董強(qiáng)剛