專利名稱：對大腸桿菌o33型的o－抗原特異的核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大腸桿菌O33型(Escherichia coli O33)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特別是涉及大腸桿菌O33型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用這些對O-抗原特異的寡核苷酸快速、準(zhǔn)確地檢測人體及環(huán)境中的大腸桿菌O33型并鑒定這些致病菌中的O-抗原。
背景技術(shù)：
O-抗原是革蘭氏陰性細(xì)菌脂多糖中的O特異性多糖成分，它由許多重復(fù)的寡糖單位組成。O-抗原的合成過程研究得較清楚先由糖基轉(zhuǎn)移酶將核苷二磷酸單糖轉(zhuǎn)移到一個(gè)固定在細(xì)胞內(nèi)膜的脂分子上，然后在內(nèi)膜的內(nèi)側(cè)合成寡糖單位，O-抗原的寡糖單位再通過轉(zhuǎn)運(yùn)酶被轉(zhuǎn)移到內(nèi)膜外側(cè)，而后通過聚合酶聚合成多糖，再被連接到一個(gè)糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics oflipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.MicrobiologicalReviews，57(3)655-682]。編碼負(fù)責(zé)O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色體上相鄰排列，形成一個(gè)基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterialpolysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4495-503]。在志賀氏菌、大腸桿菌和沙門氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之間[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigenlociimplication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，116923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coliO111 and Salmonella enterica O35 gene clustersgene clusters encoding the samecolitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.1825256-5261]。O-抗原基因簇含有三類基因糖合成路徑基因，糖基轉(zhuǎn)移酶基因，寡糖單位處理基因，其中糖合成路徑基因編碼的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸單糖；糖基轉(zhuǎn)移酶基因編碼的酶將核苷二磷酸單糖及其它分子轉(zhuǎn)到單糖上從而使單糖聚合成寡糖單位；寡糖單位處理基因包括轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因，它們將寡糖單位轉(zhuǎn)移到細(xì)菌內(nèi)膜外側(cè)，再聚合成多糖。糖基轉(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理基因只存在于攜帶這些基因的基因簇里。O-抗原中單糖的不同，單糖間聯(lián)結(jié)鍵的不同和寡糖單位之間聯(lián)結(jié)鍵的不同構(gòu)成了O-抗原的多樣性，而單糖的組成、單糖間的聯(lián)結(jié)鍵及寡糖單位之間的聯(lián)結(jié)鍵是由O-抗原基因簇中的基因控制著，所以O(shè)-抗原基因簇決定了O-抗原的合成，也決定了O-抗原的多樣性。
因?yàn)镺-抗原是極強(qiáng)的抗原，是大腸桿菌重要的致病因素之一，同時(shí)它又具有極強(qiáng)的多樣性，這啟示我們能研究一種快速、準(zhǔn)確地檢測大腸桿菌及其O-抗原的特異性好、靈敏度高的方法。以表面多糖為目標(biāo)的血清學(xué)免疫反應(yīng)自上世紀(jì)30年代以來一直被用于對細(xì)菌的分型和鑒定，是鑒定致病菌的唯一的手段。這種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類不全，數(shù)量不足，大量的抗血清在制備和儲存中也存在一些困難。另一方面此法耗時(shí)長、靈敏度低、漏檢率高、準(zhǔn)確性差，所以，現(xiàn)在普遍認(rèn)為這種傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測方法將為現(xiàn)代分子生物學(xué)方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙門氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特異核苷酸序列通過PCR方法鑒定了沙門氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose andparatose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification ofS.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.312118-2123]。Luk，et.al的方法是將相應(yīng)于沙門氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原內(nèi)的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到對不同血清型的沙門氏菌特異的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用對E.coli O111的O-抗原特異的源于wbdI基因的寡核苷酸鑒定了一株產(chǎn)毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.341622-1627]，但是后來的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鑒定E.coli O111的血清型的方法有假陽性結(jié)果出現(xiàn)。Bastin D.A.and Reeves，P.R.認(rèn)為，這是由于wbdI基因是一個(gè)推測的糖合成路徑基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster ofEscherichia coli O111.Gene 16417-23]，而在其它細(xì)菌的O-抗原的結(jié)構(gòu)中也可能有這個(gè)糖，所以糖合成路徑基因?qū)τ贠-抗原并不是高度特異的志賀氏菌有46種血清型，但只有33種不同的O-抗原，大腸桿菌有166種不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，niche specificselection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett，100509-516]，二者親緣關(guān)系非常近，并且有12種是大腸桿菌和志賀氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenicrelationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigensO28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and and Shigella O antigens”J.clinMicrobiol，17(4)681-684]發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供了一種對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸。它是大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基轉(zhuǎn)移酶基因和轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因及聚合酶基因的特異的核苷酸。
本發(fā)明的次一目的是提供了大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇的全長核苷酸序列。
本發(fā)明的另一目的是提供了構(gòu)成大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇的基因轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因即wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf5、orf6、orf7基因。
本發(fā)明的又一目的是提供了寡核苷酸，它們分別源于大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇中編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因包括orf5、orf6、orf7基因；源于編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因即wzx基因或與wzx有相似功能的基因；源于編碼聚合酶的基因即wzy基因或與wzy有相似功能的基因；它們是上述基因內(nèi)的寡核苷酸，長度在10-20nt；它們對大腸桿菌O33型的O-抗原是特異的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它們對大腸桿菌O33型的O-抗原是高度特異的，而且這些寡核苷酸還可重新組合，組合后的寡核苷酸對大腸桿菌O33型的O-抗原也是高度特異的。
本發(fā)明再一目的是提供的上述寡核苷酸可作為引物用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或用于制造基因芯片或微陣列，從而通過這些方法檢測和鑒定大腸桿菌O33型的O-抗原及檢測和鑒定大腸桿菌O33型。
本發(fā)明的還一目的是提供了分離大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以獲得其他細(xì)菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以獲得編碼其他多糖抗原的細(xì)菌的基因簇的全序列。
本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸，其是如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長9058個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
前述的對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸，其是由命名為orf1，wzx，orf3，wzy，orf5，orf6，orf7的7個(gè)基因組成，都位于galF基因和gnd基因之間。
前述的對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸，其中所述基因中具有高度特異性的基因是轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf5、orf6、orf7基因；其中所述的基因wzx是SEQ ID NO1中的2627至3871堿基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO1中的5019至6221堿基的核苷酸；orf5是SEQ ID NO1中的6190至6933堿基的核苷酸；orf6是SEQ ID NO1中的6936至7829堿基的核苷酸；orf7是SEQ ID NO1中的7838至8683堿基的核苷酸。
前述的對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸，其中它還包括源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基轉(zhuǎn)移酶基因orf5、orf6、orf7基因；以及它們的混合或它們的重組。
前述的對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸，其中所述的源于wzx基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的2822至2839堿基的核苷酸和3387至3402堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的3008至3023堿基的核苷酸和3320至3336堿基的核苷酸。源于wzy基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的5325至5340堿基的核苷酸和5898至5913堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5848至5864堿基的核苷酸和6132至6147堿基的核苷酸。
前述的對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸在檢測表達(dá)O-抗原的細(xì)菌、鑒定細(xì)菌的O-抗原和細(xì)菌的其它多糖抗原中的應(yīng)用。
前述的對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸的重組分子，在通過插入表達(dá)而提供表達(dá)大腸桿菌O33型的O-抗原，以及制備細(xì)菌疫苗中的應(yīng)用。
前述的對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸的應(yīng)用，其特征在于，它作為引物用于PCR、作為探針用于雜交反應(yīng)與熒光檢測、或者用于制造基因芯片或微陣列，供檢測細(xì)菌。
前述的對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，其包括下述步驟(1)基因組的提取在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌O33型，離心收集細(xì)胞；得到的基因組DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O33型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O33型的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇，將得到的PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的大小及其特異性，合并該long PCR產(chǎn)物，并用DNA純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫將Long PCR純化產(chǎn)物應(yīng)用鳥槍法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫；(4)對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的克隆用實(shí)驗(yàn)室常用的DNA自動測序儀對克隆中的插入片段進(jìn)行測序，序列達(dá)到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析應(yīng)用生物信息學(xué)軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列；(6)特異基因的篩選針對大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因設(shè)計(jì)引物；在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)了兩對引物，每對引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，確定wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O33型的O-抗原的高度特異性；(7)引物靈敏度的檢測培養(yǎng)大腸桿菌O33，細(xì)菌計(jì)數(shù)后分別將5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌加入到一定量的某種待檢測物中，混入細(xì)菌的待檢測物作為檢測用樣品，將樣品加入LB培養(yǎng)基，取一些與樣品混合過的LB培養(yǎng)基過濾，將過濾液進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)好的菌液中取數(shù)毫升處理后作為PCR模板用寡核苷酸進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測其對大腸桿菌O33的靈敏度。
前述的對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，其包括下述步驟(1)基因組的提取在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌O33型，離心收集細(xì)胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細(xì)胞，37℃溫育20分鐘，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時(shí)，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘，加等體積酚抽提混合物，取上清再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提兩次，取上清再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚。上清用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，將DNA重懸于30ul TE中；基因組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O33型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O33型的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇，首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇啟動子區(qū)的galF序列設(shè)計(jì)上游引物(#1523-ATT GTG GCTGCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設(shè)計(jì)下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴(kuò)增O-抗原基因簇，PCR反應(yīng)程序如下在94℃預(yù)變性2分鐘；然后94℃變性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分鐘，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后，在68℃繼續(xù)延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的大小及其特異性，合并5管long PCR產(chǎn)物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫，反應(yīng)體系是300ng PCR純化產(chǎn)物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應(yīng)在室溫中進(jìn)行，酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應(yīng)。合并4管同樣的反應(yīng)體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等體積的乙醚抽提一次后，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中，隨后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mMDTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃30分鐘，將酶切產(chǎn)物補(bǔ)成平端，75℃終止反應(yīng)后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應(yīng)的緩沖液并將體系擴(kuò)大為80ul，70℃反應(yīng)20分鐘，使DNA的3′端加dA尾。此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接10小時(shí)，總體積為90ul。其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶，最后用1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產(chǎn)物；用BiO-Rad公司的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備方法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉(zhuǎn)到BiO-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時(shí)間為5.0毫秒至6.0毫秒，電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇，然后將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃過夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落，將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)從每個(gè)克隆中提取質(zhì)粒，并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群構(gòu)成了大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇文庫；(4)對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的96個(gè)克隆用本實(shí)驗(yàn)室ABI3730型DNA自動測序儀對克隆中的插入片段進(jìn)行測序，序列達(dá)到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英國劍橋MRC(Medical Research Council)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列；序列的質(zhì)量主要由兩個(gè)方面來保證1)對大腸桿菌O33型的基因組作5個(gè)Long PCR反應(yīng)，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫，2)對每個(gè)堿基，保證3個(gè)以上高質(zhì)量的覆蓋率，在得到大腸桿菌O33型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國國家生物技術(shù)信息學(xué)中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到7個(gè)開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對，最后得到大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)；(6)特異基因的篩選針對大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因設(shè)計(jì)引物；在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)了兩對引物，每對引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，除在含大腸桿菌O33的第13組中得到了預(yù)期大小的一條帶外，在其他組中都沒有擴(kuò)增到預(yù)期片段大小的正確產(chǎn)物，所以wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O33型的O-抗原都是高度特異的。
(7)引物靈敏度的檢測購買市場上的生豬肉餡，攪拌均勻，分成20g一份，存在-40℃冰箱中備用。將10μl大腸桿菌O33的凍存菌液接種到有20ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37℃，200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)12小時(shí)至飽和，取少量培養(yǎng)好的菌液作106和107倍的稀釋，其余的菌液放于4℃的冰箱中備用，取50μl稀釋菌液涂布LB瓊脂平板，37度，培養(yǎng)12h，對所涂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算原液中活菌濃度。在5份生豬肉餡中分別摻入5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌，攪拌均勻，加入200ml LB培養(yǎng)基，經(jīng)6層紗布過濾，過濾液于37℃，200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)12h。從培養(yǎng)好的菌液中取3ml菌液于6,000g離心5分鐘，去上清，加100μl MQ超純水吹開沉淀并混勻，放入100度沸水中煮15分鐘，裂解液于12,000g離心8分鐘，取1μ上清做為PCR模板。用4對寡核苷酸對，SEQ ID NO1中的2822至2839堿基的核苷酸和3387至3402堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的3008至3023堿基的核苷酸和3320至3336堿基的核苷酸。源于wzy基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的5325至5340堿基的核苷酸和5898至5913堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5848至5864堿基的核苷酸和6132至6147堿基的核苷酸，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反應(yīng)條件為95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取10μl反應(yīng)產(chǎn)物電泳，若有與預(yù)期大小相符的擴(kuò)增帶，則結(jié)果為陽性，若沒有，則結(jié)果為陰性。參入了5×103，5×102，5×101，和5個(gè)活菌的每份豬肉餡均在4對引物的PCR反應(yīng)中得到陽性結(jié)果。參入0個(gè)活菌的豬肉餡在4對引物的PCR反應(yīng)中得到陰性結(jié)果。說明使用上述方法時(shí)，這4對引物對豬肉餡中的大腸桿菌O33的檢測靈敏度均為0.25個(gè)菌/g。
也就是，本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇的全長核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO1所示，全長9058個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。通過本發(fā)明的方法得到了大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)，如表3所示，它總共由命名為orf1，wzx，orf3，wzy，orf5，orf6，orf7的7個(gè)基因組成，都位于galF基因和gnd基因之間。
本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇中的基因，即轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因(wzx基因或與wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或與wzy有相似功能的基因)；糖基轉(zhuǎn)移酶基因(orf5、orf6、orf7基因)。它們在O-抗原基因簇中的起始位置和終止位置及核苷酸序列都列在表4中；本發(fā)明尤其涉及到糖基轉(zhuǎn)移酶基因、轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因，因?yàn)樘呛铣陕窂交蚣春铣珊塑斩姿釂翁堑幕颥F(xiàn)在被預(yù)示對較多胞外多糖是常見的、共同的，對細(xì)菌的O-抗原并不是很特異的，而本發(fā)明涉及的糖基轉(zhuǎn)移酶基因、轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因?qū)Υ竽c桿菌O33型的O-抗原是高度特異的。
本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了源于大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇中的wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因和糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf5、orf6、orf7基因的寡核苷酸，它們是這些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，優(yōu)先被用的是列于表1中的寡核苷酸對，在表1中也列出了這些寡核苷酸對在O-抗原基因簇中的位置及以這些寡核苷酸對為引物所做的PCR反應(yīng)的產(chǎn)物的大小，這些PCR反應(yīng)可用表中的退火溫度進(jìn)行。這些引物除在第13組中得到了預(yù)期大小的一條帶外，在其他組中都沒有擴(kuò)增到任何產(chǎn)物，所以wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O33型的O-抗原都是高度特異的。
所述的對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法包括下述步驟1)基因組的提??；2)PCR擴(kuò)增大腸桿菌O33型中的O-抗原基因簇；3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫；4)對文庫中的克隆測序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特異基因的篩選；7)引物靈敏度的檢測。
本發(fā)明的其他方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
如本發(fā)明所用，“寡核苷酸”主要指來源于O-抗原基因簇中的編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因、編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和編碼聚合酶的基因內(nèi)的一段核苷酸分子，它們在長度上可改變，一般在10到20個(gè)核苷酸范圍內(nèi)改變；更確切說這些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1中的2627至3871堿基的核苷酸)；wzy基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1中的5019至6221堿基的核苷酸)。源于以上基因內(nèi)的寡核苷酸對大腸桿菌O33型是高度特異的。
此外，有時(shí)兩個(gè)遺傳相似的編碼不同O-抗原的基因簇通過基因重組或突變產(chǎn)生新的O-抗原，從而產(chǎn)生新的細(xì)菌類型，新的突變株。在這種環(huán)境中，需要篩選出多對寡核苷酸同重組基因雜交以提高檢測的特異性。因此，本發(fā)明提供了一整套多對寡核苷酸的混合物，它們源于糖基轉(zhuǎn)移酶基因；源于轉(zhuǎn)運(yùn)酶和聚合酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。這些基因的混合物對一個(gè)特殊的細(xì)菌多糖抗原來說是特異的，從而使這套寡核苷酸對這個(gè)細(xì)菌的多糖抗原是特異的。更具體地說，這些寡核苷酸的混合物是源于糖基轉(zhuǎn)移酶基因、wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的組合。
在另一方面，本發(fā)明涉及寡核苷酸的鑒定，它們可以用于檢測表達(dá)O-抗原的細(xì)菌和在診斷中鑒定細(xì)菌的O-抗原。
本發(fā)明涉及到一種檢測食品中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原的方法，這些抗原可以使樣品能與以下至少一個(gè)基因的寡核苷酸特異性雜交，這些基因是(i)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因(ii)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。在條件許可的情況下至少一個(gè)寡核苷酸能與至少一個(gè)表達(dá)特殊的O-抗原的細(xì)菌的一個(gè)以上的那樣的基因特異性雜交，這些細(xì)菌是大腸桿菌O33型。可用PCR方法檢測，更可以將本發(fā)明方法中的核苷酸標(biāo)記后作為探針通過雜交反應(yīng)如southern-blot或熒光檢測，或者通過基因芯片或微陣列檢測樣品中的抗原及細(xì)菌。
本發(fā)明設(shè)計(jì)者考慮到以下情況當(dāng)單個(gè)的特異的寡核苷酸檢測無效時(shí)，寡核苷酸的混合物能與靶區(qū)域特異性雜交以檢測樣品。因此本發(fā)明提供了一套寡核苷酸用于本發(fā)明所述的檢測方法。這里所說的寡核苷酸是指源于編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因、編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。這套寡核苷酸對一個(gè)特殊的細(xì)菌的O-抗原來說是特異的，這一特殊的細(xì)菌O-抗原是由大腸桿菌O33型表達(dá)的。
另一方面，本發(fā)明涉及到一種檢測排泄物中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原的方法，這些抗原可以使樣品能與以下至少一個(gè)基因的寡核苷酸特異性雜交，這些基因是(i)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因(ii)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。在條件許可的情況下至少一個(gè)寡核苷酸能與至少一個(gè)表達(dá)特殊的O-抗原的細(xì)菌的一個(gè)以上的那樣的基因特異性雜交。這些細(xì)菌是大腸桿菌O33型?？捎帽景l(fā)明中的寡核苷酸作引物通過PCR的方法檢測樣品，也可將本發(fā)明中的寡核苷酸分子標(biāo)記后作為探針通過雜交反應(yīng)如southern-blot或熒光檢測，或者通過基因芯片或微陣列檢測樣品中的抗原及細(xì)菌。
一般一對寡核苷酸可能與同樣的基因雜交也可與不同的基因雜交，但它們中必須有一個(gè)寡核苷酸能特異性雜交到特殊抗原型的特異序列上，另一個(gè)寡核苷酸可雜交于非特異性區(qū)域。因此，當(dāng)特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新組合時(shí)，至少能選出一對寡核苷酸與多糖抗原基因簇中特異基因混合物雜交，或者選出多對寡核苷酸與特異基因的混合物雜交。甚至即使當(dāng)一個(gè)特殊的基因簇中所有基因都獨(dú)一無二時(shí)，此方法也能應(yīng)用于識別此基因簇內(nèi)的基因混合物的核苷酸分子。因此本發(fā)明提供了一整套用于檢測本發(fā)明方法的多對寡核苷酸，在這里多對寡核苷酸是源于編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因、編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶和聚合酶的基因包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因，這套寡核苷酸對一個(gè)特殊的細(xì)菌多糖來說是特異的，這套寡核苷酸可能是糖合成中必須基因的核苷酸。
另一方面，本發(fā)明也涉及到一種檢測源于病人的樣品中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原的方法。樣品中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原可以使樣品能與以下至少一個(gè)基因中的一對寡核苷酸中的一個(gè)特異性雜交，這些基因是(i)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因(ii)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。在條件許可的情況下至少一個(gè)寡核苷酸能與樣品中的至少一個(gè)表達(dá)特殊的O-抗原的細(xì)菌的一個(gè)以上的那樣的基因特異性雜交，這些細(xì)菌是大腸桿菌O33型?？捎帽景l(fā)明中的寡核苷酸作引物通過PCR的方法檢測樣品，也可將本發(fā)明中的寡核苷酸標(biāo)記后作為探針通過雜交反應(yīng)，或者通過基因芯片或微陣列檢測樣品中的抗原及細(xì)菌。
更詳細(xì)地說，以上描述的方法可以理解為當(dāng)寡核苷酸對被使用時(shí)，其中的一個(gè)寡核苷酸分子能雜交到一個(gè)并不是來源于糖基轉(zhuǎn)移酶基因、wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因的序列上。此外，當(dāng)兩個(gè)寡核苷酸都能雜交上時(shí)，它們可能雜交于同一基因也可能雜交到不同基因上。也即，當(dāng)交叉反應(yīng)出現(xiàn)問題時(shí)，可選擇寡核苷酸的混合物來檢測混合的基因以提供檢測的特異性。
本發(fā)明者相信本發(fā)明不必限于以上所提的核苷酸序列編碼的特定的O-抗原，而且廣泛應(yīng)用于檢測所有表達(dá)O-抗原和鑒定O-抗原的細(xì)菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如細(xì)菌胞外抗原)合成之間的相似性，本發(fā)明的方法和分子也應(yīng)用于這些其他的多糖抗原。
本發(fā)明首次公開了大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇的全長序列，而且可從這個(gè)未被克隆的全長基因簇的序列中產(chǎn)生重組分子，通過插入表達(dá)可產(chǎn)生表達(dá)大腸桿菌O33型的O-抗原，并成為有用的疫苗。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件。
實(shí)施例1基因組的提取在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌O33型，離心收集細(xì)胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細(xì)胞，37℃溫育20分鐘，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時(shí)，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提兩次，取上清再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚，上清用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ul TE中?；蚪MDNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
實(shí)施例2通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O33型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O33型的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇。首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇啟動子區(qū)的galF序列設(shè)計(jì)上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設(shè)計(jì)下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGTTCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴(kuò)增O-抗原基因簇，PCR反應(yīng)程序如下在94℃預(yù)變性2分鐘；然后94℃變性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分鐘，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。最后，在68℃繼續(xù)延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的大小及其特異性。合并5管long PCR產(chǎn)物，并用Promega公司的Wizard PCRPreps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。
實(shí)施例3構(gòu)建O-抗原基因簇文庫首先是連接產(chǎn)物的獲得用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫。反應(yīng)體系是300ng PCR純化產(chǎn)物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應(yīng)在室溫中進(jìn)行。酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應(yīng)。合并4管同樣的反應(yīng)體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等體積的乙醚抽提一次后，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中。隨后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mMDTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃30分鐘，將酶切產(chǎn)物補(bǔ)成平端，75℃終止反應(yīng)后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應(yīng)的緩沖液并將體系擴(kuò)大為80ul，70℃反應(yīng)20分鐘，使DNA的3′端加dA尾。此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接10小時(shí)，總體積為90ul。其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶。最后用1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產(chǎn)物。
其次是感受態(tài)細(xì)胞的制備參照Bio-Rad公司提供的方法制備感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α。取一環(huán)大腸桿菌DH5α單菌落于5ml的LB培養(yǎng)基中，180rpm培養(yǎng)10小時(shí)后，取2ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到200ml的LB培養(yǎng)基中，37℃ 250rpm劇烈振蕩培養(yǎng)到OD600 0.5左右，然后冰浴冷卻20分鐘，于4℃ 4000rpm離心15分鐘。傾盡上清，用冷的冰預(yù)冷的去離子滅菌水200ml吹散菌體，于4℃ 4000rpm離心15分鐘。再用冷的冰預(yù)冷的去離子滅菌水100ml吹散菌體，于4℃ 4000rpm離心15分鐘。用冷的冰預(yù)冷的10％的甘油懸浮細(xì)胞，4℃6000rpm離心10分鐘，棄上清，最后沉淀用1ml冰預(yù)冷的10％的甘油懸浮細(xì)胞，即為感受態(tài)細(xì)胞。將制得的感受態(tài)細(xì)胞分裝為50ul一管，-70℃保存。
最后是電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉(zhuǎn)到Bio-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時(shí)間為5.0毫秒-6.0毫秒。電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇。然后立即將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37℃倒置過夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落。將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)從每個(gè)克隆中提取質(zhì)粒并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群構(gòu)成了大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇文庫。
實(shí)施例4對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的96個(gè)克隆用本實(shí)驗(yàn)室ABI3730型DNA自動測序儀對克隆中的插入片段單向進(jìn)行測序，使序列達(dá)到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列。
實(shí)施例5核苷酸序列的拼接及分析用英國劍橋MRC(Medical Research Council)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列(見序列列表)。序列的質(zhì)量主要由兩個(gè)方面來保證1)對大腸桿菌O33型的基因組作5個(gè)LongPCR反應(yīng)，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫。2)對每個(gè)堿基，保證3個(gè)以上高質(zhì)量的覆蓋率。在得到大腸桿菌O33型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國國家生物技術(shù)信息學(xué)中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到7個(gè)開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用ClustralW軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對，最后得到大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)，如表3所示。
通過檢索和比較，發(fā)現(xiàn)orf2和orf4是大腸桿菌O33種僅有的兩個(gè)編碼存在跨膜片段的蛋白的基因。orf2編碼的蛋白與Streptococcus pneumoniaeTIGR4(AAK74529)的O-抗原轉(zhuǎn)移酶有28％的序列一致性，通過HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)其含有12個(gè)均勻的跨膜片段，這是Wzx蛋白的典型特征。所以命名orf2為wzx。orf4編碼的蛋白與大腸桿菌(AAK64372)的O-抗原聚合酶有26％的一致性，45％的相似性，通過HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)其含有10個(gè)跨膜片段，并且有一個(gè)大的胞質(zhì)內(nèi)親水環(huán)(loop)，這是Wzy蛋白的典型特征。所以命名orf4為wzy。
orf5，6，7三個(gè)基因編碼的蛋白與其他已知的糖基轉(zhuǎn)移酶有24-36％的序列一致性和44-53％的序列相似性。通過對Pfam中糖基轉(zhuǎn)移酶基序數(shù)據(jù)庫的搜索，這三個(gè)基因編碼的蛋白與已知的糖基轉(zhuǎn)移酶家族1和2的共有序列的同源性預(yù)期值為1×e-12至5×e-17，因此我們推測這三個(gè)基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶，而且由于每個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶特異性催化形成一種二糖鍵，因此我們推測大腸桿菌O33的O-抗原的寡糖單位可能由四個(gè)單糖組成。由于這三個(gè)基因的確切功能還不能確定，因此我們將這三個(gè)基因暫命名為orf5，orf6和orf7。
Orf1基因編碼的蛋白與Streptococcus pneumoniae中編碼的Polysaccharide biosynthesis protein有36-38％的氨基酸序列一致性和59-60％的相似性，通過對Pfam中蛋白基序數(shù)據(jù)庫的搜索，這個(gè)基因編碼的蛋白與已知的Haloacid dehalogenase-like hydrolase和Nucleotidyltransferase的共有序列的同源性預(yù)期值為1.3×e-08至1.9×e-05，由于這個(gè)基因的確切功能還不能確定，因此我們將這個(gè)基因暫命名為orf1。Orf3基因編碼的蛋白與Bacillus subtilis(P13485)中編碼的glycerophosphotransferase有24％的氨基酸序列一致性和44％的相似性，通過對Pfam中蛋白基序數(shù)據(jù)庫的搜索，這個(gè)基因編碼的蛋白與已知的CDP-Glycerol的共有序列的同源性預(yù)期值為2×e-33，由于這個(gè)基因的確切功能還不能確定，因此我們將這個(gè)基因暫命名為orf3。
實(shí)施例6特異基因的篩選針對大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因設(shè)計(jì)引物，在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)了兩對引物，每對引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，除在含大腸桿菌O33的第13組中得到了預(yù)期大小的一條帶外，在其他組中都沒有擴(kuò)增到預(yù)期片段大小的正確產(chǎn)物，所以wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O33型的O-抗原都是高度特異的；這些基因在核苷酸序列中的位置見表1。
實(shí)施例7引物靈敏度的檢測。
購買市場上的生豬肉餡，攪拌均勻，分成20g一份，存在-40℃冰箱中備用。將10μl大腸桿菌O33的凍存菌液接種到有20ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37℃，200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)12小時(shí)至飽和，取少量培養(yǎng)好的菌液作106和107倍的稀釋，其余的菌液放于4℃的冰箱中備用，取50μl稀釋菌液涂布LB瓊脂平板，37度，培養(yǎng)12h，對所涂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算原液中活菌濃度。在5份生豬肉餡中分別摻入5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌，攪拌均勻，加入200ml LB培養(yǎng)基，經(jīng)6層紗布過濾，過濾液于37℃，200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)12h。從培養(yǎng)好的菌液中取3ml菌液于6,000g離心5分鐘，去上清，加100μl MQ超純水吹開沉淀并混勻，放入100度沸水中煮15分鐘，裂解液于12,000g離心8分鐘，取1μ上清做為PCR模板。用4對寡核苷酸對，SEQ ID NO1中的2822至2839堿基的核苷酸和3387至3402堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的3008至3023堿基的核苷酸和3320至3336堿基的核苷酸。源于wzy基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的5325至5340堿基的核苷酸和5898至5913堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5848至5864堿基的核苷酸和6132至6147堿基的核苷酸，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反應(yīng)條件為95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取10μl反應(yīng)產(chǎn)物電泳，若有與預(yù)期大小相符的擴(kuò)增帶，則結(jié)果為陽性，若沒有，則結(jié)果為陰性。參入了5×103，5×102，5×101，和5個(gè)活菌的每份豬肉餡均在4對引物的PCR反應(yīng)中得到陽性結(jié)果。參入0個(gè)活菌的豬肉餡在4對引物的PCR反應(yīng)中得到陰性結(jié)果。說明使用上述方法時(shí)，這4對引物對豬肉餡中的大腸桿菌O33的檢測靈敏度均為0.25個(gè)菌/g。
通過對O抗原基因簇的克隆和在減毒的疫苗菌株中的表達(dá)，可以組建重組疫苗。O抗原為最主要的革蘭氏陰性菌的表面抗原，可以引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，是制造重組疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret實(shí)驗(yàn)室成功的將志賀氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙門氏菌Tyziai疫苗菌中表達(dá)，動物實(shí)驗(yàn)證明可以引起兔子的免疫反應(yīng)(Molecular Microbiology 1993，7239-252)。中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的小組也在從事與Viret實(shí)驗(yàn)室類似的工作。王磊實(shí)驗(yàn)室在1999年成功的將大腸桿菌O111的O抗原基因簇在沙門氏菌疫苗STM-1中表達(dá)，并證明組建成的菌株可以引起小鼠的血液和體液反應(yīng)(Microbial Pathogenesis 1999，2755-59)。所以本發(fā)明O33的O抗原特異基因序列可以應(yīng)用于組建重組疫苗。
根據(jù)本發(fā)明的對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸序列(SEQ IDNO1所示)，構(gòu)造特異核酸探針，將其固定到芯片的載體上制成生物芯片，將要檢測的樣品適當(dāng)處理后，與生物芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)，然后利用生物芯片信號分析設(shè)備就可以得到樣品中相應(yīng)的細(xì)菌情況。這種大腸桿菌O抗原鑒定的DNA芯片將可以直接用于臨床和其它檢驗(yàn)場所(如食品加工和生產(chǎn)行業(yè)，畜牧獸醫(yī)行業(yè)海關(guān)檢疫等的微生物檢驗(yàn))。這種芯片只需要擴(kuò)大產(chǎn)量，在完全相同的條件下就可以產(chǎn)業(yè)化。
表1列出了大腸桿菌O33型的O抗原基因簇中糖基轉(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理基因及基因內(nèi)的引物及PCR數(shù)據(jù)。在表中列出了大腸桿菌O33型的O抗原基因簇的糖基轉(zhuǎn)移酶基因、轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因及它們的相應(yīng)的功能和大小。在每個(gè)基因內(nèi)，我們各設(shè)計(jì)了兩對引物，每對引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方以確保其特異性。在表中還列出了每個(gè)引物在SEQ IDNO1中的位置和大小。以每對引物用表中所列的相應(yīng)的退火溫度以表2中的所有菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，得到了相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，其大小也列于表中。
表2是用于篩選特異基因的166株大腸桿菌和43株志賀氏菌及它們的來源，為了檢測的方便，我們將它們每12-19個(gè)菌分為一組，總共12組，它們的來源都列于表中。
在第13組中含有大腸桿菌O33型的基因組DNA作為陽性對照。以每組菌做模板，用表1中的每對引物按如下條件做PCR在95℃預(yù)變性5分鐘后，95℃變性30秒，退火時(shí)間是30秒，溫度見表1，72℃延伸2分鐘，這樣進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。最后在72℃繼續(xù)延伸5分鐘，反應(yīng)體系是25ul。模板為1∶20稀釋，取1μl。反應(yīng)完畢后，取10ul PCR產(chǎn)物通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增出的片段。
對于wzx、wzy基因，每個(gè)基因都有兩對引物被檢測，每對引物除了在第13組中做PCR后得到了預(yù)期大小的正確的一條帶外，在其他組中都沒有擴(kuò)增到任何大小正確的帶，也就是說，在大多數(shù)組中沒有得到任何PCR產(chǎn)物帶，所以wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O33型及其O-抗原是高度特異的。
最后，通過PCR從大腸桿菌O33型中篩選到對大腸桿菌O33型的O-抗原高度特異的基因wzx和wzy基因。而這些基因內(nèi)的任何一段10-20nt的寡核苷酸對大腸桿菌O33型的O-抗原是特異的，尤其是上述每個(gè)基因中的引物即寡核苷酸對經(jīng)PCR檢測后證實(shí)對大腸桿菌O33型是高度特異的。所有的這些寡核苷酸都可用于快速準(zhǔn)確地檢測人體和環(huán)境中的大腸桿菌O33型，并能鑒定它們的O-抗原。
表3是大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)表，在表中列出了大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)，共由7個(gè)基因組成，每個(gè)基因用方框表示，并在方框內(nèi)寫入基因的名稱，數(shù)字表示的是O-抗原基因簇中的開放閱讀框(orf)的順序。在O-抗原基因簇的兩端是galF基因和gnd基因，它們不屬于O-抗原基因簇，我們只是用它們的一段序列設(shè)計(jì)引物來擴(kuò)增O-抗原基因簇的全長序列。
表4是大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇中的基因的位置圖，在圖中列出了大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇中的所有開放閱讀框在全序列中的準(zhǔn)確位置，在每個(gè)開放閱讀框的起始密碼子和終止密碼子的下面劃線。在大腸桿菌中開放閱讀框的起始密碼子有兩個(gè)ATG和GTG。
SEQ ID NO1序列(SEQUENCE LISTING)<110>天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司<120>對大腸桿菌O33型的O抗原特異的核苷酸<130>對大腸桿菌O33型的O抗原特異的核苷酸<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>9058<212>DNA<213>Escherichia coli<400>1gtggctgcag ggatcaaaga aatcctcctg gtaactcacg cgtccaagaa cgcggtcgaa 60aaccacttcg acacctctta tgaattagaa tctctccttg aacagcgcgt gaagcgtcaa 120ctactggcgg aagtacagtc catttgcccg ccgggcgtga ccattatgaa cgtgcgtcag 180ggcgaacctt taggtttggg ccactccatt ttatgtgcac gaccagctat tggtgacaac 240ccatttgtcg tggtactgcc ggacgttgtt atcgacgacg ccagcgctga cccgctgcgc 300tacaaccttg ctgccatgat tgcgcgcttc aacgaaacgg gccgcagcca ggtgctggca 360aaacgtatgc cgggcgatct ctctgaatac tccgtcattc agaccaaaga accgctggat 420cgtgaaggta aagtcagccg cattgttgaa tttatcgaaa aaccggatca accgcagacg 480ctggactcag acattatggc cgttggtcgc tatgtgcttt ctgccgatat ttggccggaa 540ctggaacgca ctcagccagg tgcatggggg cgtattcagc tgactgatgc cattgctgaa 600ctggcgaaaa aacagtcagt tgatgcaatg ttaatgacgg gggacagcta cgattgcggt 660aaaaaaatgg gctacatgca ggcatttgtg cagtacggac tacgcaacct gaaagaaggg 720gcaaagttcc gtaaagggat tgagaagctg ttaagcgaat aaaatggtta agaaggaaat 780tataacggca atgaagattt gttcgaaagt tgtgtattga aaatattctt gccgctgatt 840ttttatagct aatcatatta gcaagaggtt tataagaaga tgttagtcaa gtttttccgg 900gatttacctt gttttcagag tcgataggga agacaattag cgtttagatt tttctggatt 960ggttagagag tgtaatgctc gttacattgt agatatgtat acagtgctct ggtagctgtt 1020aagccaaggg cggtagctat ttgaaatcat actaaaacaa tatgattatt gcaaaaggtg 1080ataaaatgat cggtattatt ctggctgcag gtgttgggtc tcgtttgcgg cccatgacta 1140atagtaaacc taagtgtctt gtgactgttg ctggcaagcc tatcttggat tatcagttaa 1200actcctatcg cctggctggt attaaagata tattcattat cgttggctat gaaggtgata 1260aaataaaaaa acactgtaaa tatattaaag atctcaatat tacaataata gaaaataatg 1320
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*只在大腸桿菌O33型中得到正確的一條帶表2 166株大腸桿菌和43株志賀氏菌及它們的來源組號該組中含有的菌株來源1、野生型大腸桿菌O1，O2，O5，O7，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O19ab，O20， IMVSaO21，O22，O23，O24，O592、野生型大腸桿菌O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O35，O36，O37， IMVSaO38，O40，O41，O42，O433、野生型大腸桿菌O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56， IMVSaO57，O58，O60，O61，O624、野生型大腸桿菌O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78， IMVSaO79，O80，O81，O82，O835、野生型大腸桿菌O84，O85，O86，O87，O88，O89，O91，O92，O98，O99，O101， IMVSaO102，O103，O104，O1066、野生型大腸桿菌O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113， IMVSaO115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O1287、野生型大腸桿菌O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137， IMVSaO138，O139，O141，O142，O143，O144，O1458、野生型大腸桿菌O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158， IMVSaO159，O160，O161，O163，O164，O165，O166 b9、野生型大腸桿菌O168，O169，O170，O171，O172，O173， cD1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12d10、野生型大腸桿菌 B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15， dB16，B17，B1811、野生型大腸桿菌 F1a，F(xiàn)1b，F(xiàn)2a，F(xiàn)2b，F(xiàn)3，F(xiàn)4b，F(xiàn)5(v:4)，F(xiàn)5(v:7)，F(xiàn)6，F(xiàn)X變，F(xiàn)Y變，DS，DR，d12、野生型大腸桿菌 O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，IMVSaO155，O12413、第2組菌株加上大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株O33 IMVS
*為了檢測的方便，我們將每13-17個(gè)菌分為一組，總共13組a. Institute of Medical and Veterinary Science(IMVS)，Anelaide，Australiab. Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmarkc. O172和O173來自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余來自于IMVSd. 中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)研究所表3 大腸桿菌O33型O抗原基因結(jié)構(gòu)圖Escherichia coli type 33 O-antigen gene cluster galF orf1wzx orf3 wzy orf5 orf6 orf7G+C％ 31.629.7 28.8 28.829.0 30.4 31.8表4大腸桿菌O33型O抗原基因簇基因位置GTGGCTGCAG GGATCAAAGA AATCCTCCTG GTAACTCACG CGTCCAAGAA CGCGGTCGAA 60AACCACTTCG ACACCTCTTA TGAATTAGAA TCTCTCCTTG AACAGCGCGT GAAGCGTCAA 120CTACTGGCGG AAGTACAGTC CATTTGCCCG CCGGGCGTGA CCATTATGAA CGTGCGTCAG 180GGCGAACCTT TAGGTTTGGG CCACTCCATT TTATGTGCAC GACCAGCTAT TGGTGACAAC 240CCATTTGTCG TGGTACTGCC GGACGTTGTT ATCGACGACG CCAGCGCTGA CCCGCTGCGC 300TACAACCTTG CTGCCATGAT TGCGCGCTTC AACGAAACGG GCCGCAGCCA GGTGCTGGCA 360AAACGTATGC CGGGCGATCT CTCTGAATAC TCCGTCATTC AGACCAAAGA ACCGCTGGAT 420CGTGAAGGTA AAGTCAGCCG CATTGTTGAA TTTATCGAAA AACCGGATCA ACCGCAGACG 480CTGGACTCAG ACATTATGGC CGTTGGTCGC TATGTGCTTT CTGCCGATAT TTGGCCGGAA 540CTGGAACGCA CTCAGCCAGG TGCATGGGGG CGTATTCAGC TGACTGATGC CATTGCTGAA 600CTGGCGAAAA AACAGTCAGT TGATGCAATG TTAATGACGG GGGACAGCTA CGATTGCGGT 660AAAAAAATGG GCTACATGCA GGCATTTGTG CAGTACGGAC TACGCAACCT GAAAGAAGGG 720GCAAAGTTCC GTAAAGGGAT TGAGAAGCTG TTAAGCGAAT AAAATGGTTA AGAAGGAAAT 780TATAACGGCA ATGAAGATTT GTTCGAAAGT TGTGTATTGA AAATATTCTT GCCGCTGATT 840TTTTATAGCT AATCATATTA GCAAGAGGTT TATAAGAAGA TGTTAGTCAA GTTTTTCCGG 900GATTTACCTT GTTTTCAGAG TCGATAGGGA AGACAATTAG CGTTTAGATT TTTCTGGATT 960GGTTAGAGAG TGTAATGCTC GTTACATTGT AGATATGTAT ACAGTGCTCT GGTAGCTGTT 1020orf1的起始AAGCCAAGGG CGGTAGCTAT TTGAAATCAT ACTAAAACAA TATGATTATT GCAAAAGGTG 1080ATAAAATGAT CGGTATTATT CTGGCTGCAG GTGTTGGGTC TCGTTTGCGG CCCATGACTA 1140ATAGTAAACC TAAGTGTCTT GTGACTGTTG CTGGCAAGCC TATCTTGGAT TATCAGTTAA 1200ACTCCTATCG CCTGGCTGGT ATTAAAGATA TATTCATTAT CGTTGGCTAT GAAGGTGATA 1260AAATAAAAAA ACACTGTAAA TATATTAAAG ATCTCAATAT TACAATAATA GAAAATAATG 1320AGTATGAAGA TACAAATAAT ATGTATTCAC TCTTTTTAGC AAAGAAATAT GCATATGGAG 1380AATCTTTTAT ATTAAACAAT GCAGATCTAG CTATTGATTC AAATATCATA GAGAAGATTT 1440GTGAGAGTCC CTTCAGTGAT CTTATTGCTG TTGATGTAGG TGTTTTTAAT GAAGAGTCTA 1500TGAAGGTTAC TGTAAATGAT GATAATAAAG TAAGTAATAT ATCTAAATTA ATCGATGAGA 1560AAGAGTCTGT TGGTTGTTCT ATAGATTTCT ATAAATTCTC TAAGGATTCA AGTAAGATCT 1620TTTTCGATGA AATAGAACGA ATTGTGTTAA GGGAGAATAA TAAGAAAGAT TGGACTGAGA 1680TTGCAATGCA ACGTCTATTT ATAGATAGAA AGATGAAATT TGATGTTTTA GATATTAGTG 1740GATGTTCTTG GGTTGAAATT GATAACTATG CTGATTTAGC TCTTGCTGAT AAAATATTCT 1800CCCAAAAAAA TAAAAAAATA TCGGATTATA AATGTTATTG CTTTGATTTA GATGGTACAG 1860TCTATGTCGG TAGAGAGCCG ATTAAAGAAG TTATAGATGA AATAAATAGT TTAAAGAAAA 1920GTGGTAAGTT GATTCGTTTT ATATCAAATA ACTCATCAAA GTGCAAAAGT GAATATGTAA 1980
ATAAGCTGAA AAATTACGGT ATAGATGTAT CTACTGAAGA TATTAAAATA TCATCTGATA 2040GTGTTATTGA CTTTTTAAAT AAAGAACAGG CTAAGAAAAT ATACGTAGTT GGAACAAAAA 2100GTTTACAAAA AAATATAATT GATGCTGGTT TTGAGATTTG TTCTCATGAA CCTGATTTTA 2160TCGTGTTAGG ATATGATACT GAGCTGACTT ATTCAAAATT GGTAACCGCT TGTAGGTTAA 2220TTAATTGCGG GGTTGATTAT ATTGCAACGC ATTGTGATGT TTTTTGTCCC TCGGAAAACG 2280GTCCTATTCC TGATATTGGC ACTGTAGTAA CAATGCTAGA AATGACAACT GGGCGTAAGC 2340CGTACCGCGT ATTTGGTAAA CCAAATCCAG ATCTTTTGAA TTTGATTCTT AATGAAGATC 2400GGCTGGAAAA AGATGATTTG TTAATGATTG GTGACCGTAT ATATACAGAT ATTCAAATGG 2460CTGAAAATAC AGGCATTGAT TCTGTTCTTG TATTAACAGG TGACACTAAA CGAGAGGATA 2520orf1的終止TTGAGGATTC ATCTGTAAAA CCGACCTATA TACTTCAACA CTTCTCTCAGTAATTTTCAA2580orf2的起始CAAATAATAA CCTGTGTTTT AAGCAGGTTA TTATTTGGAG CCATCTATGT TAAATTTTAC2640CCTTATTAAG AATATATTTT ATTTATTTAT TGTACAAATA ATAAATTATG TTGCTCCTTT 2700TTTAGTTTTG CCTTATTTAA GCAGGGTTCT GTCCGTTGAT AACTTTGGCT TGCTAATGAT 2760GATAATATCT GCAAGTTCTA TCGCATTAAT TGTTACTGAT TATGGATTCA GCTTATCAGG 2820ACCTCTGTTT GTGGCTGTAA ATAAGCATAA TAAAGTAGTC ATAAATCAAT ATATTGGAAC 2880AATATATTTA ATAAAATCTG TGTTAATTAG CATTATATGG TTTTTATTTC TCTTTATATA 2940TTTTATAAGT GATAATGAAA TTACATCACA TTTTTCAAAT ATATTATGGC TAGGTGTTAT 3000AATAACAACG CAGTCCTTTC AGCCTATTTG GTTTTTTCAA GGGCTAGAGA AAATGAAAAA 3060TATAACGTTT TCTCTAATTA TATCCAAATC GGTTTATGTA ATATTGATTT TCTGCCTTGT 3120AAAGACAAAT CACGTGGAGC GTGTTTTCTT GGCATTAGTT CTAAGTAATG TTGTAACTTT 3180AGTAATAAGT AATTATCTTT TATATCGTAA TGGTTATGCG ATAGGCACAC CTTGTAATAA 3240ATTATTTAGA GACGAAATAA AAAATAGTTT TCCATTTTTT TTATCAAGGG CTGCTGTAGG 3300TGTTTATACT AGTGCAAGTA CCTTTATTGT TGGCAGTTTT GCAGGGTTAA ATCAGGCGGC 3360TGTTTATTCG AGCGCTGAAA AATTATATCA AGCAGGGCAA AATGCTTTAT CGCCAATATC 3420TCAAGCATTA TATCCATATT TAGCAAGGTC TGGCGATAAG AAAACTTTAT ATAAATTTGT 3480TGTTCTGTTT TTTATTTTGC TCTGTATGAT ATGCATATTG AGTTCGTATT ATTCTAATAC 3540CATAGTGATG TTATTTTTTG GTAATAAATA TAATGCGGCA TCTCAGGTTT TAAATGTTTT 3600TCTCTTAAGT CTTGTTATTA CTTTTGTTAG TTTTAACTTT GGATATCCTG CTTTTGCTGC 3660AATTAAACGA GTGCAGATTG TCAATTATAC AGTTGTTCTG GGGGGCGGAT TGCAGTTATT 3720GATGATTATC ATTTTAATAG TTAGTGAAAA GATCACCCCT CTGAATATGG CTCGAAGTGT 3780GTTATTTACT GAAACACTAG TGTTGATTTC TAGATTAGGT TTATATTTCT ATCTTATTCT 3840orf3的起始 orf2的終止CAAGAATGAT AATGTATCAG GTTTGAAATG AAAAAAATAA AATTTATCGT TAAATTTATT3900TTGGGACGAA TTGTTTACTT TTTGTCTGGT TTTTTTCCTA GAAATCCAAA TATATGGGTT 3960TTTGGTAGCT TTAATGGGTT TGAGGATAAT CCAAAATATT TATATCTACA TGTTCTTAAT 4020AAGAACAAAG AAATAAGGTC TATATGGATA GCAAAAGATA AAATGGAATT GCTGCAGGCT 4080AGGAATAGTG GAGGTGAGGC TTATCTTTTT AATAGCATAA AAGGATTTTT GTTTACCTTA 4140AATGCAGGTA TATATATATA TTCAGCATAT ATTACGGATA TATCTTTTAT TGCATCCAGA 4200AAAGCTAAAA AAGTTAATTT ATGGCATGGG ATTCCTATCA AGAAAATAGA GTTTGACATA 4260ACATCTAAAC CGTTGGTCAA CCATTTCTCT AAAGCCAATT TTATAAATAA GATGATATAT 4320GCATATAAGC ATATAGTTCC TGATCTTCTT CTTTGTCCAA GTAAATACTC GGCTGAGTAT 4380TCATTTAAAT CGGCATTCCG TATTTCTGAG AGACAGTGTT TATTTGCAAG ATATCCAAGA 4440GTATCCGCAT TACTTGAAAT GAAGATGAAT AAAGAGAATA AAAAAATAAT TCTTTATATG 4500CCAACTTGGC GTGATAAAAA ACCTAGGTTT CTAGATACGG CAAAAATTGA ATTTGAAAAG 4560CTGAATACTA TCATGAGAAC ATATGATGCA TTATTTGTTA TTAAACTACA TCCACTTACT 4620ATCATAGATA GGGCTTTTGA ATATTCTAAC ATTAGTATTT GCAATAAAGA CTCTGATTTA 4680AATGAACTTT TATTTGTTTC CGATTGTCTG GTAACAGATT ATTCGTCTGT TGTTTTTGAT 4740TATCTACATT TGAATAAACC AATAATATTT TATAATTTTG ATATGGATGA CTATCTGAAA 4800GGGCGAGAGT TTTATTTCGA TTATAACTCA ATAATTTGTG GCGAAATTGC TTCTGATTAT 4860TCTAGTTTAG AGTCAAAAAT TTTAGCTGTG ATTAAAGGAG TAGATCTTTT CGAAAGGAAA 4920AGGAAGGAAA TATACGATAA ATTTACTTCT GAGACTGGAG GAAATCAACT TATAGTTAGT 4980orf3的終止 orf4的起始TCTATTAAGA AAATATTTGA AAAATAAAGA GAGTTCTTAT GATAACTAAT TATTCGTGGC 5040ATATGAAAAA TAATAATATT GTAGGAATGT TTGTTTTAAT TGTTTCTTCT ACAATCATGA 5100TATATGACCC ATGGTTTTTT GGTGTGGGGC GTGGTGTTGT TATTATTGGT AGCATTTTTA 5160CTTTAATTTC TTTTGCATCA GGACGATTTT TTATAAGGAA AGAGGAAGTT AAACTTCTGC 5220TGCTTTTAAT GCTTTTTACA GGATATTCCT TATTGCCTGC AATATATAAT TATACCTTAG 5280ATACTAGTGT ATTTTTTATG TATTTTAAAA TGTGCATATA TTATATACTT TGTTTTGGGT 5340TTGTTAGGTG TTTTTTGAAA AAAGAAAAAC TATTATTCGT TTTGAAAGGA AGTGTTGTTA 5400TACAATGTGT ATTTATCTTA CTGTGTTTAA TTTCCTCTGA TGTCCGAAAC TTTATATTTT 5460CAGTTCACAC TGTTGAAGAT AGATTTCTTA TTTCAGAGCA AGCATATAGA CTTTATTTCC 5520TTAGCTCATC ATCTTTTTTT CAATTAAGTC TCTTTTTTGG ATTCTTATTC CATTTCATGG 5580TCGCTTTATA TAAAGAAAAT AAAGTTGGTT TACTTATTTT GATATTGATT TTTGTATGTG 5640
GGGCTTTTTC TGGTCGAGTA TTTTTCCTAT TTGCAGTTAT TTCTGTTATT TTTTATGGTA 5700TTAACATAAG ATATGTGCCG TTATATAGTG TCATAGCTTT TGTTTTGATA TTTTTTGCTA 5760TCAAGTTTTC TGATAATATT TTTATCAGAC ATGCACTGGA ACCATTGATT AATTACATTA 5820ATACAGGAGA GTTCATGACT GCATCAAGTG ATAAGTTGGT GGAAAAAATG TTGTTTATTC 5880CTGATTTTTC TGCATTGGTC GTAGGTGATG GTGTATATTA TAATGATGAT GGTTCCTATT 5940ATATGCATAC TGATTCAGGT ATCATAAGGC AATTTTTGTA TGGTGGAGGG GGGTATTTTA 6000TATCTTGTAT GGCATTAACT TGGTATTTAC TGACTAAAGT CTCGAAAAAC TGGCTTGAAA 6060AAAATAAAAA ATTTACTCTA TCAACAATGA TTATTTTTTT GATCGGAAAT ATCAAAGCCG 6120ATGTTCTAAT GTATCCAGGC ATTATGATAA ACTTAATTTT TATTTTAATT TTCGCGTCAG 6180orf5的起始 orf4的終止GAGATAATAA TGATAAAAGT GTTTATCGTA TCCTTAAATG ATTCACCGAG AAGAACATCA 6240ATCTCACAAT TGTGTGAAAA ATACGGTGTA GAATTTGAGT TTGTTGATGC AGTTAATGGC 6300AGAAAATTAG ATGATAAATA TATCAATAAA ATTAATTCTT ATGAGTGGAC AAAGTTAAAA 6360TATAAAAGAA AGTTAGGTCC AGCAGAGATT GGTTGTACAT TAAGTCATCT CAGTATATAC 6420AAAAAAAATA TTAATAGTTG GTTCATCGTT TTGGAGGATG ATGTCGATTT TGATGAACGA 6480TTTGTAAAAT TAATCAATAC TGATATAACG GGTTTAAGGA CTGATGCTCT CTATCTTCTT 6540GGTGGACAAG AGGGACTTGA GTCATTTAAA AATGTTATTT TTTCAAGATT TGGTGGTATT 6600AAGGTGAATA CAGATATAGT CTTTCTTAAG ACTATCTGTA GCGAACGTTT TTTATTTCGA 6660ACATGTTGCT ATATGATTCA TCATTCGTTA GCTAAGAGAA TAGTAGACTT CAACCAAAAT 6720AAACTTACTT TAGCTGATGA TTGGTTTAAT TTATCAAAGT TTAATATCAT AAACAATATA 6780TATTATATTG ATCTTGTTGC ACATCCTAGT GATCCGAGTA CTTCTCTAAT TCATTCAGAT 6840AGGCTAAAAT TAATTAAAAC AAGGCAAAAA ATATATAGAA CATTCATGAA AAGAATAGTA 6900orf5的終止 orf6的起始TTAAAATTCA GGTCTATATT GAGGTTTTTCTGATCATGTT TTCAATTATA ATACCTAGCT 6960TTAATCGAGA GAAACAACTT CGTAATGCAT TGGCCGAACT AAATAAGCAA CTCTACAAAG 7020AGTTTGAGGT TATTGTTGTT GATGATGCTT CGGACAGTGA ATATGATTTG AGCTTGGATC 7080TTTATCATTT TGAACTGAAA TATTTCAGAA GCAATAAAAA TTTAGGACCA TCAGGTGCTA 7140GAAATATTGG AGTTAGTTTA GCTCGTTATG ATTGGATCAT TTTTTTGGAC GATGATGATT 7200ATTTCATGCC GGAAAAACTG ATGATCTTGA GGGAGACTAT ATTAAATAAT GATATTGACT 7260TTATCTATCA TAGAGCTCGT ATATTTATGA TCAATGAAAA AATTAGTTAT ATTTCTAGTC 7320AAAAGGATAT AGATAAAATT CCAGGTGAGG TATATCAACA TATGCTTTCT GGTAATTTTA 7380TTGGGGGCCC TCCAAATTTT GCAATAAAAA AAAGCCTGTT TAACAAACTT CATGGCTTTT 7440CTGATAATGT ACGAGCAATT GAAGATTACG AGTTTCTACT AAGGTTAGTC CGTGACGTTA 7500GTAAAAAAAG AATTATTTTT GTAGATAATG TGCTTACTGG GTGTAATTAT ATAACAAAAT 7560CAACCAGCGT CTCTAAAAAT ATAAACAATT TAAAACAAGC ATGTACATAT ATATCAGAGG 7620AATATATTCG AGACAACCGC GAATTTAATC TTTTTAAAAT AAATACCTCG TTGATGACTG 7680CACATGCTTT GTTAATGAGT TTAAATCGTA AATCTGCTTT CTTTTATTTT AAAGCAGGGA 7740TTGTTATGTT TAATATAAAA TATATTGTAT CTGGGATTAT TTCTTTTATA TCTCCAGTTT 7800orf6的終止 orf7的起始TGATGATTAA GCTTAGGGGC AAGGTTTAAT AATAATTATGAGTGATGGGA AAGAAAATAG 7860ATATCAAAAG TTTAGTGTTT TGATGTCCGT GTACTATAAA GAAGATCCTG TTTTTTTTTA 7920TGATGCTGTT AATAGTGTGT TTGAGAATAC GATCCCTCCA GATGATGTGG TCATTGTCGT 7980TGATGGACCT ATCCCGGAAG GTATTACGGA TGTAATATTG GCGCTAAGAG AAAAATATGA 8040ACTTAACATT GTTTATTTAA GTGAAAACGT TGGTTTAGGG AGAGCTCTAA ATATAGGTAT 8100TAATTATTGC AAATATAATA TTATAATGAG AATGGATACT GATGATTATT GTATTAATAC 8160AAGGTTTCAG GAACAATTAG ATTTTTTTTC CACTCATTCT GATGTGGTCC TTCTTGGTGG 8220GGATATTGCA GAATTCGATA CTGAACTGTC TAATTTTATT GGTGTTAGAC ACGTGGCGTA 8280TACTTGTCAA AGTATAAGGG ATATGGCAAA AAAGAGAAAT CCATTTAATC ATATGACAGT 8340AGCCTTCAAA AAAGATATAA TATTATCAGT TGGTGGATAT AAGCATCATC CATTTATGGA 8400GGATTACAAT CTTTGGTTAA GAGTTATTGC TAAGGGACAT AAAGTAGCTA ATCTTCCTAA 8460AGTTATGGTT AATGTGAGAG CTGGTGAAAG TATGCTTTCT CGACGAAAAG GAATTCGCTA 8520TATATATAGT GAGTATGTAT TATATAAACT CAAGTTGAGC TTGGGTATTG ATAGTTTAGT 8580TCATGGTTTT TTTATATTTT TGATGCGTGC ATTTATTCGT GTTATTCCAA TTGGTATGAT 8640orf7的終止AAGTATCTTA TATTCAAGTA TAAGAAAAAA CATGAATACATAAGTGGATG TTAAAGATGA8700TATTACACGT TTTGTATATT TAAATCGTGA TTTGCTATAA TAGAAATGCT CACATAATCT 8760ATCAGATCTA TTAAACTAAG TAAGCCCCCC TGACAGGAGT AAACAATGTC AAAGCAACAG 8820ATCGGCGTCG TCGGTATGGC AGTGATGGGG CGCAACCTTG CGCTCAACAT CGAAAGCCGT 8880GGTTATACCG TCTCTATTTT CAACCGTTCC CGTGAAAAGA CGGAAGAAGT GATTGCCGAA 8940AATCCGGGCA AGAAACTGGT TCCTTACTAT ACGGTGAAAG AGTTTGTTGA ATCTCTGGAA 9000ACGCCTCGTC GCATCCTGTT AATGGTGAAA GCAGGTGCAG GCACGGATGC TGCTATTG9058以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于其是如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長9058個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
2.按照權(quán)利要求1所述的對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于其是由命名為orf1，wzx，orf3，wzy，orf5，orf6，orf7的7個(gè)基因組成，都位于galF基因和gnd基因之間。
3.按照權(quán)利要求2所述的對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，所述基因中具有高度特異性的基因是轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf5、orf6、orf7基因；其中所述的基因wzx是SEQ ID NO1中的2627至3871堿基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO1中的5019至6221堿基的核苷酸；orf5是SEQ ID NO1中的6190至6933堿基的核苷酸；orf6是SEQ ID NO1中的6936至7829堿基的核苷酸；orf7是SEQ ID NO1中的7838至8683堿基的核苷酸。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于它還包括源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基轉(zhuǎn)移酶基因orf5、orf6、or7基因；以及它們的混合或它們的重組。
5.按照權(quán)利要求4所述的對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的2822至2839堿基的核苷酸和3387至3402堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的3008至3023堿基的核苷酸和3320至3336堿基的核苷酸。源于wzy基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的5325至5340堿基的核苷酸和5898至5913堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5848至5864堿基的核苷酸和6132至6147堿基的核苷酸。
6.權(quán)利要求1所述的對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸在檢測表達(dá)O-抗原的細(xì)菌、鑒定細(xì)菌的O-抗原和細(xì)菌的其它多糖抗原中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸的重組分子，在通過插入表達(dá)而提供表達(dá)大腸桿菌O33型的O-抗原，以及制備細(xì)菌疫苗中的應(yīng)用。
8.按照權(quán)利要求1所述的對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸的應(yīng)用，其特征在于，它作為引物用于PCR、作為探針用于雜交反應(yīng)與熒光檢測、或者用于制造基因芯片或微陣列，供檢測細(xì)菌。
9.權(quán)利要求1所述的對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，其包括下述步驟(1)基因組的提取在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌O33型，離心收集細(xì)胞；得到的基因組DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O33型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O33型的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇，將得到的PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的大小及其特異性，合并該long PCR產(chǎn)物，并用DNA純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫將Long PCR純化產(chǎn)物應(yīng)用鳥槍法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫；(4)對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的克隆用實(shí)驗(yàn)室常用的DNA自動測序儀對克隆中的插入片段進(jìn)行測序，序列達(dá)到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析應(yīng)用生物信息學(xué)軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列；(6)特異基因的篩選針對大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因設(shè)計(jì)引物；在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)了兩對引物，每對引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，確定wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O33型的O-抗原的高度特異性；(7)引物靈敏度的檢測培養(yǎng)大腸桿菌O33，細(xì)菌計(jì)數(shù)后分別將5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌加入到一定量的某種待檢測物中，混入細(xì)菌的待檢測物作為檢測用樣品，將樣品加入LB培養(yǎng)基，取一些與樣品混合過的LB培養(yǎng)基過濾，將過濾液進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)好的菌液中取數(shù)毫升處理后作為PCR模板用寡核苷酸進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測其對大腸桿菌O33的靈敏度。
10.權(quán)利要求9所述的對大腸桿菌O33型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，其包括下述步驟(1)基因組的提取在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌O33型，離心收集細(xì)胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細(xì)胞，37℃溫育20分鐘，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘，之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時(shí)，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提兩次，取上清再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚，上清用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，將DNA重懸于30ul TE中；基因組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O33型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O33型的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇，首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇啟動子區(qū)的galF序列設(shè)計(jì)上游引物(5’-ATT GTG GCT GCAGGG ATC AAA GAA AT-3’)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設(shè)計(jì)下游引物(5’-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C-3’)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴(kuò)增O-抗原基因簇，PCR反應(yīng)程序如下在94℃預(yù)變性2分鐘；然后94℃變性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分鐘，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后，在68℃繼續(xù)延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的大小及其特異性，合并5管long PCR產(chǎn)物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫，反應(yīng)體系是300ng PCR純化產(chǎn)物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應(yīng)在室溫中進(jìn)行，酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應(yīng)，合并4管同樣的反應(yīng)體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等體積的乙醚抽提一次后，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中，隨后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃30分鐘，將酶切產(chǎn)物補(bǔ)成平端，75℃終止反應(yīng)后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應(yīng)的緩沖液并將體系擴(kuò)大為80ul，70℃反應(yīng)20分鐘，使DNA的3′端加dA尾，此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接10小時(shí)，總體積為90ul，其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶。最后用1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產(chǎn)物；用Bi0-Rad公司的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備方法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉(zhuǎn)到Bi0-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時(shí)間為5.0毫秒至6.0毫秒，電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇，然后將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃過夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落，將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨卞青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)從每個(gè)克隆中提取質(zhì)粒，并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群構(gòu)成了大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇文庫；(4)對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的96個(gè)克隆用本實(shí)驗(yàn)室ABI3730型DNA自動測序儀對克隆中的插入片段進(jìn)行測序，序列達(dá)到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英國劍橋MRC(Medical Research Council)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列；序列的質(zhì)量主要由兩個(gè)方面來保證1)對大腸桿菌O33型的基因組作5個(gè)Long PCR反應(yīng)，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫，2)對每個(gè)堿基，保證3個(gè)以上高質(zhì)量的覆蓋率，在得到大腸桿菌O33型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國國家生物技術(shù)信息學(xué)中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到7個(gè)開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對，最后得到大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)；(6)特異基因的篩選針對大腸桿菌O33型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因設(shè)計(jì)引物；在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)了兩對引物，每對引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，除在含大腸桿菌O33的第13組中得到了預(yù)期大小的一條帶外，在其他組中都沒有擴(kuò)增到預(yù)期片段大小的正確產(chǎn)物，所以wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O33型的O-抗原都是高度特異的。(7)引物靈敏度的檢測購買市場上的生豬肉餡，攪拌均勻，分成20g一份，存在-40℃冰箱中備用。將10μl大腸桿菌O33的凍存菌液接種到有20ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37℃，200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)12小時(shí)至飽和，取少量培養(yǎng)好的菌液作106和107倍的稀釋，其余的菌液放于4℃的冰箱中備用，取50μl稀釋菌液涂布LB瓊脂平板，37度，培養(yǎng)12h，對所涂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算原液中活菌濃度。在5份生豬肉餡中分別摻入5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌，攪拌均勻，加入200mL LB培養(yǎng)基，經(jīng)6層紗布過濾，過濾液于37℃，200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)12h。從培養(yǎng)好的菌液中取3ml菌液于6,000g離心5分鐘，去上清，加100μl MQ超純水吹開沉淀并混勻，放入100度沸水中煮15分鐘，裂解液于12,000g離心8分鐘，取1μ上清做為PCR模板。用4對寡核苷酸對，SEQ ID NO1中的2822至2839堿基的核苷酸和3387至3402堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的3008至3023堿基的核苷酸和3320至3336堿基的核苷酸。源于wzy基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的5325至5340堿基的核苷酸和5898至5913堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5848至5864堿基的核苷酸和6132至6147堿基的核苷酸，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反應(yīng)條件為95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取10μl反應(yīng)產(chǎn)物電泳，若有與預(yù)期大小相符的擴(kuò)增帶，則結(jié)果為陽性，若沒有，則結(jié)果為陰性。參入了5×103，5×102，5×101，和5個(gè)活菌的每份豬肉餡均在4對引物的PCR反應(yīng)中得到陽性結(jié)果。參入0個(gè)活菌的豬肉餡在4對引物的PCR反應(yīng)中得到陰性結(jié)果。說明使用上述方法時(shí)，這4對引物對豬肉餡中的大腸桿菌O33的檢測靈敏度均為0.25個(gè)菌/g。
全文摘要
本發(fā)明提供一種對大腸桿菌O33型(Escherichiacoli O33)的O－抗原特異的核苷酸，它是大腸桿菌型中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長9058個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸；還包括源于大腸桿菌O33型的O－抗原基因簇中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理基因的寡核苷酸；本發(fā)明通過PCR證實(shí)寡核苷酸對大腸桿菌O33型的O－抗原都有高度的特異性；本發(fā)明還公開了用本發(fā)明的寡核苷酸檢測和鑒定人體及環(huán)境中的大腸桿菌O33型的方法。
文檔編號C12N15/31GK1563039SQ20041001902
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月19日
發(fā)明者王磊, 王威, 馮露 申請人:天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司