專利名稱：一種檢測馬鈴薯病毒的試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用PCR法檢測病毒的試劑盒及檢測病毒的方法。
背景技術(shù)：
馬鈴薯是全世界最重要的高產(chǎn)作物，它既是糧食作物又是經(jīng)濟(jì)作物，可用于人類消費、動物飼料及作為加工淀粉和生產(chǎn)乙醇的原料。但長期以來眾多的馬鈴薯品種因病毒侵染急劇減產(chǎn)、品種退化，對作物的生產(chǎn)非常不利。迄今為止發(fā)現(xiàn)的馬鈴薯病毒已有20多種。因此，以可脫去病毒的組織培養(yǎng)法建立馬鈴薯脫毒種薯繁育體系是阻止病毒侵染、提高產(chǎn)量、發(fā)揮優(yōu)良品種特性的有效途徑，其中實現(xiàn)組培苗的全面脫毒是這一體系的中心環(huán)節(jié)，高效可靠的病毒檢測手段則是確保種苗脫毒的前提和關(guān)鍵(仲乃琴ELISA技術(shù)檢測馬鈴薯病毒的研究甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報1998年第2期178～181)。除馬鈴薯外，茄科的其他作物如番茄、青椒等也會被馬鈴薯病毒所侵染。
目前應(yīng)用于馬鈴薯病毒檢測的診斷方法包括指示植物法、電鏡觀察法、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法和核酸雜交(NASH)法等(袁青等 馬鈴薯病毒分子檢測技術(shù)研究進(jìn)展 中國馬鈴薯 2003年第17卷第1期33～36)。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測馬鈴薯病毒的試劑盒；本發(fā)明的另一個目的是提供一種利用試劑盒檢測馬鈴薯病毒的方法，該方法是隨著PCR法衍生出的RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))法，是一種檢測RNA病毒的行之有效的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種檢測馬鈴薯病毒的試劑盒，該試劑盒由反應(yīng)液、引物、酶液及陽性標(biāo)準(zhǔn)品組成，所述反應(yīng)液中的組分及體積百分比為5×鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液6％～50％、10×PCR反應(yīng)緩沖液3％～25％、25mmol/L Mg2+2.5％～15％、各25mmol/L dNTPs 0.7％～10％、滅菌水87.8％～0，所述引物為馬鈴薯X病毒引物、馬鈴薯Y病毒引物、馬鈴薯S病毒引物及馬鈴薯卷葉病毒引物中至少一種，所述馬鈴薯X病毒引物由序列表中SEQ ID NO.1表示的馬鈴薯X病毒上游引物和由序列表中SEQ ID NO.2表示的馬鈴薯X病毒下游引物組成，所述馬鈴薯Y病毒引物由序列表中SEQ ID NO.3表示的馬鈴薯Y病毒上游引物和由序列表中SEQ ID NO.4表示的馬鈴薯Y病毒下游引物組成，所述馬鈴薯S病毒引物由序列表中SEQ ID NO.5表示的馬鈴薯S病毒上游引物和由序列表中SEQ ID NO.6表示的馬鈴薯S病毒下游引物組成，所述馬鈴薯卷葉病毒引物由序列表中SEQ ID NO.7表示的馬鈴薯卷葉病毒上游引物和由序列表中SEQ IDNO.8表示的馬鈴薯卷葉病毒下游引物組成，各上、下游引物的濃度為0.5～2μmol/L，所述酶液的組分及體積百分比為鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶20％～50％、Taq DNA聚合酶20％～50％、滅菌水60％～0，所述陽性標(biāo)準(zhǔn)品為馬鈴薯X病毒克隆質(zhì)粒、馬鈴薯Y病毒克隆質(zhì)粒、馬鈴薯S病毒克隆質(zhì)粒及馬鈴薯卷葉病毒克隆質(zhì)粒中至少一種，并與馬鈴薯病毒引物相對應(yīng)，每種病毒克隆質(zhì)粒濃度均為107～1015copies/μl。
一種用檢測馬鈴薯病毒的試劑盒檢測馬鈴薯病毒的方法，該方法包括以下步驟(1)從新鮮的茄科植物組織中提取總RNA；(2)對提取的總RNA進(jìn)行一步法逆轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)取PCR管，加入反應(yīng)液、待測病毒引物、酶液和總RNA，加水0～30μl，在41～4 3℃保溫20～40分鐘進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)；(3)PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，根據(jù)與陽性標(biāo)準(zhǔn)品相同的位置顯現(xiàn)特異性條帶的有無，判定標(biāo)本中是否存在馬鈴薯病毒。
PCR反應(yīng)條件是93～95℃3～7分鐘——；93～95℃30～60秒——57～62℃30～60秒——70～72℃30～120秒，共25～40個循環(huán)；最后70～72℃延伸8～15分鐘。
本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明是通過一步法RT-PCR對馬鈴薯RNA病毒進(jìn)行檢測，通過凝膠電泳判斷是否感染了病毒，省去了現(xiàn)有方法中，先逆轉(zhuǎn)錄再PCR的繁瑣步驟，節(jié)省時間并降低了試劑成本。與其它幾種馬鈴薯病毒檢測方法相比具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，不需要大型設(shè)備儀器，操作簡單，檢測速度快，無放射性污染，價格低廉等優(yōu)點。


圖1顯示了SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列；圖2顯示了SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列；圖3顯示了SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列；圖4顯示了SEQ ID NO.4所述的核苷酸序列；圖5顯示了SEQ ID NO.5所述的核苷酸序列；圖6顯示了SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列；圖7顯示了SEQ ID NO.7所述的核苷酸序列；圖8顯示了SEQ ID NO.8所述的核苷酸序列；
圖9為四種馬鈴薯病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；圖10為實施例18PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；圖11為實施例20PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。
具體實施例方式
利用試劑盒中的反應(yīng)液、引物、酶液和陽性標(biāo)準(zhǔn)品可以對病毒進(jìn)行檢測。具體適用濃度如表1

下面的實施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
在下面的實施例中，M-MLV RT Buffer為鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液，PCR Buffer為PCR反應(yīng)緩沖液，Mg2+為MgCl2或MgSO4之一，dNTPs為dATP、dTTP、dGTP、dCTP，M-MLV RT為鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶，Taq酶為Taq DNA聚合酶，馬鈴薯X病毒克隆質(zhì)粒、馬鈴薯Y病毒克隆質(zhì)粒、馬鈴薯S病毒克隆質(zhì)粒和馬鈴薯卷葉病毒克隆質(zhì)粒為病毒陽性標(biāo)準(zhǔn)品。
實施例1反應(yīng)液的組成和體積百分含量(見表2)
表2

實施例2酶液的組成和體積百分含量(見表3)表3

實施例3～6為檢測一種病毒的試劑盒(每個試劑盒供10次反應(yīng))(見表4)表4


表4中反應(yīng)液的組成及體積百分含量可以選表2中任意一種，酶液的組成及體積百分含量可以選表3中任意一種，病毒引物為上、下游引物，選表1中范圍內(nèi)的值，上、下游引物濃度相同，例如，可以各選0.5μmol/L，也可以各選2μmol/L，還可以各選1μmol/L，病毒克隆質(zhì)粒選表1中范圍內(nèi)的值可以選107copies/μl，也可以選1015copies/μl，還可以選1010copies/μl。
實施例7～12為檢測兩種病毒的試劑盒(每個試劑盒供10次反應(yīng))(見表5)表5

表5中反應(yīng)液的組成及體積百分含量可以選表2中任意一種，酶液的組成及體積百分含量可以選表3中任意一種，病毒引物為上、下游引物，選表1中范圍內(nèi)的值，上、下游引物濃度相同，例如，可以各選0.5μmol/L，也可以各選2μmol/L，還可以各選1μmol/L，病毒克隆質(zhì)粒選表1中范圍內(nèi)的值可以選107copies/μl，也可以選1015copies/μl，還可以選1010copies/μl。
實施例13～16為檢測三種病毒的試劑盒(每個試劑盒供10次反應(yīng))(見表6)表6

表6中反應(yīng)液的組成及體積百分含量可以選表2中任意一種，酶液的組成及體積百分含量可以選表3中任意一種，病毒引物為上、下游引物，選表1中范圍內(nèi)的值，上、下游引物濃度相同，例如，可以各選0.52μmol/L，也可以各選2μmol/L，還可以各選1μmol/L，病毒克隆質(zhì)粒選表1中范圍內(nèi)的值可以選107copies/μl，也可以選1015copies/μl，還可以選1010copies/μl。
實施例17為檢測四種病毒的試劑盒(每個試劑盒供10次反應(yīng))(見表7)表7


實施例18一種檢測馬鈴薯病毒的方法，該方法包括以下步驟以馬鈴薯新品種“夏波地”二代田間采樣為材料，使用新鮮葉片提取總RNA，用本發(fā)明一種檢測馬鈴薯病毒的試劑盒實施例5進(jìn)行馬鈴薯S病毒(PVS)的檢測。
取三個薄壁PCR管，分別為表8中所示----樣品檢測管、陽性對照管和陰性對照管表8

混勻后稍加離心，并在液面上層覆蓋滅菌石蠟油。
42℃保溫30分鐘進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；然后進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃預(yù)變性5分鐘；接下來94℃30秒，58℃30秒，72℃45秒，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。
PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在與陽性標(biāo)準(zhǔn)品相同的位置顯現(xiàn)特異性條帶的為陽性，而陰性對照未顯帶，證明該樣品感染了馬鈴薯S病毒。(見圖10)圖10為實施例18PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，圖中由左至右依次為Mraker、樣品檢測管PCR產(chǎn)物、陽性對照管PCR產(chǎn)物、陰性對照管PCR產(chǎn)物。
實施例19步驟同實施例18，不同點是以馬鈴薯的另一品種的田間采樣為材料，用本發(fā)明的一種檢測馬鈴薯病毒的試劑盒，進(jìn)行馬鈴薯X、Y和卷葉病毒(PVX、PVY、PLRV)的檢測。經(jīng)電泳檢測后在相應(yīng)位置顯帶，則說明感染了該病毒。
實施例20
步驟同實施例18，不同點是以馬鈴薯的另一品種“克星”的田間采樣為材料同時進(jìn)行馬鈴薯Y和S病毒(PVY-PVS)的檢測，PCR反應(yīng)為35個循環(huán)。
取三個薄壁PCR管，分別為表9中所示----樣品檢測管、陽性對照管和陰性對照管表9

經(jīng)檢測該樣品感染了PVY和PVS。(見圖11)圖11為實施例20PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，圖中由左至右依次為PVY陽性對照管PCR產(chǎn)物、PVS陽性對照管PCR產(chǎn)物、樣品檢測管PCR產(chǎn)物。
實施例21步驟同實施例18，不同點是以馬鈴薯的另一品種為材料同時進(jìn)行兩種馬鈴薯病毒X-S和X-卷葉病毒(PVX-PVS、PVX-PLRV)的檢測，PCR反應(yīng)為35個循環(huán)。經(jīng)電泳檢測后在相應(yīng)位置顯帶，則說明感染了相應(yīng)病毒。
馬鈴薯X、Y、S、卷葉病毒(PVX、PVY、PVS、PLRV)PCR引物X病毒(PVX)上游引物5’-ACAGGCCACAGGGTCAACTAC-3’下游引物5’-CATCTAGGCTGGCAAAGTCGT-3’擴(kuò)增片段長度為620bpY病毒(PVY)上游引物5’-ACTCGGGCAACTCAATCACAG-3’下游引物5’-GCGGCCTTCATTTGAATGT-3’擴(kuò)增片段長度為422bpS病毒(PVS)上游引物5’-GCCGCATTTGACACATTCGAT-3’下游引物5’-CAATCTCAGCGCCAAGCAT-3’擴(kuò)增片段長度為199bp
卷葉病毒(PLRV)上游引物5’-CGCGCTAACAGAGTTCAGCC-3’下游引物5’-GCAATGGGGGTCCAACTCAT-3’擴(kuò)增片段長度為336bp圖9為四種病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，圖中由由左至右依次為Mraker、PYX陽性材料PCR產(chǎn)物、卷葉病毒陽性材料PCR產(chǎn)物、PVS陽性材料PCR產(chǎn)物、PVY陽性材料PCR產(chǎn)物序列表.txt馬鈴薯<110>南開大學(xué)<120>一種檢測馬鈴薯病毒的試劑盒及方法<160>8<210>1<211>21<212>DNA<213>人工合成<220>
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序列表.txt馬鈴薯<222>(1)...(20)<400>1cgcgctaacagagttcagcc 20<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(20)<400>1gcaatgggggtccaactcat 20
權(quán)利要求
1.一種檢測馬鈴薯病毒的試劑盒，其特征在于，該試劑盒由反應(yīng)液、引物、酶液及陽性標(biāo)準(zhǔn)品組成，所述反應(yīng)液中的組分及體積百分比為5×鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液6％～50％、10×PCR反應(yīng)緩沖液3％～25％、25mmol/L Mg2+2.5％～15％、各25mmol/L dNTPs 0.7％～10％、滅菌水87.8％～0，所述引物為馬鈴薯X病毒引物、馬鈴薯Y病毒引物、馬鈴薯S病毒引物及馬鈴薯卷葉病毒引物中至少一種，所述馬鈴薯X病毒引物由序列表中SEQ ID NO.1表示的馬鈴薯X病毒上游引物和由序列表中SEQ ID NO.2表示的馬鈴薯X病毒下游引物組成，所述馬鈴薯Y病毒引物由序列表中SEQ ID NO.3表示的馬鈴薯Y病毒上游引物和由序列表中SEQ ID NO.4表示的馬鈴薯Y病毒下游引物組成，所述馬鈴薯S病毒引物由序列表中SEQ IDNO.5表示的馬鈴薯S病毒上游引物和由序列表中SEQ ID NO.6表示的馬鈴薯S病毒下游引物組成，所述馬鈴薯卷葉病毒引物由序列表中SEQ ID NO.7表示的馬鈴薯卷葉病毒上游引物和由序列表中SEQ ID NO.8表示的馬鈴薯卷葉病毒下游引物組成，各上、下游引物的濃度為0.5～2μmol/L，所述酶液的組分及體積百分比為鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶20％～50％、Taq DNA聚合酶20％～50％、滅菌水60％～0，所述陽性標(biāo)準(zhǔn)品為馬鈴薯X病毒克隆質(zhì)粒、馬鈴薯Y病毒克隆質(zhì)粒、馬鈴薯S病毒克隆質(zhì)粒及馬鈴薯卷葉病毒克隆質(zhì)粒中至少一種，并與馬鈴薯病毒引物相對應(yīng)，每種病毒克隆質(zhì)粒濃度均為107～1015copies/μl。
2.一種用權(quán)利要求1檢測馬鈴薯病毒的試劑盒檢測馬鈴薯病毒的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)從新鮮的茄科植物組織中提取總RNA；(2)對提取的總RNA進(jìn)行一步法逆轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)取PCR管，加入反應(yīng)液、待測病毒引物、酶液和總RNA，加水0～30μl，在41～43℃保溫20～40分鐘進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)；(3)PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，根據(jù)與陽性標(biāo)準(zhǔn)品相同的位置顯現(xiàn)特異性條帶的有無，判定標(biāo)本中是否存在馬鈴薯病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測馬鈴薯病毒的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)條件是93～95℃3～7分鐘——；93～95℃30～60秒——57～62℃30～60秒——70～72℃30～120秒，共25～40個循環(huán)；最后70～72℃延伸8～15分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測馬鈴薯病毒的試劑盒及檢測方法，該試劑盒由反應(yīng)液、引物、酶液及陽性標(biāo)準(zhǔn)品組成，反應(yīng)液由鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)緩沖液、dNTPs及滅菌水組成，引物為馬鈴薯病毒引物，陽性標(biāo)準(zhǔn)品為馬鈴薯病毒克隆質(zhì)粒，酶液由鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶、滅菌水組成，該檢測方法是從植物組織中提取總RNA；對總RNA進(jìn)行一步法逆轉(zhuǎn)錄－PCR反應(yīng)；PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，本發(fā)明省去了現(xiàn)有方法中，先逆轉(zhuǎn)錄再PCR的步驟，節(jié)省時間并降低了試劑成本，并有特異性強(qiáng)，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，不需要大型設(shè)備儀器，操作簡單，檢測速度快，無放射性污染，價格低廉等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/04GK1570146SQ20041001909
公開日2005年1月26日 申請日期2004年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月28日
發(fā)明者杜榮騫, 祁驥, 俞健, 羅智敏, 李德森 申請人:南開大學(xué), 天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司, 天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心