專利名稱：提高氫化可的松轉化率的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于提高氫化可的松轉化率的技術。特別涉及利用高壓改善轉化底物RSA溶解性、提高溶氧水平以及控制菌體形態(tài)，提高氫化可的松轉化率的方法。
背景技術：
甾體激素類藥物是臨床應用的一類重要藥物，隨著甾體藥物應用范圍的不斷擴大，甾體醫(yī)藥產業(yè)呈現(xiàn)出良好的發(fā)展態(tài)勢。從國際甾體醫(yī)藥產業(yè)的發(fā)展來看，1980年產量約為9.5t，銷售額15億美元，占醫(yī)藥產品總銷售額的4.3％；1990年產量增至105t，銷售額108億美元，年均遞增10.4％；2000年銷售額約200億美元，約占世界醫(yī)藥總銷售額的6％，成為僅次于抗生素的第二大類藥物。
氫化可的松作為甾體皮質激素藥物的重要品種，廣泛應用于治療腎上腺皮質功能不足和自身免疫性疾病，同時也是進一步合成其他藥物的中間體。因此，我國以及美國、荷蘭、德國、俄羅斯、波蘭等國家一直非常重視對氫化可的松的生產技術研究。美國是當今世界上最大的甾體激素生產國，也是最大的抗炎皮質激素生產國，產品多為高檔產品。我國具有豐富的可以用于生產甾體藥物的天然動植物資源，特別是薯芋皂素的利用，為我國甾體藥物的生產與發(fā)展提供了良好的契機。目前國際上甾體藥物的重要品種如性激素、皮質激素、避孕藥物、蛋白同化激素等，國內均可生產，不僅可滿足國內需要，而且還有部分出口。我國的甾體生物工業(yè)已具有一定的規(guī)模，已成為世界上氫化可的松、潑尼松的最大生產出口國，近幾年出口量呈激增的趨勢。但是當前在氫化可的松的生產中，存在著生產收率低、成本高的問題。研究表明，甾體化合物在水中的溶解度很低，一般的溶解度范圍為10-6～10-5mol/L，屬于難溶或微溶化合物，而微生物體內參與11β-羥基化作用的酶主要存在于水相中，加之又是一種胞內酶，因此使甾體底物與酶的接觸十分困難。正是甾體底物的這種難溶性嚴重影響了甾體轉化反應的速率和產率，成為羥基化反應過程中的限速反應，因此提高甾體底物的溶解性，是改進氫化可的松生產的關鍵。為滿足市場需要，研究、改善氫化可的松轉化底物RSA的溶解性、提高氫化可的松轉化率、降低成本、是當務之急，具有十分重要的意義。

發(fā)明內容
解決的問題
本發(fā)明針對氫化可的松轉化底物RSA(17α-羥基-孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯)溶解性差、氫化可低松轉化率低的問題；提出了一種提高氫化可的松轉化率的新方法。
技術方案本發(fā)明研究了不同壓力、處理時間和氧載體，對于氫化可的松轉化率的影響，提出了提高氫化可的松轉化率的技術方法，解決了甾體化合物在水中溶解度低、影響轉化反應速率和產率、生產成本較高的問題，從而提高了氫化可的松的轉化率。
具體方法如下生產氫化可的松的方法，一般以藍色梨頭霉(Abasidia coerulea)或新月彎孢霉(Curvularia lunata)為出發(fā)菌株，經擴大培養(yǎng)得到培養(yǎng)液，將菌體培養(yǎng)液與反應底物RSA，即17α-羥基-孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯混合后，置于反應釜中，在常壓下進行轉化反應制備氫化可的松。本發(fā)明的特點是，在上述進行轉化反應時，采取加入0～3mmol/L氧載體和控制壓力的方法，即不僅需要常壓處理，而且還要進行高壓處理。當施以高壓刺激時，改變壓力需勻速進行，高壓條件為壓力0.5～1MPa，當達到所需高壓后，恒壓轉化4～8h，用以提高氫化可的松轉化率。最后以高壓液相色譜檢測氫化可的松轉化率及RSA含量。
需要說明的是控制壓力的方法，是采取先常壓處理、然后再進行高壓處理；或是采取先常壓處理、后高壓處理，最后再進行常壓處理。
常壓轉化總時間藍色梨頭霉為40～44h，新月彎孢霉為66h。
加入氧載體如油酸、H2O2等。
本發(fā)明經高壓處理，反應底物RSA溶解性較常壓提高了27.6～50％、改變了霉菌菌絲球形態(tài)、氫化可的松轉化率較常壓提高了4.2～28.2％。
有益效果本發(fā)明探索了一種新的提高氫化可的松轉化率的方法，提高了RSA在水中的溶解性，改變了菌體的細胞形態(tài)，提高了甾體轉化反應的速率，從而有效地提高了氫化可的松的產率。通過提高氫化可的松轉化率，降低了生產成本，促進了該產品進一步的開發(fā)利用。本發(fā)明方法為氫化可的松的生產提供了一種新生產工藝，而且工藝簡單、較常壓對照條件下氫化可的松轉化率提高了約4.2～28.2％，既有經濟效益又有社會效益。
具體實施例方式
實施例1
·菌體活化在無菌條件下，將梨頭霉菌絲接種在PDA培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)5～6天，4℃保存?zhèn)溆谩?br> ·孢子懸浮液的制備取活化后斜面菌種1支，加入5mL無菌水，洗下孢子，制備成1×106～107個/mL的孢子懸浮液。
·藍色梨頭霉菌液體培養(yǎng)取1mL孢子懸浮液接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基內，在30℃、200/min、培養(yǎng)24h。
·甾體投料方法以1∶16(W/V)比例將RSA與80％乙醇溶液混合，即將0.3克甾體底物RSA磨成粉末狀，與4.8mL濃度為80％的乙醇溶液混合，在燒瓶內加熱回流溶解至澄清，將該4.8mL溶液迅速投入到100mL發(fā)酵液內進行轉化，即RSA投料比為0.3％(W/V)。
·轉化反應調節(jié)已投入底物RSA的轉化液pH值為6.5，進行轉化反應。其轉化條件為30℃，200r/min，轉化總時間為48h，即先在常壓條件處理24h后，勻速提高壓力至0.5MPa，在此壓力下處理4h，最后再在常壓條件下繼續(xù)處理20h(常壓對照轉化條件為30℃，攪拌轉速200r/min，轉化時間為48h)。以高壓液相色譜檢測氫化可的松轉化率及RSA含量，在此條件下氫化可的松轉化率較常壓對照條件提高10.9％。
實施例2本實施例中，將轉化液在常壓條件下處理30h后，提高壓力，進行高壓處理8h，最后再在常壓條件下繼續(xù)處理10h，其他條件同實施例1。在此條件下，氫化可低松轉化率較常壓對照條件提高了4.2％。
實施例3本實施例中，將轉化液在常壓條件下處理36h后，提高壓力，進行高壓處理6h，最后再在常壓條件下繼續(xù)處理6h。其他同實施例1。在此條件下，氫化可的松轉化率較常壓對照條件提高了28.2％。
實施例4本實施例中，將轉化液在常壓條件下處理42h后，將其轉至高壓條件下處理6h，其他同實施例1。在此條件下，氫化可的松轉化率較常壓對照提高了10.7％。
實施例5本實施例中，將壓力升至0.75Mpa，其他同實施例3。在此條件下，氫化可的松轉化率較常壓對照條件提高了24.6％。
實施例6本實施例中，將壓力升至1.0Mpa，其他同實施例3。在此條件下，氫化可的松轉化率較常壓對照條件提高19.7％。
實施例7
本實施例中，加入3mmol/L的H2O2，即在100mL轉化液中，加入濃度為30％H2O234μL，其他同實施例3。在此條件下，氫化可的松轉化率較常壓加H2O2對照條件提高22.3％。
實施例8本實施例采用新月彎孢霉為出發(fā)菌株。
·菌體活化在無菌條件下將新月彎孢霉菌絲接種在PDA培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)6天，4℃保存?zhèn)溆谩?br> ·孢子懸浮液的制備取活化后斜面菌種1支，加入5mL無菌水，洗下孢子，制備成1×106～107個/mL的孢子懸浮液。
·新月彎孢霉液體培養(yǎng)取1mL孢子懸浮液，接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基內，在28℃、180r/min培養(yǎng)24h。
·甾體投料方法以1∶16(W/V)比例將RSA與80％乙醇溶液混合，即將0.1克甾體底物RSA磨成粉末狀，與1.6mL濃度為80％的乙醇溶液混合，在燒瓶內加熱回流溶解至澄清，將該1.6mL溶液迅速投入到100mL發(fā)酵液內進行轉化，即RSA投料比為0.1％(W/V)。
·新月彎孢霉轉化反應28℃，200r/min，轉化總時間為72h，即先在常壓條件處理60h后，勻速提高壓力至0.5MPa，在此壓力下處理6h，最后再在常壓條件下繼續(xù)處理6h，(常壓對照轉化條件為30℃，攪拌轉速180r/min，轉化時間為72h)。以高壓液相色譜檢測氫化可的松轉化率及RSA含量，在此條件下氫化可的松轉化率較常壓對照條件提高10.9％。
實施例9稱取0.1g研磨過的RSA，加入80％乙醇1.6mL，補加水到100mL；再從中取36mLRSA溶液，補加水到60mL；將此60mL溶液平均分成兩份，一份進行常壓處理，一份進行高壓處理。
常壓對照試驗的處理條件是在30℃，200r/m搖床上進行1h。高壓試驗的處理條件是30℃，200r/m，在壓力為0.5Mpa的高壓反應釜中保壓1h。隨后分別取10mL樣品，加入離心管里，以4000r/m離心10min。取上清液在242nm下測其吸光度。在此條件下，RSA在水中溶解性較常壓對照條件提高了27.6％。
實施例10本實施例中，將壓力提高至0.75Mpa，其他同實施例8。在此條件下，RSA在水中溶解性較常壓對照條件提高了49.0％。
實施例11本實施例中，將壓力提高至1.0Mpa，其他同實施例8。在此條件下，RSA在水中溶解性較常壓對照條件提高了50.0％。
權利要求
1.提高氫化可的松轉化率的方法，一般以藍色梨頭霉(Abasidia coerulea)或新月彎孢霉(Curvularia lunata)為出發(fā)菌株，經擴大培養(yǎng)得到培養(yǎng)液，將菌體培養(yǎng)液與反應底物RSA，即17α-羥基-孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯混合后，置于反應釜中，在常壓下進行轉化反應制備氫化可的松，其特征在于進行轉化反應時，采取加入0～3mmol/L氧載體和控制壓力，即不僅需要常壓處理，而且還要進行高壓處理，當施以高壓刺激時，改變壓力需勻速進行，高壓條件為壓力0.5～1MPa，當達到所需高壓后，恒壓處理4～8h，用以提高氫化可的松轉化率；最后以高壓液相色譜檢測氫化可的松轉化率及RSA含量。
2.按照權利要求1所述的提高氫化可的松轉化率的方法，其特征在于控制壓力的方法，采取先常壓處理、然后再進行高壓處理。
3.按照權利要求1所述的提高氫化可的松轉化率的方法，其特征在于控制壓力的方法，采取先常壓處理、后高壓處理，最后再進行常壓處理。
4.按照權利要求1、2或3所述的提高氫化可的松轉化率的方法，其特征在于常壓轉化總時間藍色梨頭霉為40～44h，新月彎孢霉為66h。
5.按照權利要求1所述的提高氫化可的松轉化率的方法，其特征在于加入氧載體如油酸、H2O2等。
6.按照權利要求1所述的提高氫化可的松轉化率的方法，其特征在于經高壓處理，反應底物RSA溶解性較常壓提高了27.6～50％、改變了霉菌菌絲球形態(tài)、氫化可的松轉化率較常壓提高了4.2～28.2％。
全文摘要
提高氫化可的松轉化率的方法，屬于通過加壓處理，改善轉化底物RSA溶解性和控制菌體形態(tài)，提高氫化可的松轉化率的方法。它解決了目前生產氫化可的松收率低、成本高的問題。它是以藍色梨頭霉或新月彎孢霉為出發(fā)菌株，經種子擴大培養(yǎng)，得到菌體培養(yǎng)液，投入甾體底物，當進行轉化反應時，采取加入0～3mmol/L氧載體和控制壓力，即不僅需要常壓處理，而且還要進行高壓處理。當施以高壓時，壓力為0.5～1MPa，恒壓處理4～8h。該方法工藝簡單，較常壓對照條件下氫化可的松轉化率提高了4.2～28.2％，降低生產成本，促進了該產品進一步的開發(fā)利用。本發(fā)明為氫化可的松的生產提供了一種新工藝，既有經濟效益又有社會效益。
文檔編號C12P33/00GK1594590SQ200410019858
公開日2005年3月16日 申請日期2004年7月1日 優(yōu)先權日2004年7月1日
發(fā)明者賈士儒, 喬長晟, 徐旭, 范志華 申請人:天津科技大學