專利名稱：聚乙二醇修飾的含脫氫酶生物硅凝膠的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種含脫氫酶生物硅凝膠的制備方法，屬于酶的凝膠包埋固定化技術。
背景技術：
sol-gel法一般是前驅體在水、助溶劑(通常為醇)及催化劑(酸或堿)存在下，發(fā)生水解和縮聚反應，釋放出水和相應的醇等，形成三維網(wǎng)絡，得到濕凝膠，濕凝膠經(jīng)過陳化、干燥得到干凝膠。sol-gel法可在低溫條件下實現(xiàn)對材料顯微結構的裁剪和調控，作為一種“軟化學”方法，它為生物分子摻雜于無機或無機-有機復合基質中提供了新途徑。
與傳統(tǒng)的物理吸附、化學交聯(lián)和化學鍵合等固定化方法相比，現(xiàn)有的sol-gel固定化酶方法雖然具有許多突出優(yōu)點，如固定化酶的可調控性、固定化過程的高效性及普適性等，但尚存在一些明顯缺點，總體表現(xiàn)是缺乏分子水平上調控凝膠結構的手段以及固定化過程中和固定化后基質對酶的生物相容性。具體的問題主要體現(xiàn)在下述幾方面(1)基質的剛性強而柔性差，易破碎；(2)凝膠基質的微觀結構，如孔徑(一般小于1.5nm)和孔道結構，使底物和產(chǎn)物的擴散速度慢，酶與底物不易接觸，從而使酶的表觀活性降低。固定化酶的凝膠孔徑需滿足兩方面的要求一方面，凝膠孔徑應足夠大以使體系分子(包括緩沖液中的離子、底物和產(chǎn)物等)能自由傳遞；另一方面，凝膠孔徑又不能太大，以防止固定化的酶分子的流失和環(huán)境中存在的諸如微生物等雜質的侵入。因此，調節(jié)出適當?shù)哪z孔徑及有序的孔道結構對提高酶活性是非常有益的。(3)酶所處微環(huán)境的改變引起酶活性降低。酶的構象維持是決定其活性的關鍵。酶分子的構象主要是由靜電作用力、范德華力、疏水作用以及氫鍵構成的復雜的立體結構來維持的。在酶的sol-gel法固定化過程中，由于氧化硅凝膠粒子與酶的多肽鏈之間存在的相互作用以及助溶劑和前驅體水解產(chǎn)生的醇等有機物的存在會破壞酶的構象，從而引起酶活性降低。
為增大凝膠的孔徑，常采用表面活性劑作為模板劑，在水解過程中，溶膠粒子圍繞表面活性劑膠束堆積并凝膠化，然后去除表面活性劑，得到孔徑可調的凝膠。這種方法雖然在增大孔徑上有明顯效果，但由于表面活性劑往往對酶的結構造成破壞，使酶失活或活性下降，所以不適宜用于酶的固定化。非表面活性劑，如葡萄糖、麥芽糖、二苯甲酰酒石酸等，作為模板劑用于調控凝膠孔結構可以解決與酶的相容性問題。如在用正硅酸乙酯或正硅酸甲酯包埋堿性磷酸酶的過程中，加入上述非表面活性劑作為模板劑，得到的凝膠孔徑較傳統(tǒng)凝膠孔徑提高1倍，且孔道相互連通，既有利于酶與底物之間的充分接觸，同時也有助于底物與產(chǎn)物的擴散。但要調控出不同孔徑的凝膠，需要采用不同類型的非表面活性劑。利用聚乙二醇(PEG)作模板劑控制納米凝膠材料的結構是近年來sol-gel化學發(fā)展的新動態(tài)，通過調變PEG的大小和用量能夠更便捷且有效地控制材料的結構及性能。PEG是一種線性、親水、靈活而不帶電的分子，具有很好的生物相容性，它的加入可以增強凝膠基質的柔性和親水性。PEG修飾凝膠雖增大了孔徑，但對孔的完整性的維持較差，在干燥和老化過程中，容易發(fā)生孔的坍塌。
酶分子的化學修飾是以酶分子空間結構和生物功能為基礎，通過引入或除去化學基團，使其共價結構發(fā)生改變來對酶分子定向改造得到性能更符合要求的非天然大分子。目前常用的酶修飾劑包括小分子修飾劑，如乙酰咪唑、鹵代乙酸、N-乙基馬來酰亞胺、碳化二亞胺、焦碳酸二乙酯、四硝基甲烷、N-鹵代琥珀酰亞胺等，以及大分子修飾劑，如PEG、聚氨基酸、乙二酸/丙二酸的共聚物、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、環(huán)糊精等。它們都是利用修飾劑分子與某一特定的氨基酸殘基的側鏈基團發(fā)生化學反應并形成共價鍵來實現(xiàn)對酶的修飾。大分子修飾劑多用于保護酶的活性基團，增強酶在有機溶劑中的性能。PEG類修飾劑與其他修飾劑相比，毒性小，具有良好的兩親性和生物相容性。特別是當酶經(jīng)過PEG類修飾劑修飾后，修飾劑的許多優(yōu)良性質也會隨之移植到修飾酶中。PEG分子末端有兩個能被活化的-OH基團，化學修飾時則多采用單甲氧基聚乙二醇的衍生物為修飾劑。PEG衍生物與酶的共價結合多是以酶分子上具有親核性的賴氨酸殘基作為修飾位點，如SS-PEG與賴氨酸氨基形成酯鍵，SC-PEG與之形成尿烷鍵。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種含脫氫酶生物硅凝膠的制備方法。本發(fā)明提供的PEG修飾溶膠-凝膠過程操作易行，凝膠的平均孔徑較大，底物和產(chǎn)物在基質中的傳遞速度較高，固定化PEG衍生物修飾酶的空間結構維持率和酶的活性維持率較高。
本發(fā)明是通過下述技術方案加以實現(xiàn)的。一種聚乙二醇修飾的含脫氫酶生物硅凝膠的制備方法，其特征在于包括以下步驟1 在濃度為1～10mg/mL的磷酸鹽緩沖液中，加入脫氫酶及與酶分子的質量比為1～3的能與酶分子上賴氨酸殘基反應的SS-PEG、SC-PEG聚乙二醇衍生物修飾劑。
在反應溫度為25℃和pH值為7.0的條件下，制得PEG修飾劑修飾的脫氫酶溶液；2在水中，加入與水的摩爾比為0.05～0.10的正硅酸甲酯、正硅酸乙酯或正硅酸異丙酯前驅體，并加入與上述前驅體的摩爾百分比為0.5～5％的分子量為200～5000的PEG修飾劑，及加入與上述前驅體的摩爾比為1.0～2.0的鹽酸、硫酸、硝酸、乙酸、氫氧化鈉、氨水、磷酸鹽、醋酸鹽催化劑。在反應溫度20～25℃，pH值在7.0的條件下，水解和縮聚反應制得PEG修飾劑修飾的二氧化硅溶膠；3將步驟1得到的PEG修飾后的脫氫酶溶液與步驟2得到的PEG修飾劑修飾的二氧化硅溶膠混合，在1分鐘之內形成凝膠，靜置5～7天得到PEG修飾的含脫氫酶生物硅凝膠。
本發(fā)明制備的含酶凝膠經(jīng)測定，其平均孔徑為4.0～10納米，比表面積為500～600m2/g。
本發(fā)明提出的制備方法的優(yōu)點在于凝膠的平均孔徑較大，固定化后酶的空間結構維持率和酶活性維持率高，固定化過程簡便易行。
具體實施例方式
實施例一稱取2.60g正硅酸乙酯(TEOS)放入塑料試管中，加入1.5％的HCl溶液0.55g，加入相對分子質量為600的PEG 0.0747g，在旋渦混合儀上混合至形成均一溶液，然后邊混合邊滴加1％的NaOH溶液1.05g，用以調節(jié)pH至接近中性，凝膠化后形成透明空白溶膠(A)。
稱取ADH(購自Sigma公司)17.5mg，溶于5mL 0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)中，加入52.5mg的SC-PEG。在25℃，pH7.0條件下，反應2h，得到PEG修飾ADH溶液(B)。
取0.5mL空白溶膠(A)與0.5mL酶溶液(B)在聚苯乙烯試管中混合，大約50～60s內形成凝膠。將試管密封，4℃下靜置老化7天，得到含PEG修飾脫氫酶的PEG600修飾硅凝膠。
實施例二稱取2.60g正硅酸乙酯(TEOS)放入塑料試管中，加入1.5％的HCl溶液0.55g，加入相對分子質量為600的PEG 0.3735g，在旋渦混合儀上混合至形成均一溶液，然后邊混合邊滴加1％的NaOH溶液1.05g，用以調節(jié)pH至接近中性，凝膠化后形成透明空白溶膠(A)。
稱取ADH(購自Sigma公司)17.5mg，溶于5mL 0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)中，加入52.5mg的SC-PEG。在25℃，pH7.0條件下，反應2h，得到PEG修飾ADH溶液(B)。
取0.5mL空白溶膠(A)與0.5mL酶溶液(B)在聚苯乙烯試管中混合，大約50～60s內形成凝膠。將試管密封，4℃下靜置老化7天，得到含脫氫酶硅凝膠。
實施例三稱取2.60g正硅酸乙酯(TEOS)放入塑料試管中，加入1.5％的HCl溶液0.55g，加入相對分子質量為400的PEG 0.0500g，在旋渦混合儀上混合至形成均一溶液，然后邊混合邊滴加1％的NaOH溶液1.05g，用以調節(jié)pH至接近中性，凝膠化后形成透明空白溶膠(A)。
稱取ADH(購自Sigma公司)17.5mg，溶于5mL 0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)中，加入35.0mg的SC-PEG。在25℃，pH7.0條件下，反應2h，得到PEG修飾ADH溶液(B)。
取0.5mL空白溶膠(A)與0.5mL酶溶液(B)在聚苯乙烯試管中混合，大約50～60s內形成凝膠。將試管密封，4℃下靜置老化7天，得到含脫氫酶硅凝膠。
實施例四將NADH和甲醛溶解到0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液中，配成NADH濃度為50～250μmol/L，甲醛濃度為3～30mmol/L的溶液。將老化后的凝膠取出，用大量pH＝7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液浸泡，其間多次更換新鮮的緩沖液，并取樣進行氣相色譜分析，至無乙醇殘留。取出凝膠，加入一定量的NADH溶液，使ADH的濃度為0.087mg/mL，浸泡24h，使NADH充分擴散到凝膠內部。25℃下反應。采用340nm分光光度法，在一定的時間間隔內，測定NADH濃度的變化確定反應進度。在不同的底物濃度下即可得到各濃度下的反應初速度。
本發(fā)明采用sol-gel法將PEG修飾的甲醇脫氫酶(ADH)包埋于PEG修飾的SiO2多孔基質中作為催化劑，以還原型煙酰胺腺嘌呤二核甙酸(NADH)作為電子供體，通過酶促反應將甲醛轉化為甲醇，反應式如下
本發(fā)明采用的固定化酶法將甲醛轉化為甲醇反應中的反應初速度較未經(jīng)修飾的固定化酶的反應初速度提高?？梢姡附?jīng)修飾并包埋于修飾凝膠后，由于凝膠孔結構的改善，底物與酶的可及性提高，底物和產(chǎn)物的擴散速度增大，表現(xiàn)為酶的反應活性提高。酶和凝膠經(jīng)修飾后，其活性維持率大大提高，存放92天后，ADH活性幾乎沒有變化。
權利要求
1.一種經(jīng)聚乙二醇修飾的含脫氫酶生物硅凝膠的制備方法，其特征在于包括以下過程1)在濃度為1～10mg/mL的磷酸鹽緩沖液中，加入脫氫酶及與酶分子的質量比為1～3的能與酶分子上賴氨酸殘基反應的SS-PEG、SC-PEG聚乙二醇衍生物修飾劑，在反應溫度為25℃和pH值為7.0的條件下，制得PEG修飾劑修飾的脫氫酶溶液；2)在水中，加入與水的摩爾比為0.05-0.10的正硅酸甲酯、正硅酸乙酯或正硅酸異丙酯前驅體，并加入與上述前驅體的摩爾百分比為0.5～5％的分子量為200～5000的PEG修飾劑，及加入與上述前驅體的摩爾比為1.0～2.0的鹽酸、硫酸、硝酸、乙酸、氫氧化鈉、氨水、磷酸鹽、醋酸鹽催化劑，在反應溫度20～25℃，pH值在7.0的條件下，水解和縮聚反應制得PEG修飾劑修飾的二氧化硅溶膠；3)將步驟1)得到的PEG修飾后的脫氫酶溶液與步驟2)得到的PEG修飾劑修飾的二氧化硅溶膠混合，在1分鐘之內形成凝膠，靜置5～7天得到PEG修飾的含脫氫酶生物硅凝膠。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種經(jīng)聚乙二醇修飾的含脫氫酶生物硅凝膠的制備方法。屬于酶的凝膠包埋固定化技術。該方法包括以下過程在磷酸鹽緩沖液中，加入脫氫酶和能與酶分子上賴氨酸殘基反應的SS－PEG、SC－PEG聚乙二醇衍生物修飾劑，制得PEG修飾劑修飾的脫氫酶溶液；在水中，以正硅酸甲酯、正硅酸乙酯或正硅酸異丙酯為前驅體，加入PEG修飾劑，以鹽酸、硫酸、硝酸、乙酸、氫氧化鈉、氨水、磷酸鹽、醋酸鹽為催化劑，制備PEG修飾劑修飾的二氧化硅溶膠；將PEG修飾后的脫氫酶溶液與PEG修飾劑修飾的二氧化硅溶膠混合，得到PEG修飾的含脫氫酶生物硅凝膠。本發(fā)明的優(yōu)點在于凝膠的平均孔徑較大，固定化后酶的空間結構維持率和酶活性維持率高，固定化過程簡便易行。
文檔編號C12N11/04GK1597948SQ200410020228
公開日2005年3月23日 申請日期2004年8月3日 優(yōu)先權日2004年8月3日
發(fā)明者姜忠義, 吳洪, 黃淑芳 申請人:天津大學