專利名稱：一種毒殺植物寄生線蟲的芽孢桿菌及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種毒殺植物寄生線蟲的芽孢桿菌及其制備方法和應用，屬微生物農藥技術領域。
背景技術：
植物寄生線蟲是主要的農業(yè)害蟲之一。由于植物寄生線蟲具有地域分布廣、宿主種類多樣，并且容易使發(fā)生病蟲害的植物繼發(fā)真菌或細菌感染，進一步加重對植物危害，因此據不完全估計植物寄生線蟲每年造成全球超過1000億美元的損失。我國線蟲主要危害煙草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、三七、西洋參等主要經濟作物，成為發(fā)展這些作物的重要限制因子。據全國煙草病蟲害防治信息中心不完全統(tǒng)計，2001年全國煙草根結線蟲發(fā)病面積已達55萬公頃，直接經濟損失5億多元。僅云南省發(fā)病面積就達2.7萬公傾，直接經濟損失1.2億元，間接損失更為嚴重。黑龍江省僅大豆胞囊線蟲每年造成的損失達8億元之多。松材線蟲被稱為無煙森林火災，在江蘇、浙江、廣東、山東、安徽、湖北、上海、臺灣、香港等部份地區(qū)嚴重發(fā)生，并有向全國漫延的趨勢。雖然可以通過傳統(tǒng)輪作、土壤改良等途徑可以控制某些植物的線蟲病，但是其應用容易受到地域和線蟲本身具有長期潛伏性等因素的影響；目前我們所主要依賴化學防治方法，由于大多數化學殺蟲劑為高毒、高殘留或破壞臭氧層的農藥，隨著使用時間的延長，其弊端日趨顯著，逐步的限制了化學殺蟲劑的使用。因此，病原線蟲生物防治日益受到重視。目前世界上研究開發(fā)的線蟲生防制劑中主要是真菌殺線蟲劑，由于土壤存在的抑真菌作用等因素的影響，限制了線蟲生防的發(fā)展。同時，在微生物家族中，細菌是工業(yè)化生產技術最成熟的種類，研究開發(fā)細菌殺線蟲劑受到各國科學家重點關注。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服現有技術不足，通過對一株具有毒殺植物寄生線蟲功能的芽孢桿菌研究，開發(fā)細菌源生物殺線蟲劑。
本發(fā)明采用的細菌是食線蟲芽孢桿菌(Bacillus nematocidus)B16菌株，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京.中關村；保藏日期2004年4月5日；保藏登記入冊編號CGMCC No.1128。
食線蟲芽孢桿菌(Bacillus nematocidus)系本發(fā)明人在開展胞外蛋白酶對線蟲侵染機制的研究中，從大量土壤細菌中篩選到芽孢桿菌屬1個新種。研究發(fā)現其對線蟲具極高的毒殺活性，通過多批次殺線蟲活性試驗確定其活性后，委托武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)對菌株進行鑒定，確定為食線蟲芽孢桿菌新種，Bacillus nematocidus。
菌株主要形態(tài)特征為長桿狀，個體較大，兩端鈍圓，多以散在形式存在。在LB平板培上菌落呈圓形，表面粗糙無光澤，類似細小粉末狀，菌苔白色。在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)72小時以上可見極少數的內生孢子形成或釋放到胞外的芽孢，5天后菌體幾乎全生成芽孢。芽孢為長柱形，亞端生。
本發(fā)明采用的是從食線蟲芽孢桿菌Bacillus nematocidus新種中分離出的1株綜合性狀較好的菌株B16，鑒于該菌株可能由于(自發(fā)的、物理的或化學的)突變、原生質體融合，轉化或其他通過生物技術而發(fā)生變化或被改造，本菌種任何菌株的突變株、變種和衍生物均在本發(fā)明的保護范圍內。
對B16菌株毒殺線蟲作用機理研究發(fā)現，其殺線蟲功能主要源于蛋白、酶成份。主要作用機理是菌株產生的胞外蛋白酶分解線蟲體壁，破壞線蟲體壁的完整，使線蟲內容物外瀉，最終將線蟲殺死。在整個殺線蟲過程中，伴隨著產生蛋白酶、幾丁質酶對線蟲的作用，其毒力顯著。
本發(fā)明是這樣實現的擴大培養(yǎng)B16菌株，提取殺線蟲有效成分，進行殺線蟲藥效試驗，確定其對線蟲的作用。
B16培養(yǎng)方法(以下為重量百分比)1、試管種培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為1-3％酵母提取物，0.5-2％蛋白胨；1-4％葡萄糖；1-3％NaCl；1.8-2％瓊脂；pH6-7。將B16菌體接種到培養(yǎng)基上，28-32℃下培養(yǎng)1-3天，獲得試管種；2、液體擴大培養(yǎng)液體培養(yǎng)基配方為1-3％酵母提取物；0.5-2％蛋白胨；1-4％葡萄糖；1-3％NaCl；pH6-7，余下為水。將試管種接種到500ml三角瓶液體培養(yǎng)基中，每瓶裝200ml，于25-37℃下搖床培養(yǎng)培養(yǎng)時間2-5天，轉速為200-300rpm。
3、提取殺線蟲活性成份將發(fā)酵培養(yǎng)物于5000rpm/min離心10分鐘，取上清液，按0％-100％飽和度加入硫酸銨，于4℃靜置2小時，然后8000rpm/min離心30分鐘，棄上清。用50mM磷酸緩沖液(39ml的50mM磷酸二氫鈉加61ml的50mM磷酸氫二鈉，pH為7)重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋(MW8,000-14000Da)于10-20倍的50mM磷酸緩沖液中透析3-4次，每次3小時，即得殺線蟲藥液。將藥液保存于4℃冰箱中待用。
B16殺線蟲活性試驗1、制備試驗用藥劑按前述液體擴大培養(yǎng)方法培養(yǎng)B16菌株，按前述提取殺線蟲活性成份的方法制備試驗用藥劑。
2、制備對照用藥劑對照1前述1制備試驗用藥劑方法制備對照用藥劑，但培養(yǎng)基中不接入B16菌株。
對照2以50mM磷酸緩沖液作為對照。
對照3以透析后的透析溶液作為對照對照4為了證明殺線蟲有效成份是蛋白，將制備供試藥劑煮沸滅活后作為對照。
3、制備試驗用線蟲(1)制備Panagrellus redivivus線蟲將P.redivivus線蟲接種于燕麥片培養(yǎng)基上，于28℃下培養(yǎng)6天，凍于4℃冰箱備用。將所需線蟲用貝曼漏斗法洗出，置于5ml離心管內，加5ml無菌水洗滌，瞬時離心，棄上清，重復5次得到潔凈供試線蟲。用無菌水將線蟲稀釋為含量為15條/μl的線蟲懸浮液。
(2)制備松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)在100ml三角瓶中放入15g經水浸泡2天的玉米粒，加水10ml，高壓滅菌，接入灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。25℃培養(yǎng)4至7天。待菌絲鋪滿三角瓶后，接種經0.25％次氯酸鈉表面消毒的松材線蟲，28℃培養(yǎng)15至20天。用無菌水將線蟲洗下，制成含量為15條/μl的線蟲懸浮液。
3、試驗方法(1)藥效試驗方法取試驗用藥劑200μl于1.5ml離心管中，加入活線蟲150條，離心管平放，置于25℃下，Panagrellus redivivus線蟲分別于12小時、24小時、48小時；松材線蟲分別于24小時、48小時、60小時檢查計算線蟲的死亡率。并在光學顯微鏡下觀察，觀察線蟲體壁變化情況鑒定死亡的方法為在處理離心管中加入1-5滴5％Nacl溶液，2分鐘后觀察，死蟲僵直，活蟲則卷曲或扭動。
分別用3種對照藥劑，每處理重復三次。

4、試驗結果表1 B16對Panagrellus redivivus線蟲毒殺效果

表2 B16對松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus毒殺效果

結果表明，從B16菌株液體發(fā)酵產物中提取的試驗用藥劑對Panagrellusredivivus、Bursaphelenchus xylophilus線蟲均具較好的殺蟲效果，48小時線蟲的平均死亡率在90％以上。將處理后線蟲在光鏡下觀察，與對照相比，實驗組線蟲體壁由完整—部分溶解—完全溶解變化明顯。由于線蟲體壁的破壞，線蟲內容物大量外瀉，致使線蟲最終死亡。但由于供試線蟲不同，其作用時間也不相同。Panagrellus redivivus線蟲36小時死亡率已達98％，而松材線蟲60小時死亡達95％。
結果同時表明，在B16菌株中，殺線蟲的主要活性成份是酶類。而將同批提取的試驗用藥劑(對照4)經過煮沸，導致蛋白質變性后，其殺線蟲活性非常小，且線蟲體壁不出現溶解現象，這也進一步確證了B16對線蟲的活性成份主要為酶類。
本發(fā)明B16菌株是一類全新發(fā)現的具有顯著的殺線蟲活性的食線蟲芽孢桿菌，其主要作用成份是酶。同時B16菌株在本發(fā)明培養(yǎng)條件下生長快，容易進行工業(yè)化生產，具備了很好的應用開發(fā)前景。
具體實施例方式以下是本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明的內容并不局限于此。
實施例一將食線蟲芽孢桿菌(Bacillus nematocidus)B16菌體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為2％酵母提取物，1.5％蛋白胨；2％葡萄糖；1-3％NaCl；1.8％瓊脂；pH7。將B16菌體接種到培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)2天，獲得試管種。
將試管種接種到250ml三角瓶液體培養(yǎng)基中(每瓶裝100ml)，液體培養(yǎng)基配方為2％酵母提取物；1.5％蛋白胨；2％NaCl；3％葡萄糖；pH7，余下為水。于30℃搖床培養(yǎng)培養(yǎng)時間3天，轉速為220rpm。
將發(fā)酵培養(yǎng)物于8000rpm/min離心20分鐘，取上清液，按100％飽和度的比例加入硫酸銨，于4℃靜置2小時，然后8000rpm/min離心30分鐘，棄上清。用50mM磷酸緩沖液(39ml的50mM磷酸二氫鈉加61ml的50mM磷酸氫二鈉，pH為7)重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋(MW8,000-14000Da)于10-20倍的50mM磷酸緩沖液中透析3-4次，每次3小時，即得殺線蟲藥液。
實施例二基本同實施例一，不同之處是液體培養(yǎng)基配方，其配方為3％酵母提取物；0.5％蛋白胨；1％NaCl；1％葡萄糖。
實施例三基本同實施例一，不同之處是液體培養(yǎng)基配方，其配方為1％酵母提取物；2％蛋白胨；3％NaCl；4％葡萄糖。
權利要求
1.一種具有毒殺植物寄生線蟲的芽孢桿菌，其特征在于該細菌為食線蟲芽孢桿菌Bacillus nematocidus B16，B16菌株已于2004年4月5日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.1128。
2.一種具有毒殺植物寄生線蟲的芽孢桿菌的制備方法，由常規(guī)方法培養(yǎng)，其特征在于液體培養(yǎng)基配方為1-3％酵母提取物；0.5-2％蛋白胨；1-4％葡萄糖；1-3％NaCl；pH6-7。
3.權利要求1和權利要求2所述的食線蟲芽孢桿菌，其特征在于該細菌對Panagrellus redivivus線蟲和松材線蟲具有毒殺作用，可以應用于植物寄生線蟲生物防治。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種毒殺植物寄生線蟲的芽孢桿菌及其制備方法和應用，屬微生物農藥技術領域。本發(fā)明的生產菌株為食線蟲芽孢桿菌Bacillus nematocidus B16，采用常規(guī)方法制備，其液體培養(yǎng)基配方為1－3％酵母提取物；0.5－2％蛋白胨；1－4％葡萄糖；1－3％NaCl；pH6－7。本發(fā)明菌株具有的殺線蟲主要活性成分是酶類，將菌株液體發(fā)酵后，按常規(guī)酶類提取方法從代謝產物中提取殺線蟲有效成分。本發(fā)明食線蟲芽孢桿菌對Panagrellus redivivus線蟲松材線蟲具有顯著的毒殺活性，同時在本發(fā)明培養(yǎng)條件下生長快，容易進行工業(yè)化生產，具備了很好的應用開發(fā)前景。
文檔編號C12N1/20GK1690189SQ20041002237
公開日2005年11月2日 申請日期2004年4月21日 優(yōu)先權日2004年4月21日
發(fā)明者黃曉瑋, 牛秋紅, 張克勤 申請人:云南大學