專利名稱：用輔助復(fù)性的方法制備重組瑞替普酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域中的重組蛋白質(zhì)藥物制備技術(shù)。
組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)的39KD重組異構(gòu)體瑞替普酶(簡稱r-PA)是t-PA的一種分子改造衍生物。它包含有野生型t-PA的Kringle2結(jié)構(gòu)域和蛋白酶結(jié)構(gòu)域，不含糖基化位點(diǎn)。r-PA具有t-PA的溶血栓活性，但半衰期延長，并且出血副作用小，比t-PA具有使用方便安全經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢，是取代t-PA的理想溶血栓藥物。
因?yàn)閞-PA不含糖基化位點(diǎn)，可以用大腸桿菌來表達(dá)。我們構(gòu)建了高效表達(dá)r-PA的工程菌以表達(dá)r-PA。由于r-PA含有十對二硫鍵，用細(xì)菌表達(dá)的r-PA形成包含體形式，溶解變性后用常規(guī)方法復(fù)性很難正確折疊和復(fù)性成活性形式。這是由于組成十對二硫鍵的20個(gè)半胱氨酸在復(fù)性錯(cuò)誤配對造成的。為了提高變性r-PA的復(fù)性率，我們發(fā)明了用二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)促進(jìn)復(fù)性的生產(chǎn)工藝，我們在r-PA的復(fù)性體系中加入重組人二硫鍵異構(gòu)酶(rhPDI)，使錯(cuò)誤的二硫鍵打開重新形成正確的二硫鍵，從而提高復(fù)性率，最終提高r-PA的產(chǎn)率，降低成本，并可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明原理是二硫鍵異構(gòu)酶PDI可以特異性地作用于蛋白分子中錯(cuò)配的二硫鍵，打開該錯(cuò)配的二硫鍵，并促進(jìn)其形成正確配對的二硫鍵，完成分子結(jié)構(gòu)重排，形成正確活性形式，達(dá)到復(fù)性的目的。
本發(fā)明的目的使用二硫鍵異構(gòu)酶催化變性的r-PA形成正確配對的二硫鍵，從而復(fù)性成正確的有活性的分子構(gòu)型。這樣可提高r-PA的復(fù)性率，降低異構(gòu)體比例，簡化后續(xù)純化步驟，由此提高r-PA的產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本。
技術(shù)方案r-PA的工程菌菌種活化→高效表達(dá)r-PA→菌體離心收獲→菌體破碎→包含體離心分離→高濃度鹽酸胍按一定比例變性溶解→在復(fù)性體系中按一定比例加入重組人PDI以催化r-PA的復(fù)性→Sephardex G-25脫鹽→Lys-Sepharose 4B親和層析→CM-Sepharose陽離子交換層析→Sephadex G-25脫鹽。經(jīng)上述步驟即可制備得到純度大于95％，比活性高于6×105IU/mg的r-PA。
最佳實(shí)施例r-PA復(fù)性體系如下50mM Tris，pH7～10，氧化型谷胱甘肽10～1mM，還原型谷胱甘肽1～0.1mM，r-PA蛋白濃度0.01～1mg/ml。在此復(fù)性體系中加入重組人二硫鍵異構(gòu)酶PDI，使r-PA與PDI的摩爾比為100∶1～10∶1。在加入PDI的復(fù)性體系中進(jìn)行復(fù)性，r-PA的復(fù)性率比不加PDI時(shí)有顯著提高，二硫鍵錯(cuò)配造成的異構(gòu)體比例大大降低，r-PA的終產(chǎn)率也相應(yīng)提高。
r-PA的制備方法如下r-PA工程菌37℃活化12～16h，接于大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，150rpm振蕩培養(yǎng)12～16h，菌體密度O.D600達(dá)0.5～1.0。按0.5～1.0％比例將細(xì)菌轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)液中，恒溫37℃培養(yǎng)80～90分鐘，當(dāng)菌體密度至OD600≈0.5～0.8時(shí)，加入0.5～1mMol/l的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)r-PA，誘導(dǎo)時(shí)間3～6h。將誘導(dǎo)后的發(fā)酵液在4℃條件下，5000～8000×g離心10～15min，棄上清，沉淀即為表達(dá)后的r-PA工程菌菌體。將菌體按1∶10～1∶20的比例充分懸浮于50mM Tris，pH8.0的緩沖液中，在400w的功率下超聲200～300秒，菌體破碎。超聲后于4℃，10000～12000×g的條件下離心30min，所得沉淀即為r-PA包含體。包含體用6～8M鹽酸胍，50mMTris，100～150mM DTT變性液，經(jīng)過充分勻質(zhì)后，攪拌30～60分鐘。于室溫18～25℃條件下充分溶解4～8h。10000～12000×g，15℃條件下離心30分鐘，取上清，即為變性的r-PA。
將變性的r-PA緩慢滴加到不斷攪拌的復(fù)性體系中，使得r-PA終濃度0.1mg/ml，室溫18-25℃過夜(12～14h)。將上述復(fù)性液用5KD膜超濾濃縮換鹽后，用Lys-Sepharose親和層析柱純化(以50mMPB，pH8.0的緩沖液為平衡緩沖液，用含0.2M賴氨酸，0.5～1.0MNacl的平衡緩沖液為洗脫液)，收集紫外A280吸收峰。用Sephadex G-25脫鹽后，再經(jīng)過CM-Sepharose柱層析(平衡緩沖20mMPB，pH6.0，0～1.0M Nacl線性梯度洗脫)，最佳洗脫濃度是0.2～0.3M NaCl，收集紫外A280吸收峰。用Sephadex G-25脫鹽后，得到純度＞95％，比活性＞6×105IU/mg的r-PA。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供了一種用PDI輔助變性r-PA折疊復(fù)性以制備r-PA的新型工藝方法。它與國外傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝相比具有以下特點(diǎn)①復(fù)性率高。②復(fù)性體系中r-PA蛋白濃度提高，復(fù)性體積減少，操作方便，節(jié)省試劑。③異構(gòu)體比例低，簡化了后續(xù)純化步驟。④提高r-PA產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本。上述優(yōu)勢使本發(fā)明具有明顯的技術(shù)創(chuàng)新性與工藝先進(jìn)性，成本降低，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)r-PA。
權(quán)利要求
1.用輔助復(fù)性方法制備組織型纖溶酶原激活劑39KD重組異構(gòu)體瑞替普酶(r-PA)。其特征在于在變性r-PA的復(fù)性體系中加入二硫鍵異構(gòu)酶，以提高r-PA的復(fù)性率。
2.組織型纖溶酶原激活劑39KD重組異構(gòu)體瑞替普酶(r-PA)的制備工藝，其特征在于經(jīng)過工程菌表達(dá)→菌體破碎→包含體分離→變性→PDI催化復(fù)性→脫鹽→親和層析→陽離子交換層析等步驟完成。
3.如權(quán)利要求2所述的瑞替普酶(r-PA)的變性，其特征在于用鹽酸胍作為變性劑，變性體系含6M鹽酸胍，20～100mM Tris，10～100mMDTT，PH7～10。
4.如權(quán)利要求2所述的PDI催化的瑞替普酶(r-PA)的復(fù)性，其特征在于復(fù)性體系采用50mM Tris，pH7～10，氧化型谷胱甘肽10～1mM，還原型谷胱甘肽1～0.1mM，r-PA蛋白濃度0.01～1mg/ml，加入的PDI為重組人PDI或其它來源的PDI，r-PA與PDI的摩爾比為100∶1～10∶1。
5.如權(quán)利要求2所述的陽離子交換層析，其特征在于采用CM-Sepharose陽離子交換柱，洗脫條件是0～1M NaCl，PH7～10，最佳洗脫濃度是0.2～0.3M NaCl。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用二硫鍵異構(gòu)酶PDI輔助變性的組織型纖溶酶原激活劑39KD重組異構(gòu)體瑞替普酶(r－PA)正確折疊并提高其復(fù)性率的新型方法。在優(yōu)化的r－PA復(fù)性體系中加入一定比例的PDI，可以使r－PA中錯(cuò)誤配對的二硫鍵打開并形成正確的二硫鍵，從而提高復(fù)性率，降低異構(gòu)體比例，簡化后續(xù)純化工藝，提高r－PA產(chǎn)率。
文檔編號C12N9/68GK1654643SQ200410023470
公開日2005年8月17日 申請日期2004年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月11日
發(fā)明者王革 申請人:王革