專(zhuān)利名稱(chēng)：一種分離純化皮膚表皮干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬人類(lèi)和哺乳動(dòng)物成體干細(xì)胞分離純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人類(lèi)和哺乳動(dòng)物皮膚表皮干細(xì)胞的分離純化、擴(kuò)增等方法。
背景技術(shù)：
表皮干細(xì)胞(Epidermal stem cells，ESCs)是具有自我增殖和多向分化潛能的干細(xì)胞，它的正常增殖和分化是維持皮膚及其附屬器(汗腺、毛發(fā)、皮脂腺)結(jié)構(gòu)和功能完整性的基本要求。在生理?xiàng)l件下，表皮干細(xì)胞通過(guò)不對(duì)稱(chēng)分裂方式分化為一個(gè)干細(xì)胞和一個(gè)短暫擴(kuò)充細(xì)胞(transitamplifying cellsTA細(xì)胞)，TA細(xì)胞再經(jīng)過(guò)多次分裂后分化為有絲分裂后細(xì)胞(Post-mitotic cells)及終末分化細(xì)胞(terminally-differentiatedcells)。以補(bǔ)充表皮細(xì)胞的不斷更新需要。研究表明表皮干細(xì)胞不僅能在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，并保持其增殖分化潛能(Dunnwald et al，Exp能[Liang et al，stem cells，20022021-31]。因此，獲得純化的表皮干細(xì)胞不僅可為構(gòu)建有生理功能的人工皮膚提供種子細(xì)胞，而且可用于基因治療和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)。然而，分離純化表皮干細(xì)胞至今仍是一個(gè)難題。國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍采用酶消化法，獲得含有表皮干細(xì)胞的混合細(xì)胞群。根據(jù)表皮干細(xì)胞對(duì)特異底物的粘附性[Jones.et al.cell.1993，73(4)713-724；Bickenbach et al，Exp cellRes.1998.224(1)184-185]，或用一些表皮干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志物或特殊染色劑對(duì)表皮干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選[Li et al，PNAS，1998，95(7)，3902-3907，Taniet al，PNAS，2000，97(20)10960-10965。Dunnwald et al，Exp Dermatol2001，1045-54]，由于還沒(méi)有找到一種能精確反映表皮干細(xì)胞的特異性分子標(biāo)記，上述分離方法很難將表皮干細(xì)胞與TA細(xì)胞完全分開(kāi)。探索一種有效安全的分離純化表皮干細(xì)胞的方法仍是我們面臨的一大難題[Alonso L and Fuchs E，www.PNAS.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1734203100]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，克服目前酶消化法獲得的是混合細(xì)胞群的缺點(diǎn)，根據(jù)表皮干細(xì)胞克隆性生長(zhǎng)的特性，提供一種采用組織塊培養(yǎng)法與克隆篩選法相結(jié)合，不借助任何化學(xué)試劑及復(fù)雜儀器而達(dá)到安全有效分離純化表皮干細(xì)胞的方法。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述目的采取的技術(shù)方案包括以下步驟1)首先取一塊皮膚，置于含青鏈霉素的生理鹽水中，用含青鏈霉素的PBS(一)沖洗，去血污及毛發(fā)；2)在解剖鏡下將皮膚與皮下組織分開(kāi)，將皮膚切成0.1～0.2×0.1～0.2cm2大小的小塊，按表皮面朝上貼于玻璃平皿(直徑為50mm)中，每皿3-4塊，加培養(yǎng)基；培養(yǎng)基的配方為Medium199(Gibco，LotNo.1129880)+15～20％NBS(新生牛血清，鄭州市佰安生物工程有限公司，Lot1120193)+5～8μg/ml insulin(胰島素，購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司，http//www.digguo.com，Sigma分裝，原產(chǎn)品編號(hào)為15500)+0.5μg/ml氫化可的松+青鏈霉素(青霉素購(gòu)自哈藥集團(tuán)制藥總廠(chǎng)，批號(hào)B01124412；硫酸連霉素購(gòu)自華北制藥股份有限公司，批號(hào)010724)100u/ml；3)置于CO2培養(yǎng)箱(WTB CO2培養(yǎng)箱，美國(guó))中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱內(nèi)的條件為5％CO2，飽和濕度，37℃；，每?jī)商鞊Q液一次。
4)經(jīng)3天～4天后，從組織塊邊緣長(zhǎng)出上皮樣細(xì)胞鋪路石樣生長(zhǎng)，7天～12天后，在上皮樣細(xì)胞層上有小圓形細(xì)胞聚集呈克隆樣生長(zhǎng)，待這些克隆直徑達(dá)100μm～150μm時(shí)，在解剖鏡下挑取這些克隆，用0.25％Trypsin(胰蛋白酶1∶250，華美生物工程公司)+0.02％EDTA(乙二胺四乙酸，Invitrogen，LOT1120193)進(jìn)行適當(dāng)處理，用玻璃針將這些細(xì)胞吸入鋪有明膠(Sigma，Lot50K02505)的3.5cm塑料皿(CELLSTAR Lot02030151)中，用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；無(wú)血清培養(yǎng)基的配方為F12(Initrogen CorporationLot1116568)+1～1.2％BSA(牛血清白蛋白Sigma，LOT 716H9310)+20～25％GSFCM(goat skin fibroblast conditional medium，GSFCM，山羊成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基)+20～25ng/ml EGF(表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，Sigma，E-mailtechserv@sial.com，Product Number E 9644)+5ug/mlinsulin(胰島素)+15～20ng/ml IGF-1胰島素類(lèi)生長(zhǎng)因子-1，SigmaE-mailtechserv@sial.com，product Number I3769)+0.4～0.6μg/ml氫化可的松+青鏈霉素100u/ml；5)待細(xì)胞增殖達(dá)75％0.5μg/ml融合時(shí)，用0.25％Trypsin(胰蛋白酶1∶250，華美生物工程公司)+0.02％EDTA(乙二胺四乙酸，Invitrogen，LOT1120193)進(jìn)行消化，傳代培養(yǎng)。本發(fā)明用無(wú)血清培養(yǎng)基將關(guān)中奶山羊表皮干細(xì)胞傳25代凍存；6)對(duì)所獲得細(xì)胞進(jìn)行當(dāng)前同行公認(rèn)的表皮干細(xì)胞分子標(biāo)志的檢測(cè)CK19(角蛋白19，Sigma，sigma-aldrich.com，Product Number C 6930)，integrin-β1(整合素-β1Product Number I 8638)，p63(Santa CruzBiotechnology，Inc.4A4sc-8431)，integrin-α6(整合素-α6Sigma，CD49f，VLA-6a，Product Number I6653)均為陽(yáng)性，證明所分選的是純化的表皮干細(xì)胞。
本發(fā)明在皮膚組織塊培養(yǎng)過(guò)程中采用自行設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基能有效抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，從組織塊四周生長(zhǎng)出均一的上皮樣細(xì)胞，誘發(fā)表皮干細(xì)胞遷移出原來(lái)的微環(huán)境，在新生成的上皮樣細(xì)胞層上重新聚集生長(zhǎng)。這類(lèi)克隆性生長(zhǎng)的細(xì)胞與其依賴(lài)的飼養(yǎng)層細(xì)胞有明顯形態(tài)學(xué)上的差別。借助解剖鏡和玻璃針就能將其挑選出來(lái)，進(jìn)行單獨(dú)擴(kuò)增培養(yǎng)，達(dá)到純化表皮干細(xì)胞的目的。
本發(fā)明克服了傳統(tǒng)酶消化法的缺點(diǎn)，直接利用干細(xì)胞的生物學(xué)行為獲得純化的表皮干細(xì)胞，是一種有效安全的分離純化表皮干細(xì)胞的方法，可用于人類(lèi)和哺乳動(dòng)物表皮干細(xì)胞的分離純化。


圖1是組織塊培養(yǎng)獲得關(guān)中奶山羊原代表皮干細(xì)胞克隆，X200；圖2是第二代關(guān)中奶山羊表皮干細(xì)胞integrin-α6陽(yáng)性，x100；圖3是第二代關(guān)中奶山羊表皮干細(xì)胞β1-integrin陽(yáng)性，X200；圖4是第二代關(guān)中奶山羊表皮干細(xì)胞CK-19陽(yáng)性，X100；圖5是第二代關(guān)中奶山羊表皮干細(xì)胞P63陽(yáng)性X400。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合發(fā)明人給出的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
實(shí)施例1關(guān)中奶山羊表皮干細(xì)胞的分離純化擴(kuò)增參見(jiàn)附圖，圖1是采用本發(fā)明的方法中組織塊培養(yǎng)獲得關(guān)中奶山羊原代表皮干細(xì)胞克隆，X200；圖2是原代關(guān)中奶山羊表皮干細(xì)胞integrin-α6陽(yáng)性，X100；圖3是第一代關(guān)中奶山羊表皮干細(xì)胞β1-integrin陽(yáng)性，X200；圖4是第二代關(guān)中奶山羊表皮干細(xì)胞CK-19陽(yáng)性，X100；圖5是第二代關(guān)中奶山羊表皮干細(xì)胞p63陽(yáng)性X400。
在關(guān)中奶山羊(2.5-3.5歲母羊)耳中部血管相對(duì)較少處，刮毛消毒，用耳號(hào)鉗剪下一塊大小約0.5×0.5cm2的皮膚，置于含青鏈霉素(1000/ml)的生理鹽水中帶回?zé)o菌間，用含青鏈霉素的PBS(一)沖洗數(shù)遍，去血污及毛發(fā)。在解剖鏡下將皮膚與軟骨分開(kāi)，將皮膚切成0.2×0.2cm2大小的小塊，按表皮面朝上貼于玻璃平皿(φ＝5.5cm)中，每皿3-4塊，加適宜量培養(yǎng)基(Medium199+15～20％NBS+5～8μg/ml insulin+0.5μg/ml氫化可的松+青鏈霉素100u/ml)，置于CO2培養(yǎng)箱(5％CO2，飽和濕度，37℃)中培養(yǎng)，每?jī)商鞊Q液一次。3-4天后，從組織塊邊緣長(zhǎng)出上皮樣細(xì)胞鋪路石樣生長(zhǎng)，7-12天后，在上皮樣細(xì)胞層上有小圓形細(xì)胞聚集呈克隆樣生長(zhǎng)(圖1)，待這些克隆直徑達(dá)100-150μm時(shí)，在解剖鏡下挑取這些克隆，用0.20％ Trypsin和0.02％EDTA適當(dāng)處理，用玻璃針(自制)將這些細(xì)胞吸入鋪有明膠的3.5cm塑料皿中，用自行設(shè)計(jì)的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。
無(wú)血清培養(yǎng)基的配方為F12+1～1.2％BSA(牛血清白蛋白)+20～25％GSFCM+20～25ng/ml EGF+5ug/ml insulin+15～20ng/ml IGF-1+0.4～0.6μg/ml氫化可的松+青鏈霉素100u/ml；待細(xì)胞增殖達(dá)75％融合時(shí)，用0.25％Trypsin+0.02％EDTA進(jìn)行消化，傳代培養(yǎng)。
本發(fā)明用無(wú)血清培養(yǎng)基將關(guān)中奶山羊表皮干細(xì)胞傳25代凍存。干細(xì)胞鑒定采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)β1-integrin(整合素β1)，CK-19(角蛋白19)，p63，integrin-α6，具體操作按北京中山生物試劑有限公司免疫組化染色試劑盒(SP-9000/9001/9002)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；結(jié)果表明本發(fā)明所得到的干細(xì)胞β1-integrin，CK-19，p63，integrin-α6均為陽(yáng)性(圖2-5)。
實(shí)施例2人類(lèi)表皮干細(xì)胞的分離純化擴(kuò)增取醫(yī)院包皮環(huán)切術(shù)后廢棄的一塊大小約0.5×0.5cm2的皮膚，置于含青鏈霉素(1000μ/ml)的生理鹽水中帶回?zé)o菌間，用含青鏈霉素的PBS(一)沖洗數(shù)遍，去血污。在解剖鏡下將皮膚與皮下組織分開(kāi)，將皮膚切成0.1～0.2×0.1～0.2cm2大小的小塊，按表皮面朝上貼于玻璃平皿(φ＝5.0cm)中，每皿3-4塊，加適宜量培養(yǎng)基(Medium199+15～20％NBS+5～8μg/ml insulin+0.5μg/ml氫化可的松+青鏈霉素100u/ml)，置于CO2培養(yǎng)箱(5％CO2，飽和濕度，37℃)中培養(yǎng)，每?jī)商鞊Q液一次。3-4天后，從組織塊邊緣長(zhǎng)出上皮樣細(xì)胞鋪路石樣生長(zhǎng)，7-12天后，在上皮樣細(xì)胞層上有小圓形細(xì)胞聚集呈克隆樣生長(zhǎng)，待這些克隆直徑達(dá)100-150μm時(shí)，在解剖鏡下挑取這些克隆，用0.20％Trypsin適當(dāng)處理，用玻璃針(自制)將這些細(xì)胞吸入鋪有明膠的3.5cm塑料皿中，用自行設(shè)計(jì)的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，無(wú)血清培養(yǎng)基的配方為F12+1～1.2％BSA(牛血清白蛋白)+20～25％GSFCM+20～25ng/ml EGF+5ug/ml insulin+15～20ng/ml IGF-1+0.4～0.6μg/ml 氫化可的松+青鏈霉素100u/ml；待細(xì)胞增殖達(dá)75％融合時(shí)，用0.25％Trypsin+0.02％EDTA進(jìn)行消化，傳代培養(yǎng)，用無(wú)血清培養(yǎng)基將成人包皮來(lái)源的表皮干細(xì)胞傳5代凍存，干細(xì)胞鑒定采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)β1-integrin(整合素β1)，CK-19(角蛋白19)，p63，ntegrin-α6具體操作按北京中山生物試劑有限公司免疫組化染色試劑盒(SP-9000/9001/9002)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，結(jié)果表明本發(fā)明所得到的人類(lèi)表皮干細(xì)胞β1-integrin，CK-19，p63，integrin-α6均為陽(yáng)性。
權(quán)利要求
1.一種分離純化皮膚表皮干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟1)首先取一塊皮膚，置于含青鏈霉素的生理鹽水中，用含青鏈霉素的PBS(一)沖洗，去血污及毛發(fā)；2)在解剖鏡下將皮膚與皮下組織分開(kāi)，將皮膚切成0.1～0.2×0.1～0.2cm2大小的小塊，按表皮面朝上貼于玻璃平皿中，每皿3-4塊，加培養(yǎng)基；培養(yǎng)基的配方為Medium199+15～20％NBS即新生牛血清+5～8μg/mlinsulin(胰島素)+0.5μg/ml氫化可的松+青鏈霉素100u/ml；3)置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱內(nèi)的條件為5％CO2，飽和濕度，37℃，每?jī)商鞊Q液一次；4)經(jīng)3天-4天后，從組織塊邊緣長(zhǎng)出上皮樣細(xì)胞鋪路石樣生長(zhǎng)，7天-12天后，在上皮樣細(xì)胞層上有小圓形細(xì)胞聚集呈克隆樣生長(zhǎng)，待這些克隆直徑達(dá)100-150μm時(shí)，在解剖鏡下挑取這些克隆，用0.20％Trypsin即胰蛋白酶和0.02％EDTA適當(dāng)處理，用玻璃針將這些細(xì)胞吸入鋪有明膠的3.5cm塑料皿中，用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；無(wú)血清培養(yǎng)基的配方為F12+1～1.2％BSA(牛血清白蛋白)+20～25％GSFCM+20～25ng/mlEGF+5ug/mlinsulin+20ng/mlIGF-1+0.4～0.6ug/ml氫化可的松+青鏈霉素100u/ml。5)待細(xì)胞增殖達(dá)75％融合時(shí)，用0.25％Trypsin+0.02％EDTA進(jìn)行消化，傳代培養(yǎng)，用無(wú)血清培養(yǎng)基將關(guān)中奶山羊表皮干細(xì)胞傳25代凍存，將人類(lèi)表皮干細(xì)胞傳5代凍存；6)對(duì)所獲得細(xì)胞進(jìn)行當(dāng)前同行公認(rèn)的表皮干細(xì)胞分子標(biāo)志的檢測(cè)CK19，integrin-β1P63，integrin-α6均為陽(yáng)性，即證明所分選的是純化的表皮干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種分離純化皮膚表皮干細(xì)胞的方法，在皮膚組織塊培養(yǎng)過(guò)程中采用自行設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基能有效抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，從組織塊四周生長(zhǎng)出均一的上皮樣細(xì)胞，誘發(fā)表皮干細(xì)胞遷移出原來(lái)的微環(huán)境，在新生成的上皮樣細(xì)胞層上重新聚集生長(zhǎng)。這類(lèi)克隆性生長(zhǎng)的細(xì)胞與其依賴(lài)的滋養(yǎng)層細(xì)胞有明顯形態(tài)學(xué)上的差別。借助解剖鏡和玻璃針就能將其挑選出來(lái)，進(jìn)行單獨(dú)擴(kuò)增培養(yǎng)。對(duì)所獲得細(xì)胞進(jìn)行當(dāng)前同行公認(rèn)的表皮干細(xì)胞分子標(biāo)志的檢測(cè)CK19，integrin－β
文檔編號(hào)C12N5/06GK1563365SQ200410025939
公開(kāi)日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月12日
發(fā)明者楊學(xué)義, 竇忠英 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)