專(zhuān)利名稱(chēng)：重組米曲霉單寧酶及其表達(dá)和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組米曲霉單寧酶及其在甲醇酵母中的分泌表達(dá)、純化。本發(fā)明還涉及重組米曲霉單寧酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
單寧(tannin)又稱(chēng)鞣酸，在高等植物中廣泛分布，包括單子葉植物、雙子葉植物以及蕨類(lèi)植物中。Howes列舉了世界含單寧植物共87科600多種。單寧廣泛存在于食品和飼料中，是食品尤其是飼料中的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子之一。單寧的抗?fàn)I養(yǎng)作用主要有三個(gè)方面(1)單寧和唾液蛋白、糖蛋白在口腔中相互作用，使組織產(chǎn)生收斂性，引起一系列的不適口反應(yīng)。飼料中單寧可導(dǎo)致動(dòng)物減少對(duì)飼料的采食量。當(dāng)牧草中單寧含量超過(guò)20mg/g干物質(zhì)時(shí)，家禽拒食。(2)單寧分子中存在大量酚羥基團(tuán)和芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，可與蛋白質(zhì)形成絡(luò)合物，使蛋白質(zhì)凝結(jié)沉淀，影響蛋白質(zhì)的消化和吸收。單寧與蛋白質(zhì)復(fù)合物(Tannin Protein Complex)在哺乳動(dòng)物腸道中，難以被蛋白酶等分解。豆科牧草單寧含量過(guò)高則其飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低。(3)單寧能降低哺乳動(dòng)物腸道消化酶的活性，并對(duì)胃腸黏膜產(chǎn)生不良影響。單寧與消化酶構(gòu)成復(fù)合物，干擾酶生物活性。體外實(shí)驗(yàn)表明飼料中含有單寧浸提物(蠶豆殼等)降低了胰蛋白酶、糜蛋白酶、α-淀粉酶活性。單寧酸或氯化單寧酸導(dǎo)致鼠胃和十二指腸黏膜發(fā)生變化，引起胃黏液過(guò)度分泌，胃黏膜壞死，膽囊萎縮，小腸上皮細(xì)胞氧耗下降等不良反應(yīng)。另外，單寧對(duì)反芻動(dòng)物的毒性很大，牛羊采食含單寧的櫟樹(shù)和一些熱帶豆科樹(shù)子實(shí)和莖葉時(shí)會(huì)發(fā)生急性中毒。在水溶液清涼茶飲料的生產(chǎn)中，茶中富含的單寧引起茶乳沉淀。單寧與啤酒和果汁中的蛋白質(zhì)生成沉淀，會(huì)引起產(chǎn)品混濁。在食品、飲料、禽畜飼料的生產(chǎn)中必須去除不必要的單寧成分[9]。用單寧酶降解多余的單寧，是一種有廣泛應(yīng)用前景的工藝。
單寧是大多數(shù)微生物的拮抗物，對(duì)微生物有毒害作用，但一些微生物對(duì)單寧有抗性。這些微生物通過(guò)各種機(jī)制和方法降解單寧。1913年，Knudson分離到黑曲霉(Aspergillusniger)及青霉(Penicillumsp.)具有降解單寧酸的作用，首次對(duì)單寧發(fā)酵降解進(jìn)行研究。近十年來(lái)，許多腸道細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)具有降解單寧的能力。Osawa從樹(shù)獺的糞便和盲腸中先后分離到降解單寧-蛋白質(zhì)復(fù)合物的牛鏈球菌和腸桿菌。Nenuetr等人報(bào)告在馬腸道分離出降解單寧的細(xì)菌。1994年Makkai發(fā)現(xiàn)毛孢屬真菌(Sportrichum Preluerulentum)能有效降解櫟樹(shù)中的縮合單寧。白腐霉(Ceriporiopsis subvermispora)能對(duì)樹(shù)葉中富含的縮合單寧進(jìn)行化學(xué)修飾，從而提高樹(shù)葉的消化性三倍。單寧?；饷?EC3.1.1.20)通常稱(chēng)為單寧酶(Tannase).單寧酶水解單寧的酯鍵，產(chǎn)生沒(méi)食子酸和葡萄糖。單寧酶是單寧生物降解的關(guān)鍵酶。單寧酶的進(jìn)展性研究始于六十年代。先后從米曲霉和黑曲霉，念珠菌中分離純化到單寧酶。也從某些細(xì)菌培養(yǎng)液中分離單寧酶。Adachi對(duì)米曲霉單寧酶的理化性質(zhì)研究，證明單寧酶是典型的絲氨酸酯酶，與1994年Barthomeuf等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
單寧酶在工業(yè)生產(chǎn)中用途廣泛，日益受到人們的關(guān)注。在水溶性清涼茶飲料的生產(chǎn)中，單寧酶用于降解茶中富含的單寧，以避免單寧引起生成茶乳。單寧與啤酒和果汁中的蛋白質(zhì)生成沉淀，引起混濁，單寧酶可作為澄清劑應(yīng)用于此類(lèi)飲料的生產(chǎn)中。飼料加工中，添加單寧酶可減少單寧的不良影響，提高飼料的利用率。在利用單寧沉淀蛋白質(zhì)的特性純化蛋白質(zhì)時(shí)，單寧酶可用來(lái)除去沉淀物中的單寧。另外，單寧酶還用于生產(chǎn)沒(méi)食子酸和沒(méi)食子酸酯。沒(méi)食子酸是一種用途廣泛精細(xì)化工原料，醫(yī)藥上用于制甲氯芐嘧啶(為磺胺增效劑)，聯(lián)苯雙酯(治肝病)，克冠草(治冠心病)等藥物。沒(méi)食子酸丙酯、沒(méi)食子酸甘油脂等用作食品的抗氧劑及防腐劑。沒(méi)食子酸還用于合成染料、化學(xué)分析用試劑等用途。
單寧酶一直以來(lái)都從產(chǎn)單寧酶菌株發(fā)酵液中提取。1997年Lane等從米曲霉中制備了單寧酶制劑。但是產(chǎn)酶量相對(duì)少，又難以提純，所以從產(chǎn)單寧酶菌株發(fā)酵液提取單寧酶成本高、效率低，難以推廣應(yīng)用。Hatameto于1996年克隆出米曲霉的單寧酶基因。將帶有單寧酶基因的質(zhì)粒PT1轉(zhuǎn)化單寧酶產(chǎn)量低的菌株Aspergillus orygze Aol，提高宿主菌的單寧酶的產(chǎn)量。這為利用高效表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組單寧酶打下了基礎(chǔ)。
作為新一代酵母表達(dá)系統(tǒng)，甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)與現(xiàn)有主要的重組蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)相比擁有多方面的優(yōu)勢(shì)。作為真核生物，甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)擁有真核表達(dá)系統(tǒng)如釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，具有真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后加工功能，有適于真核生物基因表達(dá)產(chǎn)物正確折疊的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和糖鏈加工系統(tǒng)，還能分泌外源蛋白質(zhì)到培養(yǎng)基中利于純化。這是大腸桿菌(E.coli)等原核表達(dá)系統(tǒng)所沒(méi)有的。與動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比，甲醇酵母系統(tǒng)具有繁殖快速、培養(yǎng)容易、成本低的特點(diǎn)，同時(shí)還容易進(jìn)行分子遺傳操作。甲醇酵母比釀酒酵母擁有優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)在重組株傳代穩(wěn)定、表達(dá)水平高及生產(chǎn)規(guī)模容易工業(yè)放大等。甲醇酵母系統(tǒng)外源蛋白表達(dá)水平比釀酒酵母系統(tǒng)高10-100倍。這是因?yàn)榧状冀湍笓碛蠥OX啟動(dòng)子。AOX啟動(dòng)子是目前已研究過(guò)的啟動(dòng)子中最強(qiáng)的調(diào)控性真核啟動(dòng)子之一，因而由AOX啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的外源基因表達(dá)具有非常大的高效表達(dá)能力。自1987年Gzegy等首次在畢赤酵母(P.pastoris)中表達(dá)乙型肝炎表面抗原(HbsAg)以來(lái)，短短幾年時(shí)間，至少有40種外源蛋白在P.pastoris中獲得表達(dá)。1997年Waterham等分離克隆了畢赤酵母中3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAP)啟動(dòng)子，它是一個(gè)組成型高效啟動(dòng)子。GAP啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)外源基因在細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中高效表達(dá)，不需進(jìn)行誘導(dǎo)。由于GAP啟動(dòng)子的高效性以及操作上更為方便，因此它具有巨大的應(yīng)用潛力，是AOX啟動(dòng)子的有效替代者。另外P.pastoris分泌表達(dá)有一個(gè)非常好的優(yōu)點(diǎn)就是P.pastoris自身分泌蛋白質(zhì)水平很低。這意味著在P.pastoris基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，在培養(yǎng)中的大部分蛋白為目標(biāo)蛋白質(zhì)，這有利目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化。在分泌蛋白的糖基化修飾上，畢赤酵母不會(huì)象釀酒酵母的超糖基化，這是畢赤酵母的另一優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種新的米曲霉單寧酶及其編碼基因；本發(fā)明還提供了上述新基因的表達(dá)以及表達(dá)產(chǎn)物的純化方法和應(yīng)用。
本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)了一對(duì)特異引物，將編碼米曲霉單寧酶成熟蛋白(其編碼的成熟肽序列如序列表中<400>2序列所示)的核苷酸序列(如序列表中<400>1序列所示)用PCR方法從米曲霉基因中擴(kuò)增出來(lái)，克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K(購(gòu)自Invitrogen公司)，構(gòu)建表達(dá)載體載體pPIC9K-TAN，采用電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71(購(gòu)自Invitrogen公司)獲得重組菌株。宿主菌類(lèi)型，搖瓶培養(yǎng)條件，發(fā)酵培養(yǎng)條件等摸索和優(yōu)化，重組蛋白的表達(dá)量達(dá)到200mg/L。
本發(fā)明還將單寧酶基因克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZαA(購(gòu)自Invitrogen公司)中，并通過(guò)PCR的方法對(duì)基因的表達(dá)框架進(jìn)行了改造，構(gòu)建了組成型表達(dá)載體pGAPZαA-TAN及pGAPZαA-ETAN。采用電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株KM71H(購(gòu)自Invitrogen公司)獲得重組菌株，并在搖瓶培養(yǎng)條件下以分泌形式表達(dá)。
本發(fā)明還摸索和優(yōu)化了重組單寧酶蛋白的純化條件，表達(dá)產(chǎn)物采用DEAE Sepharose(購(gòu)自Amersham Biosciences公司)陰離子交換層析一步純化，可得到純度達(dá)95％以上的重組單寧酶蛋白。
本發(fā)明獲得的重組單寧酶具有生物活性。
本發(fā)明構(gòu)建了含有米曲霉單寧酶蛋白成熟肽編碼序列的表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k-TAN(構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖13)以及含有表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA-TAN及pGAPZαA-ETAN(構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖14)本發(fā)明構(gòu)建了米曲霉單寧酶成熟蛋白編碼序列的表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-TAN，由該表達(dá)質(zhì)粒載體經(jīng)EcoRI/NotI雙酶切，可得到1.7kbp的片段，即為米曲霉單寧酶成熟肽編碼序列。表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA-TAN及pGAPZαA-ETAN中單寧酶基因通過(guò)XhoI和NotI克隆，由于單寧酶成熟蛋白編碼序列中1405bp處含有一個(gè)XhoI酶切位點(diǎn)，表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)XhoI/NotI雙酶切可得到約300bp和1.4kb的兩個(gè)片段。
本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒載體的復(fù)制方法參照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecularcloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α菌株中轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化了pPIC9K-TAN的細(xì)菌用含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化了pGAPZαA-TAN及pGAPZαA-ETAN的細(xì)菌用含有25μg/ml的低鹽LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，堿法提取質(zhì)粒。


圖1為從米曲霉基因中PCR擴(kuò)增的單寧酶基因電泳結(jié)果。1PCR擴(kuò)增的單寧酶基因；2陰性對(duì)照；M1kb DNA marker。
圖2為單寧酶甲醇酵母表達(dá)載體載體pPIC9k-TAN的酶切鑒定電泳結(jié)果。1pPIC9k-TAN(EcoRI+NotI)；2pPIC9k(EcoRI+NotI)；M11kb DNA marker。
圖3為整合了載體pPIC9k-TAN的重組甲醇酵母菌株P(guān)CR鑒定電泳結(jié)果。1陽(yáng)性克??；2陰性對(duì)照；M11kb DNA marker。
圖4為重組單寧酶通過(guò)表達(dá)載體pPIC9k-TAN，用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳結(jié)果。1誘導(dǎo)前發(fā)酵上清液；2～5經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后1～4天的發(fā)酵上清液；6蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖5為重組單寧酶的純化結(jié)果SDS-PAGE電泳分析。1發(fā)酵上清液；2DEAE陰離子交換純化的單寧酶(非還原)；3純化的單寧酶去糖基化(非還原)；4蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；5DEAE陰離子交換純化的單寧酶(還原)；6純化的單寧酶去糖基化(還原)。
圖6為重組單寧酶的最適反應(yīng)溫度曲線(xiàn)。
圖7為重組單寧酶的熱穩(wěn)定性曲線(xiàn)。
圖8為重組單寧酶的最適反應(yīng)pH曲線(xiàn)。
圖9為重組單寧酶的酸堿穩(wěn)定性曲線(xiàn)。
圖10為重組單寧酶通過(guò)表達(dá)載體pGAPZαA-TAN進(jìn)行表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液SDS-PAGE電泳結(jié)果。1蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2～9培養(yǎng)2～9天的培養(yǎng)物上清液。
圖11為轉(zhuǎn)化了表達(dá)載體pGAPZαA-TAN及pGAPZαA-ETAN的畢赤酵母菌株KM71H的單寧平板篩選結(jié)果。A轉(zhuǎn)化了pGAPZαA-TAN的畢赤酵母菌株KM71H；B轉(zhuǎn)化了pGAPZαA-ETAN的畢赤酵母菌株KM71H。
圖12為表達(dá)載體pGAPZαA-TAN及pGAPZαA-ETAN中單寧酶的表達(dá)框架示意圖。A表達(dá)載體pGAPZαA-TAN中單寧酶基因的表達(dá)框架；B表達(dá)載體pGAPZαA-ETAN中單寧酶基因的表達(dá)框架。
圖13為單寧酶甲醇酵母表達(dá)載體載體pPIC9k-TAN的構(gòu)建示意圖。
圖14為表達(dá)載體pGAPZαA-TAN及pGAPZαA-ETAN構(gòu)建示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實(shí)施例一、米曲霉單寧酶基因的PCR擴(kuò)增米曲霉基因組的提取參考《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》的實(shí)驗(yàn)方案，根據(jù)單寧酶基因編碼的成熟蛋白兩端序列和畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K(購(gòu)自Invitrogen公司)的多酶切位點(diǎn)，合成一對(duì)引物，序列如下上游引物，5’GGAATTCGCTTCTTTTACCGATGTGTGCAC3’(單下劃線(xiàn)部分為EcoRI酶切序列)；下游引物，5’GCGGCGGCCGCTTAGTATACAGGGACCTTGAAGGC3’(單下劃線(xiàn)部分為NotI酶切序列，雙下劃線(xiàn)為終止密碼子)。
PCR擴(kuò)增、基因克隆皆按常規(guī)方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物約1700bp，如圖1，編碼570個(gè)氨基酸殘基。
實(shí)施例二、單寧酶甲醇酵母表達(dá)載體pPIC9k-TAN的構(gòu)建PCR擴(kuò)增的米曲霉單寧酶基因用EcoRI和NotI雙酶切克隆到甲醇酵母表達(dá)載體pPIC9K相應(yīng)的酶切窗口，獲得表達(dá)載體pPIC9K-TAN，構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖13，經(jīng)酶切鑒定(圖2)和測(cè)序分析表明克隆的基因?yàn)槟康幕颉?br> 實(shí)施例三、酵母菌株的轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆的篩選表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-TAN用PmeI單切線(xiàn)性化，采用電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71(購(gòu)自Invitrogen公司)，同時(shí)轉(zhuǎn)化同樣線(xiàn)性化的空載體pPIC9K作為對(duì)照。在MD固體培養(yǎng)平板篩選陽(yáng)性克隆，并用含G418抗性的YPD平板進(jìn)一步篩選陽(yáng)性克隆。轉(zhuǎn)化子通過(guò)PCR的方法進(jìn)一步進(jìn)行了鑒定，PCR引物為α-factor sequencing primer(5’-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’)和3’AOX1 sequencing primer(5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’)，采用Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，以提取的陽(yáng)性克隆基因組為模板，反應(yīng)循環(huán)條件為，94℃5分鐘，94℃45秒，52℃30秒，72℃2分鐘，32個(gè)循環(huán)，72℃10分鐘，4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示圖3，PCR擴(kuò)增得到一特異性約1.8kb DNA條帶，與預(yù)期的大小相符。
實(shí)施例四、重組米曲霉單寧酶的高密度發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)從YPD平板上選取單克隆，接種于20ml BMGY培養(yǎng)基中，30℃、240rpm培養(yǎng)20h。以1∶50的比例接種到300ml BMGY培養(yǎng)基中，30℃、240rpm培養(yǎng)至OD600＝2～6，用以接種發(fā)酵罐。
7L發(fā)酵罐，加入3L發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，121℃滅菌20min，調(diào)節(jié)溫度至30℃，用氨水調(diào)節(jié)pH至5.5，加入PTM1(4.35ml L-1)，接入種子菌(1∶10)。發(fā)酵過(guò)程中，溫度控制在30℃，通氣量維持在2vvm，轉(zhuǎn)速控制在300～800rpm之間以維持溶氧20％以上。
發(fā)酵分為三個(gè)階段生長(zhǎng)期，從加入種子菌，培養(yǎng)約16～24h，直到將發(fā)酵罐中甘油耗盡，表現(xiàn)為溶氧突然上升；之后進(jìn)入甘油促生長(zhǎng)期，補(bǔ)加50％甘油(含有PTM1，12ml L-1)，補(bǔ)料速度為18ml L-1h-1，持續(xù)4～6h；最后進(jìn)入誘導(dǎo)期，用氨水調(diào)節(jié)pH至5.0，流加100％甲醇(含有PTM1，12ml L-1)，流速?gòu)?ml L-1h-1經(jīng)10h線(xiàn)性升至3ml L-1h-1，持續(xù)120h。發(fā)酵上清用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)，如圖4。
實(shí)施例五、重組米曲霉單寧酶的純化發(fā)酵液于4℃ 8000rpm離心30min，上清經(jīng)Sephendex G-25脫鹽，更換為10mmol/L檸檬酸pH5.5緩沖液，再經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析柱純化，洗脫體系為10mmol/L檸檬酸pH5.5緩沖液，NaCl線(xiàn)性梯度(0～0.5mol/L)，pH5.5。洗脫樣品用SDS-PAGE進(jìn)行分析鑒定(圖5)。合并目的蛋白組分，雙蒸水透析，透析后樣品冷凍干燥，-20℃保存。
實(shí)施例六、重組米曲霉單寧酶的活性鑒定重組米曲霉單寧酶的活性鑒定參考Beverini(1990)的方法。1IU的酶活定義1分鐘水解1μmol單寧酸所需的酶量。酶活檢測(cè)我們制備的重組米曲霉單寧酶酶活達(dá)到50,000IU/g。
實(shí)施例七、重組米曲霉單寧酶最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定在不同溫度(10℃～70℃)，測(cè)定酶活性。測(cè)定熱穩(wěn)定性時(shí)，則將酶液于不同溫度下保溫10分鐘后，測(cè)定其殘余的酶活性。測(cè)得重組單寧酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，熱穩(wěn)定性范圍為10～40℃(圖6，圖7)。
實(shí)施例八、重組米曲霉單寧酶最適反應(yīng)pH及酸堿穩(wěn)定性測(cè)定配制不同pH值的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH2.2～8.0)，0.5個(gè)pH單位為梯度。測(cè)定最適反應(yīng)pH值時(shí)，將單寧酶溶解于去離子水中，用不同pH值的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液稀釋5倍；然后測(cè)定酶活。測(cè)定酸堿穩(wěn)定性時(shí)，則將單寧酶溶解于不同pH值的緩沖液中，在30℃保溫一小時(shí)后加入20倍體積的pH5.5的50mM檸檬酸緩沖液，然后測(cè)定酶活。測(cè)定結(jié)果，重組單寧酶的最適反應(yīng)pH值為pH6.0，酸堿穩(wěn)定性范圍為pH4～6(圖8，圖9)。
實(shí)施例九、重組單寧酶畢赤酵母組成型表達(dá)載體pGAPZαA-TAN及pGAPZαA-ETAN的構(gòu)建根據(jù)表達(dá)載體pGAPZαA(購(gòu)自Invitrogen公司)的部分信號(hào)肽序列及單寧酶編碼序列設(shè)計(jì)合成引物上游引物(1)5’CCGCTCGAGAAAAGA GCTTCTTTTACCGATGTGTGCAC3’(單下劃線(xiàn)部分為載體信號(hào)肽序列中的XhoI酶切位點(diǎn))，(2)5’CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCTTCTTTTACCGATGTGTGCAC3’(單下劃線(xiàn)部分為載體信號(hào)肽序列中的XhoI酶切位點(diǎn)，雙下劃線(xiàn)部分為載體信號(hào)肽序列末端的Ste13蛋白酶切割序列)；下游引物5’TCGCTGGACTGGCCATAAAAGC3’(下游引物為單寧酶編碼序列中約480bp處的一段序列)。
以pPIC9K-TAN為模板，分別用兩組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的片段大小約為500bp，用XhoI和SphI雙酶切后切成兩個(gè)片段，回收其中約100bp的片段；將質(zhì)粒pPIC9K-TAN用SphI和NotI雙酶切，回收大小為1.4kb的單寧酶基因片段；將這兩個(gè)片段連接到表達(dá)載體pGAPZαA相應(yīng)的XhoI/NotI酶切窗口中，構(gòu)建成表達(dá)載體pGAPZαA-TAN及pGAPZαA-ETAN，構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖14；表達(dá)載體中單寧酶基因的表達(dá)框架如圖12，在pGAPZαA-TAN中單寧酶直接連接于載體信號(hào)肽末端，在pGAPZαA-ETAN中單寧酶基因連接于畢赤酵母蛋白Ste13蛋白酶切割位點(diǎn)末端，即在信號(hào)肽序列及單寧酶之間含有4個(gè)氨基酸殘基EAEA；經(jīng)酶切和DNA測(cè)序鑒定載體構(gòu)建成功。
實(shí)施例十、畢赤酵母菌株的轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性克隆的篩選表達(dá)載體pGAPZαA-TAN及pGAPZαA-ETAN分別用AvrII進(jìn)行線(xiàn)性化，采用電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71H，同時(shí)轉(zhuǎn)化同樣線(xiàn)性化的空載體pGAPZαA作為對(duì)照。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞用zeocine抗性平板篩選出抗性克隆，再用含0.2％單寧酸的YNB+0.5％葡萄糖平板篩選出單寧酶活性菌株。其中具有單寧酶活性的重組菌株能夠在菌落周?chē)纬梢粋€(gè)透明的單寧降解圈(圖11)。
實(shí)施例十一、重組單寧酶通過(guò)表達(dá)載體pGAPZαA-TAN進(jìn)行組成型表達(dá)從YPD平板上挑取單菌落，接種至50mlYPD培養(yǎng)基，30℃、240rpm培養(yǎng)，每隔24小時(shí)添加終濃度為0.5％的葡萄糖溶液，并取培養(yǎng)上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，在分子量約100kDa處有一特征蛋白條帶，即為重組單寧酶產(chǎn)物(圖10)。
序列表<110>中山大學(xué)<120>重組米曲霉單寧酶及其表達(dá)和純化方法<160>2<210>1<211>1710<212>DNA<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)<220>
<221>mat peptide<222>(1)…(570)<400>1gct tct ttt acc gat gtg tgc acc gtg tct aac gtg aag gct gca ttg 48Ala Ser Phe Thr Asp Val Cys Thr Val Ser Asn Val Lys Ala Ala Leu1 5 10 15cct gcc aac gga act ctg ctc gga atc agc atg ctt ccg tcc gcc gtc 96Pro Ala Asn Gly Thr Leu Leu Gly Ile Ser Met Leu Pro Ser Ala Val20 25 30acg gcc aac cct ctc tac aac cag tcg gct ggc atg ggt agc acc act 114Thr Ala Asn Pro Leu Tyr Asn Gln Ser Ala Gly Met Gly Ser Thr Thr35 40 45acc tat gac tac tgc aat gtg act gtc gcc tac acg cat acc ggc aag 192Thr Tyr Asp Tyr Cys Asn Val Thr Val Ala Tyr Thr His Thr Gly Lys50 55 60ggt gat aaa gtg gtc atc aag tac gca ttc ccc aag ccc tcc gac tac 240Gly Asp Lys Val Val Ile Lys Tyr Ala Phe Pro Lys Pro Ser Asp Tyr65 70 75 80gag aac cgt ttc tac gtt gct ggt ggt ggt ggc ttt tcc ctc tct agc 288Glu Asn Arg Phe Tyr Val Ala Gly Gly Gly Gly Phe Ser Leu Ser Ser85 90 95gat gct acc gga ggt ctc gcc tat ggc gct gtg gga ggt gcc acc gat 336Asp Ala Thr Gly Gly Leu Ala Tyr Gly Ala Val Gly Gly Ala Thr Asp100 105 110gct gga tac gac gca ttc gat aac agc tac gac gag gta gtc ctc tac 384Ala Gly Tyr Asp Ala Phe Asp Asn Ser Tyr Asp Glu Val Val Leu Tyr115 120 125gga aac gga acc att aac tgg gac gcc aca tac atg ttc gca tac cag 432Gly Asn Gly Thr Ile Asn Trp Asp Ala Thr Tyr Met Phe Ala Tyr Gln130 135 140
gca ctg gga gag atg acc cgg atc gga aag tac atc acc aag ggc ttt 480Ala Leu Gly Glu Met Thr Arg Ile Gly Lys Tyr Ile Thr Lys Gly Phe145 150 155 160tat ggc cag tcc agc gac agc aag gtc tac acc tac tac gag ggt tgc 528Tyr Gly Gln Ser Ser Asp Ser Lys Val Tyr Thr Tyr Tyr Glu Gly Cys165 170 175tcc gat gga gga cgt gag ggt atg agt caa gtc cag cgc tgg ggt gag 576Ser Asp Gly Gly Arg Glu Gly Met Ser Gln Val Gln Arg Trp Gly Glu180 185 190gag tat gac ggt gcg att act ggt gcc ccg gct ttc cgt ttc gct cag 624Glu Tyr Asp Gly Ala Ile Thr Gly Ala Pro Ala Phe Arg Phe Ala Gln195 200 205caa cag gtt cac cat gtg ttc tcg tcc gaa gtg gag caa act ctg gac 672Gln Gln Val His His Val Phe Ser Ser Glu Val Glu Gln Thr Leu Asp210 215 220tac tac ccg cct cca tgt gag tcg aag aag atc gtg aac gcc acc att 720Tyr Tyr Pro Pro Pro Cys Glu Ser Lys Lys Ile Val Asn Ala Thr Ile225 230 235 240gct gct tgc gac ccg ctt gat gga aga acc gac ggt gtt gtg tcc cgg 768Ala Ala Cys Asp Pro Leu Asp Gly Arg Thr Asp Gly Val Val Ser Arg245 250 255acg gat ctt tgc aag ctt aac ttc aat ttg acc tct atc atc ggt gag 816Thr Asp Leu Cys Lys Leu Asn Phe Asn Leu Thr Ser Ile Ile Gly Glu260 265 270cct tac tac tgt gct gcg gga act agc act tcg ctt ggt ttc ggc ttc 864Pro Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Ser Thr Ser Leu Gly Phe Gly Phe275 280 285agc aat ggc aag cgc agc aat gtc aag cgt cag gcc gag ggc agc acc 912Ser Asn Gly Lys Arg Ser Asn Val Lys Arg Gln Ala Glu Gly Ser Thr290 295 300acc agc tac cag ccc gcc cag aac ggc acg gtc acc gca cgt ggt gta 960Thr Ser Tyr Gln Pro Ala Gln Asn Gly Thr Val Thr Ala Arg Gly Val305 310 315 320gct gtc gcc cag gcc atc tac gat ggt ctc cac aac agc aag ggc gag 1008Ala Val Ala Gln Ala Ile Tyr Asp Gly Leu His Asn Ser Arg Gly Glu325 330 335cgc gcg tac ctc tcc tgg cag att gcc tct gag ctg agc gat gct gag 1056Arg Ala Tyr Leu Ser Trp Gln Ile Ala Ser Glu Leu Ser Asp Ala Glu340 345 350acc gag tac aac tct gac act ggc aag tgg gag ctc aac atc ccg tcg 1104Thr Glu Tyr Asn Ser Asp Thr Gly Lys Trp Glu Leu Asn Ile Pro Ser355 360 365acc ggt ggt gag tac gtc acc aag ttc att cag ctc ctg aac ctc gac 1152Thr Gly Gly Glu Tyr Val Thr Lys Phe Ile Gln Leu Leu Asn Leu Asp370 375 380
aac ctt tcg gat ctg aac aac gtg acc tac gac acc ctg gtc gac tgg 1200Asn Leu Ser Asp Leu Asn Asn Val Thr Tyr Asp Thr Leu Val Asp Trp385 390 395 400atg aac act ggt atg gtg cgc tac atg gac agc ctt cag acc acc ctt 1248Met Asn Thr Gly Met Val Arg Tyr Met Asp Ser Leu Gln Thr Thr Leu405 410 415ccc gat ctg act ccc ttc caa tcg tcc ggc gga aag ctg ctg cac tac 1296Pro Asp Leu Thr Pro Phe Gln Ser Ser Gly Gly Lys Leu Leu His Tyr420 425 430cac ggt gaa tct gac ccc agt atc ccc gct gcc tcc tcg gtc cac tac 1344His Gly Glu Ser Asp Pro Ser Ile Pro Ala Ala Ser Ser Val His Tyr435 440 445tgg cag gcg gtt cgt tcc gtc atg tac ggc gac aag acg gaa gag gag 1392Trp Gln Ala Val Arg Ser Val Met Tyr Gly Asp Lys Thr Glu Glu Glu450 455 460gcc ctg gag gct ctc gag gac tgg tac cag ttc tac cta atc ccc ggt 1440Ala Leu Glu Ala Leu Glu Asp Trp Tyr Gln Phe Tyr Leu Ile Pro Gly465 470 475 480gcc gcc cac tgc gga acc aac tct ctc cag ccc gga cct tac cct gag 1488Ala Ala His Cys Gly Thr Asn Ser Leu Gln Pro Gly Pro Tyr Pro Glu485 490 495aac aac atg gag att atg atc gac tgg gtc gag aac ggc aac aag ccg 1536Asn Asn Met Glu Ile Met Ile Asp Trp Val Glu Asn Gly Asn Lys Pro500 505 510tcc cgt ctc aat gcc act gtt tct tcg ggt acc tac gcc ggc gag acc 1584Ser Arg Leu Asn Ala Thr Val Ser Ser Gly Thr Tyr Ala Gly Glu Thr515 520 525cag atg ctt tgc cag tgg ccc aag cgt cct ctc tgg cgc ggc aac tcc 1632Gln Met Leu Cys Gln Trp Pro Lys Arg Pro Leu Trp Arg Gly Asn Ser530 535 540agc ttc gac tgt gtc aac gac gag aag tcg att gac agc tgg acc tac 1680Ser Phe Asp Cys Val Asn Asp Glu Lys Ser Ile Asp Ser Trp Thr Tyr545 550 555 560gag ttc cca gcc ttc aag gtc cct gta tac 1710Glu Phe Pro Ala Phe Lys Val Pro Val Tyr565 570<210>2<211>570<212>PRT<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)<220>
<221>mat peptide<222>(1)…(570)
<400>2Ala Ser Phe Thr Asp Val Cys Thr Val Ser Asn Val Lys Ala Ala Leu1 5 10 15Pro Ala Asn Gly Thr Leu Leu Gly Ile Ser Met Leu Pro Ser Ala Val20 25 30Thr Ala Asn Pro Leu Tyr Asn Gln Ser Ala Gly Met Gly Ser Thr Thr35 40 45Thr Tyr Asp Tyr Cys Asn Val Thr Val Ala Tyr Thr His Thr Gly Lys50 55 60Gly Asp Lys Val Val Ile Lys Tyr Ala Phe Pro Lys Pro Ser Asp Tyr65 70 75 80Glu Asn Arg Phe Tyr Val Ala Gly Gly Gly Gly Phe Ser Leu Ser Ser85 90 95Asp Ala Thr Gly Gly Leu Ala Tyr Gly Ala Val Gly Gly Ala Thr Asp100 105 110Ala Gly Tyr Asp Ala Phe Asp Asn Ser Tyr Asp Glu Val Val Leu Tyr115 120 125Gly Asn Gly Thr Ile Asn Trp Asp Ala Thr Tyr Met Phe Ala Tyr Gln130 135 140Ala Leu Gly Glu Met Thr Arg Ile Gly Lys Tyr Ile Thr Lys Gly Phe145 150 155 160Tyr Gly Gln Ser Ser Asp Ser Lys Val Tyr Thr Tyr Tyr Glu Gly Cys165 170 175Ser Asp Gly Gly Arg Glu Gly Met Ser Gln Val Gln Arg Trp Gly Glu180 185 190Glu Tyr Asp Gly Ala Ile Thr Gly Ala Pro Ala Phe Arg Phe Ala Gln195 200 205Gln Gln Val His His Val Phe Ser Ser Glu Val Glu Gln Thr Leu Asp210 215 220Tyr Tyr Pro Pro Pro Cys Glu Ser Lys Lys Ile Val Asn Ala Thr Ile225 230 235 240Ala Ala Cys Asp Pro Leu Asp Gly Arg Thr Asp Gly Val Val Ser Arg245 250 255Thr Asp Leu Cys Lys Leu Asn Phe Asn Leu Thr Ser Ile Ile Gly Glu260 265 270Pro Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Ser Thr Ser Leu Gly Phe Gly Phe275 280 285Ser Asn Gly Lys Arg Ser Asn Val Lys Arg Gln Ala Glu Gly Ser Thr290 295 300Thr Ser Tyr Gln Pro Ala Gln Asn Gly Thr Val Thr Ala Arg Gly Val305 310 315 320Ala Val Ala Gln Ala Ile Tyr Asp Gly Leu His Asn Ser Arg Gly Glu325 330 335Arg Ala Tyr Leu Ser Trp Gln Ile Ala Ser Glu Leu Ser Asp Ala Glu
340 345 350Thr Glu Tyr Asn Ser Asp Thr Gly Lys Trp Glu Leu Asn Ile Pro Ser355 360 365Thr Gly Gly Glu Tyr Val Thr Lys Phe Ile Gln Leu Leu Asn Leu Asp370 375 380Asn Leu Ser Asp Leu Asn Asn Val Thr Tyr Asp Thr Leu Val Asp Trp385 390 395 400Met Asn Thr Gly Met Val Arg Tyr Met Asp Ser Leu Gln Thr Thr Leu405 410 415Pro Asp Leu Thr Pro Phe Gln Ser Ser Gly Gly Lys Leu Leu His Tyr420 425 430His Gly Glu Ser Asp Pro Ser Ile Pro Ala Ala Ser Ser Val His Tyr435 440 445Trp Gln Ala Val Arg Ser Val Met Tyr Gly Asp Lys Thr Glu Glu Glu450 455 460Ala Leu Glu Ala Leu Glu Asp Trp Tyr Gln Phe Tyr Leu Ile Pro Gly465 470 475 480Ala Ala His Cys Gly Thr Asn Ser Leu Gln Pro Gly Pro Tyr Pro Glu485 490 495Asn Asn Met Glu Ile Met Ile Asp Trp Val Glu Asn Gly Asn Lys Pro500 505 510Ser Arg Leu Asn Ala Thr Val Ser Ser Gly Thr Tyr Ala Gly Glu Thr515 520 525Gln Met Leu Cys Gln Trp Pro Lys Arg Pro Leu Trp Arg Gly Asn Ser530 535 540Ser Phe Asp Cys Val Asn Asp Glu Lys Ser Ile Asp Ser Trp Thr Tyr545 550 555 560Glu Phe Pro Ala Phe Lys Val Pro Val Tyr565 570
權(quán)利要求
1.一種重組表達(dá)的米曲霉單寧酶，其氨基酸序列如序列表序列<400>2所示。
2.權(quán)利要求1所述的米曲霉單寧酶的編碼基因，其核苷酸序列如序列表序列<400>1所示。
3.權(quán)利要求1所述的米曲霉單寧酶的表達(dá)方法，通過(guò)表達(dá)載體pPIC9K-TAN在畢赤酵母菌株KM71中采用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，或者通過(guò)表達(dá)載體pGAPZαA-TAN和pGAPZαA-ETAN在畢赤酵母菌株KM71H中進(jìn)行組成型表達(dá)，不需誘導(dǎo)；兩種方式的表達(dá)產(chǎn)物均分泌于胞外，通過(guò)獲取培養(yǎng)物上清液進(jìn)行純化得到重組米曲霉單寧酶。
4.如權(quán)利要求3所述的米曲霉單寧酶的表達(dá)方法，其特征是所述的培養(yǎng)物上清液的純化是用DEAE陰離子交換柱層析一步純化。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組米曲霉單寧酶的表達(dá)以及純化方法。本發(fā)明通過(guò)PCR方法將編碼米曲霉單寧酶成熟蛋白的核苷酸序列用從米曲霉基因中擴(kuò)增出來(lái)，克隆到甲醇酵母表達(dá)載體pPIC9K，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K－TAN，采用電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71獲得重組菌株，并用高密度發(fā)酵的方法進(jìn)行重組單寧酶的誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物分布于發(fā)酵上清液中，表達(dá)量達(dá)200mg/L。本發(fā)明建立了重組米曲霉單寧酶的純化方法，采用DEAE陰離子交換柱層析一步純化。本發(fā)明還包括構(gòu)建了重組單寧酶在畢赤酵母中的組成型表達(dá)載體pGAPZαA－TAN和pGAPZαA－ETAN，并通過(guò)轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株KM71H獲得了具有單寧酶活性的工程菌株，能夠以分泌形式表達(dá)重組單寧酶。本發(fā)明的重組米曲霉單寧酶具有生物活性。
文檔編號(hào)C12N9/00GK1584023SQ20041002749
公開(kāi)日2005年2月23日 申請(qǐng)日期2004年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月9日
發(fā)明者徐安龍, 董美玲, 鄭穗蘭, 彭立勝, 孫孜孜, 任宇峰 申請(qǐng)人:中山大學(xué)