專利名稱：單核苷酸多態(tài)性(SNPs)及點(diǎn)突變的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
此項(xiàng)檢測及鑒定基因組單核苷酸多態(tài)性方法的發(fā)明，涉及使用含有單核苷酸多態(tài)性或點(diǎn)突變核酸分子互補(bǔ)的寡核苷酸引物，測試不同程度的堿基延伸，例如零、單一或二重延伸。對(duì)該寡核苷酸引物的預(yù)測延伸長度與實(shí)驗(yàn)的延伸長度或滲入延伸核苷酸的同位素標(biāo)記量作比較，以識(shí)別SNP或點(diǎn)突變。
背景技術(shù)：
人類基因組已經(jīng)排序，而在遺傳學(xué)方面將致力于比較不同個(gè)體的序列以了解人類的疾病。大約每壹千個(gè)堿基中有一個(gè)多態(tài)現(xiàn)象，其中絕大多數(shù)都屬于SNP或點(diǎn)突變的基因變異形式。盡管大部分變異都發(fā)生于基因間的非編碼區(qū)內(nèi)，但仍有許多出現(xiàn)在有用碎片(exon)及無用碎片(intron)上，成為編寫圖譜和診斷與疾病有關(guān)的對(duì)偶基因的有效工具。
單核苷酸多態(tài)性或點(diǎn)突變此類異常型的基因序列可用于法醫(yī)學(xué)上的個(gè)體識(shí)別及測定由遺傳而得的基因缺陷，如缺失、插入和突變?？捎没蚪MDNA位標(biāo)與染色體上SNP和點(diǎn)突變位置的廣泛分布，促使SNP成為備受關(guān)注的研究目標(biāo)。此外，通過SNP分布圖與特異表現(xiàn)型聯(lián)系分析，能有效率地測定基因表達(dá)。
為解決大量的基因測序，一套精確而經(jīng)濟(jì)的方法是必需的，能用有限的試劑及單一的化驗(yàn)辨別不同的SNPs或點(diǎn)突變。測試基因多態(tài)性的方法有許多，例如美國專利編號(hào)6,110,709，方法是先將核苷酸擴(kuò)增繼而進(jìn)行限制性分析，再把擴(kuò)增了的產(chǎn)物固定于附著結(jié)合物的支撐物上。專利發(fā)表編號(hào)WO9302212應(yīng)用雙脫氧核酸引起不同長度的擴(kuò)增產(chǎn)物，用凝膠電泳顯形及分離作基因測序。另外，專利發(fā)表編號(hào)WO0020853進(jìn)一步描述了測試單一堿基變化的方法，利用凝膠電泳屬性審視因序列變化而產(chǎn)生的構(gòu)象變化。
提供一套能從大量樣品中高效篩選單核苷酸多態(tài)性的新穎方法為此項(xiàng)發(fā)明的目標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
此項(xiàng)發(fā)明講述鑒別靶核苷酸(即單核苷酸多態(tài)性或點(diǎn)突變)的方法，應(yīng)用與單核苷酸多態(tài)性(“SNP”)或點(diǎn)突變互補(bǔ)的寡核苷酸引物進(jìn)行單一或二重堿基延伸。延伸產(chǎn)物長度取決于雙脫氧核糖核苷酸(ddNTP)和脫氧核糖核苷酸(dNTP)的存或缺，把預(yù)報(bào)延伸產(chǎn)物長度或標(biāo)記滲入量跟實(shí)驗(yàn)結(jié)果作比較，可鑒定單核苷酸多態(tài)性及基因點(diǎn)突變。
此項(xiàng)發(fā)明具體描述了寡核苷酸引物與核酸分子的雜交，核酸分子上鄰近已知SNP或點(diǎn)突變3’端的核苷酸跟寡核苷酸引物3’末端的互補(bǔ)核苷酸雜交成一核酸雜種結(jié)構(gòu)。以載有SNP或點(diǎn)突變的核酸作為模板，經(jīng)過聚合過程，該寡核苷酸引物將進(jìn)行跟模板互補(bǔ)的零、單一或二重堿基延伸。例如把雙脫氧核糖核苷酸(ddNTP)加進(jìn)聚合混合物，當(dāng)聚合到核酸分子上與ddNTP互補(bǔ)的核苷酸時(shí)，寡核苷酸引物延伸便會(huì)終止。此項(xiàng)發(fā)明是透過聚合過程中，采用跟SNP或點(diǎn)突變位5’端旁核苷酸相同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)，作為延伸終止劑，進(jìn)行零、單一或二重堿基延伸。方法是分別于三個(gè)反應(yīng)容器內(nèi)放置相同的ddNTP但三種不同的dNTP，而且所用ddNTP核苷跟同一反應(yīng)容器內(nèi)dNTP核苷是不一樣的，當(dāng)進(jìn)行聚合過程時(shí)，反應(yīng)混合物內(nèi)寡核苷酸引物會(huì)于3’氫氧基末端作延伸。利用反應(yīng)容器內(nèi)延伸寡核苷酸產(chǎn)物的長度(或標(biāo)記ddNTP滲入量)作比較，便可測定單倍體核酸模板上及于雙倍體核酸模板上跟SNP或點(diǎn)突變純合和雜合的相對(duì)位置。同樣地，利用預(yù)報(bào)標(biāo)記標(biāo)記ddNTP滲入引物量跟實(shí)驗(yàn)結(jié)果作比較，亦能達(dá)到目的。
此項(xiàng)發(fā)明的固態(tài)模式應(yīng)用，可用于大規(guī)?；蚝Y選，如基因芯片。把跟SNP或點(diǎn)突變位3’端旁基因序列互補(bǔ)的各類寡核苷酸引物，如脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及肽核酸(PNA)，固定于固體基質(zhì)上，如玻璃片、金屬片、塑料膜、尼龍膜、珠子或其它適合的基體。采用靶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物，跟固定寡核苷酸引物雜交，并充當(dāng)延伸模板。如上所述，加入恰當(dāng)?shù)膁NTP或ddNTP，可把固定寡核苷酸引物作零、單一或二重延伸，就如一個(gè)使用標(biāo)記ddNTP的有效延伸便能產(chǎn)生標(biāo)記寡核苷酸引物，而沒標(biāo)記的寡核苷酸引物即表示沒有堿基延伸。運(yùn)用適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)條件，標(biāo)記ddNTP滲入量跟核酸模板上SNP或點(diǎn)突變的數(shù)量是成正比的，此關(guān)系有助推算核酸模板上的特定SNP或?qū)ε蓟虻狞c(diǎn)突變。在此基礎(chǔ)上，利用標(biāo)記滲入量圖表就能夠測定單倍體、純合雙倍體或雜合雙倍體核酸模板上已知SNP或點(diǎn)突變的存在或缺失。
單核苷酸多態(tài)性(“SNP”)預(yù)報(bào)表是由表直列標(biāo)題、橫欄標(biāo)題及寡核苷酸引物的預(yù)報(bào)長度(或標(biāo)記滲入量)構(gòu)成。表直列標(biāo)題表示堿基延伸反應(yīng)的條件，而橫欄標(biāo)題則表示具有潛在置換SNP的核酸序列，還有交匯于表直橫欄間的引物長度數(shù)據(jù)。按預(yù)報(bào)寡核苷酸長度或標(biāo)記滲入量與實(shí)際數(shù)據(jù)作對(duì)照，便能清楚顯示單倍體或雙倍體核酸分子上的獨(dú)有SNP。


圖1顯示此項(xiàng)發(fā)明的概要圖解。核酸分子3’部分及5’雜交部分，互補(bǔ)寡核苷酸引物的3’及5’部分，靶核苷酸，或與寡核苷酸引物3’氫氧基末端緊接的SNP。
圖2顯示采用了如圖1寡核苷酸引物延伸鏈長度分析鑒定單倍體靶核上的SNP，表直列標(biāo)題表示堿基延伸反應(yīng)的條件，而橫欄標(biāo)題則表示可能含有SNP的核酸序列，還有交匯于表直橫欄間格內(nèi)的引物長度數(shù)據(jù)。
圖3顯示采用了如圖1寡核苷酸引物延伸鏈長度分析鑒定雙倍體靶核上的SNP，表直列標(biāo)題表示堿基延伸反應(yīng)的條件，而橫欄標(biāo)題則表示可能含有SNP的核酸序列，還有交匯于表直橫欄間格內(nèi)的引物長度數(shù)據(jù)。
圖4顯示于寡核苷酸引物延伸過程中(如圖1)采用了同位素、熒光或酶標(biāo)記延伸終止核苷酸滲入的方法，沒使用引物延伸實(shí)際長度分析，鑒定單倍體靶核上的SNP。圖表中的0代表沒標(biāo)記滲入，而2x代表因引物延伸的標(biāo)記滲入，此外，表直列標(biāo)題表示堿基延伸反應(yīng)的條件，而橫欄標(biāo)題則表示可能含有SNP的核酸序列，還有交匯于表直橫欄間格內(nèi)的引物中標(biāo)記滲入量數(shù)據(jù)。
圖5顯示于寡核苷酸引物延伸過程中(如圖1)采用了同位素、熒光或酶標(biāo)記延伸終止核滲入的方法，沒使用引物延伸實(shí)際長度分析，鑒定雙倍體靶核上的SNP。圖表中的0代表沒標(biāo)記滲入，1x代表從半組DNA范本(即單一SNP對(duì)偶基因)復(fù)印出的延伸引物的半量標(biāo)記滲入，而2x則代表從全組DNA范本(即整對(duì)SNP對(duì)偶基因)復(fù)印出的延伸引物的全量標(biāo)記滲入，此外，表直列標(biāo)題表示堿基延伸反應(yīng)的條件，而橫欄標(biāo)題則表示可能含有SNP的核酸序列，還有交匯于表直橫欄間格內(nèi)的引物中標(biāo)記滲入量數(shù)據(jù)。
圖6和圖7顯示了此項(xiàng)發(fā)明的概要圖解。采用寡核苷酸擴(kuò)增引物1及2以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)把靶核苷酸分子上的3’部分及5’部分(或于引物1與2之間的SNP)作擴(kuò)增。此核酸分子擴(kuò)增物會(huì)再跟第三鏈互補(bǔ)寡核苷酸引物、靶核苷酸或與寡核苷酸引物3’氫氧基末端部分接近的SNP進(jìn)行雜交。
圖8顯示于寡核苷酸引物延伸過程中(如圖7)采用第三鏈寡核苷酸引物延伸長度分析鑒定單倍體靶核苷酸上的SNP，表直列標(biāo)題表示第三鏈寡核苷酸引物延伸反應(yīng)的條件，而橫欄標(biāo)題則表示可能含有SNP的核酸序列，還有交匯于表直橫欄間格內(nèi)的引物長度數(shù)據(jù)。
圖9顯示于寡核苷酸引物延伸過程中(如圖7)采用第三鏈寡核苷酸引物延伸長度分析鑒定單倍體靶核苷酸上的SNP，表直列標(biāo)題表示第三鏈寡核苷酸引物延伸反應(yīng)的條件，而橫欄標(biāo)題則表示可能含有SNP的核酸序列，還有交匯于表直橫欄間格內(nèi)的引物長度數(shù)據(jù)。
圖10顯示于第三鏈寡核苷酸引物延伸過程中(如圖7)采用了同位素、熒光或酶標(biāo)記延伸終止核滲入的方法，沒使用引物延伸實(shí)際長度分析，鑒定單倍體靶核苷酸上的SNP。圖表中的0代表沒標(biāo)記滲入，而2x代表因引物延伸的標(biāo)記滲入，此外，表直列標(biāo)題表示第三鏈寡核苷酸引物延伸反應(yīng)的條件，而橫欄標(biāo)題則表示可能含有SNP的核酸序列，還有交匯于表直橫欄間格內(nèi)的引物中標(biāo)記滲入量數(shù)據(jù)。
圖11顯示于第三鏈寡核苷酸引物延伸過程中(如圖7)采用了同位素、熒光或酶標(biāo)記延伸終止核滲入的方法，沒使用引物延伸實(shí)際長度分析，鑒定雙倍體靶核苷酸上的SNP。圖表直列標(biāo)題表示第三鏈寡核苷酸引物延伸反應(yīng)的條件，而橫欄標(biāo)題則表示具有潛在純合或雜合SNP的核酸序列，還有交匯于表直橫欄間格內(nèi)的引物中標(biāo)記滲入量數(shù)據(jù)。此外，圖表中的0代表沒標(biāo)記滲入，1x代表從半組DNA模板(即單一SNP對(duì)偶基因)復(fù)印出的延伸引物的半量標(biāo)記滲入，而2x則代表從全組DNA模板(即整對(duì)SNP對(duì)偶基因)復(fù)印出的延伸引物的全量標(biāo)記滲入。
圖12顯示采用了同位素、熒光或酶標(biāo)記延伸終止核酸滲入的雙培育方法，培養(yǎng)于兩組反應(yīng)條件進(jìn)行，沒使用引物延伸實(shí)際長度分析，以鑒定單倍體或雙倍體靶核苷酸上的SNP。圖表直列標(biāo)題表示寡核苷酸引物延伸反應(yīng)的條件，而橫欄標(biāo)題則表示可能含有純合或雜合SNP的核酸序列，還有交匯于表直橫欄間格內(nèi)的引物中標(biāo)記滲入量數(shù)據(jù)。此外，圖表中的0代表沒標(biāo)記滲入，1x代表從半組DNA模板(即單一SNP對(duì)偶基因)復(fù)印出的延伸引物的半量標(biāo)記滲入，而2x則代表從全組DNA模板(即整對(duì)SNP對(duì)偶基因)復(fù)印出的延伸引物的全量標(biāo)記滲入。
具體實(shí)施例方式
術(shù)語此項(xiàng)公開發(fā)明的任何替補(bǔ)和修改將不會(huì)偏離其所述領(lǐng)域及精神。
術(shù)語″一個(gè)″(″a″或″an″)用于具體說明時(shí)可解作一個(gè)或更多，連同″包含″(″comprising″)用于聲明上，詞組″a″或″an″則解作一個(gè)或多于一個(gè)，而″another″可解作至少一個(gè)第二或更多。
術(shù)語″獨(dú)特的鏈延伸核苷酸″(″distinct chain-extending nucleotide″)意指于單一反應(yīng)容器內(nèi)加入鏈延伸核(如A、T、G、C、嘌呤堿或嘧啶衍生物)。雖然不同的反應(yīng)容器內(nèi)含有獨(dú)特的鏈延伸核(如管1-dATP、管2-dTTP、管3-dGTP)，但是絕不能有多過一個(gè)鏈延伸核苷酸于同一反應(yīng)容器內(nèi)(如dATP和dTTP于同管內(nèi))。
術(shù)語.″雜交″(″hybridizing″)意指兩條互補(bǔ)核酸分子鏈的締合，形成雙鏈核酸分子，可包含兩條DNA鏈、兩條RNA鏈或各一條DNA鏈和RNA鏈?；パa(bǔ)鏈的締合在分子生物學(xué)已知的條件下進(jìn)行(如溫度、酸堿值、鹽分濃度等)。
術(shù)語″3’氫氧基部分″(″3’hydroxyl moiety″)意指附著到核酸分子糖端3’碳的氫氧基組，而3’氫氧基組跟另一個(gè)核苷酸上的磷酸鹽形成estor化學(xué)鍵，在過程中一個(gè)水分子會(huì)被去除。
術(shù)語″靶核苷酸″(″target nucleotide″)意指特定核酸分子序列或選址上會(huì)被鑒定的核苷酸。靶核苷酸亦可解作核酸分子上第一個(gè)前選單核苷酸位置，通常靶核苷酸就是SNP或點(diǎn)突變。
術(shù)語″鄰接核苷酸″(″adjacent nucleotide″)意指核酸分子上要識(shí)別的鄰接靶核苷酸或第一個(gè)前選單核苷酸位置的核苷酸。此核苷酸亦可解作核酸分子上第二個(gè)前選單核苷酸位置。
術(shù)語″等分″(″aliquoting″)意指把容積均勻地等分為各部分。
術(shù)語″培養(yǎng)″(″incubating″)意指在滿意的環(huán)境中進(jìn)行混合物反應(yīng)。滿意的環(huán)境包括溫度、酶、鹽分濃度或酸堿值等等。
術(shù)語″聚合酶反應(yīng)混合物″(″polymerase reaction mixture″)意指為促進(jìn)聚合酶進(jìn)行寡核苷酸引物延伸的有利成分。
術(shù)語″核苷酸″(″nucleotide″)意指任何由核苷跟糖基上的磷酸鹽酯化后所構(gòu)成的化合物。
術(shù)語″核苷″(″nucleoside″)意指任何糖基胺(glycosylamine)，是一核酸成分且包含連結(jié)糖的氮基。
術(shù)語″核苷酸堿基″(″nucleotide base″)意指在核酸中構(gòu)成一個(gè)核苷或核苷酸的任何氮基，且與核堿基(nucleoside base)同義。
此項(xiàng)發(fā)明講述鑒別靶核苷酸或單核苷酸多態(tài)性或點(diǎn)突變的方法，應(yīng)用與單核苷酸多態(tài)或點(diǎn)突變互補(bǔ)的寡核苷酸引物進(jìn)行單一或二重堿基延伸。預(yù)報(bào)延伸產(chǎn)物長度取決于特定的雙脫氧核糖核苷酸(ddNTP)和脫氧核糖核苷酸(dNTP)，把預(yù)報(bào)延伸產(chǎn)物長度跟實(shí)驗(yàn)結(jié)果作比較，可鑒定單核苷酸多態(tài)性及基因點(diǎn)突變。同樣地，利用預(yù)報(bào)標(biāo)記滲入量跟實(shí)驗(yàn)結(jié)果作比較，亦能達(dá)到目的。
此項(xiàng)發(fā)明體現(xiàn)了寡核苷酸引物與核酸分子的雜交，核酸分子上鄰近已知SNP或點(diǎn)突變3’端的核苷酸跟寡核苷酸引物3’末端的互補(bǔ)核苷酸雜交成一核酸雜種結(jié)構(gòu)。以載有SNP或點(diǎn)突變的核酸作為模板，經(jīng)過聚合過程，該寡核苷酸引物將進(jìn)行跟模板互補(bǔ)的零、單一或二重堿基延伸。例如把雙脫氧核糖核苷酸(ddNTP)加進(jìn)聚合混合物，當(dāng)聚合到核酸分子上與ddNTP互補(bǔ)的核苷酸時(shí)，寡核苷酸引物延伸便會(huì)終止。此項(xiàng)發(fā)明是聚合過程中，采用跟SNP或點(diǎn)突變位5’端旁核苷酸相同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)，作為延伸終止劑，進(jìn)行零、單一或二重堿基延伸。方法是分別于三個(gè)反應(yīng)容器內(nèi)放置相同的ddNTP但三種不同的dNTP，而且所用ddNTP的核苷堿基與同一反應(yīng)容器內(nèi)dNTP的核苷堿基是不一樣的，當(dāng)進(jìn)行聚合過程時(shí)，反應(yīng)混合物內(nèi)寡核苷酸引物會(huì)于3’氫氧基末端作延伸。利用反應(yīng)容器中延伸寡核苷酸產(chǎn)物的長度作比較，便可測定單倍體及雙倍體核酸模板上的SNP或點(diǎn)突變。同樣地，利用預(yù)報(bào)標(biāo)記標(biāo)記了的ddNTP滲入引物量跟實(shí)驗(yàn)結(jié)果作比較，亦能達(dá)到目的。
一個(gè)具體的例子是一步延長/終止反應(yīng)，接著作鏈長分析，就提供了感興趣的SNP的完整數(shù)據(jù)，在此實(shí)例中，提供一個(gè)具有一個(gè)序列的引物，此序列互補(bǔ)于該靶多核苷酸的片段，而此片段緊鄰于該靶核苷酸之3′側(cè)。該靶核苷酸意指要被篩選的SNP或點(diǎn)突變已知將會(huì)坐落在其序列位置上。在這反應(yīng)混合物內(nèi)亦提供一個(gè)互補(bǔ)于鄰接于該SNP/點(diǎn)突變5′端的核苷酸的單一ddNTP。該ddNTP可以是經(jīng)標(biāo)記或未標(biāo)記的形式，這取決于在隨后的步驟中所用的產(chǎn)物分析方法。在該反應(yīng)混合物中亦可有一個(gè)dNTP，其堿基與ddNTP的不同。在一個(gè)靶DNA中，當(dāng)在可能的SNP/點(diǎn)突變位置以及其鄰接的5′側(cè)位置共有同一堿基本體的情況下，反應(yīng)的進(jìn)行會(huì)沒有加入dNTP。
在延伸/終止反應(yīng)后，透過鏈延伸或標(biāo)記了的ddNTP滲入量測定，可以確定在靶DNA上的潛在SNP或點(diǎn)突變處的堿基本體。當(dāng)采用不同的反應(yīng)混合物而各自含有不同的dNTP時(shí)，便能得到全面的數(shù)據(jù)結(jié)果。在雙脫氧核苷酸終止聚合反應(yīng)進(jìn)行后，沒有產(chǎn)生引物延伸或標(biāo)記滲入，這表明該靶SNP核苷酸跟任何反應(yīng)混合物內(nèi)的ddNTP或dNTP，并沒有互補(bǔ)關(guān)系。同時(shí)單一堿基延伸表示SNP核苷酸跟該ddNTP互補(bǔ)，二重堿基延伸則顯示靶SNP核苷酸跟反應(yīng)混合物內(nèi)的dNTP互補(bǔ)。假設(shè)反應(yīng)混合物內(nèi)只有ddCTP和dATP，而SNP點(diǎn)5’鄰近的核苷酸是G，經(jīng)過延伸/終止反應(yīng)后，將得到二重堿基延伸，延伸出的相對(duì)SNP及其5’鄰近核苷酸應(yīng)分別是T和G。另外，三組反應(yīng)跟對(duì)照(缺乏dNTP)同時(shí)進(jìn)行，所有反應(yīng)混合物內(nèi)均含有ddCTP但分別不同的dNTP。例如第一組A-mix含有dATP，第二組T-mix是dTTP，而第三組G-mix含有dGTP，發(fā)生于任何反應(yīng)混合物內(nèi)的ddCTP滲入均顯示跟dNTP或ddNTP互補(bǔ)的堿基占有了靶DNA上的潛在SNP或點(diǎn)突變位。假設(shè)延伸發(fā)生于缺乏dNTP的對(duì)照組，這代表延伸堿基跟ddCTP互補(bǔ)，所以該靶核苷酸應(yīng)該是G，在這種情況下，引物只作單一而非二重堿基延伸。
反應(yīng)混合物內(nèi)含二或三類dNTPs和特定的ddNTP，能夠初步鑒定靶SNP或點(diǎn)突變位上的堿基是否跟ddNTP或其中一類dNTP互補(bǔ)。這種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)一些特別的應(yīng)用會(huì)有用。
在另一些實(shí)例中，一些或全部反應(yīng)可在固態(tài)下進(jìn)行。在固態(tài)模式下進(jìn)行的典型程序主要包括如下步驟模板擴(kuò)增、退火/純化、引物固定、引物延伸、再退火/純化及檢測，但是在某些情況下每一步驟可變更和簡化。
以上原理將詳述如下例1靶多核苷酸分子可以是單倍體或純合雙倍體或雜合雙倍體人類基因組DNA序列的部分，如圖1所示。圖1的示意繪圖顯示本發(fā)明的一個(gè)方面；有3’部分和5’部分的一個(gè)核酸分子與有3’部分和5’部分的一個(gè)互補(bǔ)的寡核苷酸引物雜交；靶核苷酸，或是與寡核苷酸引物3’氫氧基緊接的SNP。圖1的靶多核苷酸顯示一個(gè)具有核苷酸堿基A的SNP(注為易于描述，把靶多核苷酸上的SNP位稱作靶核苷酸)。雖然圖1的靶核苷酸是A，但在人群中在此同一地址上其它核苷酸堿基C、G及T亦會(huì)出現(xiàn)，只是發(fā)生率依人群而異。此外，就該靶核苷酸例子而言，在靶核苷酸兩側(cè)的核苷酸堿基是已知的，且頻率不像靶核苷酸或SNP那樣改變。
因而，就例子的目的而言，起始物質(zhì)是雙鏈基因組DNA分子，它具有稱作靶核苷酸(即A)的SNP，和靶核苷酸堿基A，在任何給定的基因組DNA分子中成為G，T，或C的頻率可以不同，但靶兩側(cè)的核苷酸在頻率上并不按比例變更。目標(biāo)是應(yīng)用本發(fā)明去識(shí)別在例子中未知的靶核苷酸。下面各段描述如何應(yīng)用本發(fā)明在未知的DNA例子中在特定位置上去識(shí)別靶核苷酸。
過程的第一步是純化人類基因組DNA及將其從其它諸如細(xì)胞殘骸等污染物質(zhì)分離；這些純化方法已為人們所熟知，此處不作進(jìn)一步討論。當(dāng)純化DNA后，按本發(fā)明，在圖1中顯示的引物則用作檢測。該引物含有一個(gè)序列，它與緊接SNP 3’旁的靶DNA片段互補(bǔ)。在此特例中，為簡單起見，圖1僅顯示了包抄SNP兩側(cè)的兩個(gè)堿基，靶DNA上其它堿基及引物上它們的互補(bǔ)堿基則分別用Y及X表示。在本例子中，2堿基TT緊接SNP 3’端。為便于描述，以五基引物作為例子，它含有如圖1、2、3所示的序列3’-AAXXX-5’。圖2的表格顯示如何通過在圖1顯示的反應(yīng)中的寡核苷酸引物延伸的鏈長度分析，利用此表去確定在單倍體靶核苷酸中SNP的本體。表中直列標(biāo)題表示適合延伸寡核苷酸引物的反應(yīng)條件；橫欄標(biāo)題表示具有潛在置換SNP的核酸序列；在直列標(biāo)題和橫欄標(biāo)題交匯處的每一方框內(nèi)列出延伸了的寡核苷酸引物的預(yù)報(bào)長度。通過在圖1顯示的反應(yīng)中的寡核苷酸引物延伸的鏈長度分析，可利用圖3的表格去確定在雙倍體靶核苷酸中SNP的本體。表中直列標(biāo)題表示適合延伸寡核苷酸引物的反應(yīng)條件；橫欄標(biāo)題表示在純合或雜合SNP地址具有潛在的靶核苷酸置換的核酸序列；而在直列標(biāo)題和橫欄標(biāo)題交匯處的每一方框內(nèi)列出延伸了的寡核苷酸引物的預(yù)報(bào)長度。
在延伸/終止反應(yīng)中，引物延伸是需要適當(dāng)?shù)木酆厦讣由线m合的反應(yīng)條件，像適當(dāng)?shù)妮o因子，如DNA聚合酶反應(yīng)只可在Mg++存在下才可進(jìn)行。圖2及3顯示了三個(gè)反應(yīng)混合物內(nèi)的成分，每個(gè)載有不同的dNTP，但沒有顯示輔因子及反應(yīng)條件。要進(jìn)行鏈延伸，適合的反應(yīng)條件是必需的，實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)可參考分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(第二版，著者J.Sambrook等人，出版社Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989年)一書。因SNP點(diǎn)5’緊接著的核苷酸是G，所以采用了跟G配對(duì)的雙脫氧核苷酸ddCTP。圖2第一行顯示三個(gè)反應(yīng)混合物A-Mix、T-Mix及G-Mix，都載有ddCTP、引物、靶DNA及依次分別含有一種脫氧核糖核苷酸dATP、dTTP或dGTP(不同于dCTP)。這樣，它們各自含有不同于C的獨(dú)特堿基的dNTP核苷酸。
雙倍體生物體包含兩個(gè)拷貝的大部分基因，要測試其基因型，首先要確定生物體含有兩個(gè)拷貝的基準(zhǔn)性對(duì)偶基因(基準(zhǔn)型純接合體)，還是各一拷貝基準(zhǔn)性及相異性對(duì)偶基因(雜接合體)，或兩拷貝相異性對(duì)偶基因(相異型純接合體)。此項(xiàng)發(fā)明方法可應(yīng)用于進(jìn)行基因型分析，檢測單一變異位。通常SNP由對(duì)偶構(gòu)成，而樣品亦包含兩拷貝靶核苷酸，若樣品為雜接合體，將形成兩個(gè)標(biāo)記了的延伸產(chǎn)物。
此項(xiàng)快速基因型分析的發(fā)明，提供了有效基因分析及疾病易感性測定的工具。若一個(gè)體的帶病對(duì)偶基因是純接合體，那他比具雜接合體或其它對(duì)偶基因純接合體的個(gè)體，患病的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)更高。不過，此雜接合體仍然是一個(gè)帶病載體。此知識(shí)對(duì)產(chǎn)前檢查及其它醫(yī)學(xué)和遺傳學(xué)上的輔導(dǎo)都非常有用。因此，若靶DNA是單倍性基因(如X或男性特有的Y染色體)或純合雙倍性基因的部分，那SNP旁就只有單一的序列。像圖2或圖3最后一列的橫欄二至五顯示了于SNP位四個(gè)可能出現(xiàn)的堿基，以及包抄SNP兩側(cè)的堿基(如圖1所示)，在方框內(nèi)的堿基就是SNP位。圖2頂橫欄(及圖3、4、5、8、9、10、11和圖12的反應(yīng)2)亦顯示了欠缺dNTP的對(duì)照反應(yīng)，此對(duì)照可自由選擇是否包括在引物延伸實(shí)驗(yàn)之內(nèi)。
如上所述，未知單倍體或純合雙倍體DNA樣品的SNP堿基是A，所以圖2及圖3橫欄二T-Mix中的dTTP能朝著SNP堿基A進(jìn)行引物延伸，而ddCTP則于SNP 5’旁的G殘基引發(fā)終止，產(chǎn)生二重堿基引物延伸，但A-Mix、G-Mix和對(duì)照-Mix均沒有堿基延伸。
為充分地說明此項(xiàng)發(fā)明的用途，圖2及圖3橫欄三至五顯示了各反應(yīng)的預(yù)計(jì)鏈延伸結(jié)果，而每一橫欄展示出每個(gè)反應(yīng)中堿基滲入引物的數(shù)目及延伸引物的序列。以橫欄三為例，靶核苷酸的堿基是T，所以A-Mix內(nèi)引物會(huì)進(jìn)行二重堿基延伸，產(chǎn)生七基聚合體(7-mer)，而T-Mix和G-Mix均沒有堿基延伸。若靶核苷酸含有一個(gè)堿基C，二重堿基延伸(即7-mer的產(chǎn)生)會(huì)在G-Mix中發(fā)生，而A-Mix和T-Mix均沒有堿基延伸，引物依舊是五基聚合體(5-mer)。最后，像圖2及圖3橫欄五所顯示，若靶核苷酸含有一個(gè)堿基G，那A-Mix、T-Mix和G-Mix中均會(huì)產(chǎn)生六基聚合體(6-mer)，即單一堿基延伸。因反應(yīng)混合物內(nèi)SNP核苷酸的不同，令預(yù)報(bào)引物延伸(即零、單一或二重堿基延伸)亦有差異，其不同的延伸型式，將有助鑒定SNP的特質(zhì)。實(shí)際上，從A-Mix、T-Mix和G-Mix中任選其二作為引物延伸長度的審查亦已足夠。
圖3最后一列的橫欄六至十一顯示，當(dāng)包含SNP核苷酸的雙倍體靶DNA屬雜合性，SNP旁便會(huì)有兩種不同的序列。橫欄十的A-Mix、橫欄八的T-Mix和橫欄十一的G-Mix各從這些雜合性基因上兩種模板序列(SNP旁)獲得兩種鏈延伸，而橫欄六至十一內(nèi)的其它培養(yǎng)只獲得無延伸(零堿基延伸)、單一堿基延伸或二重堿基延伸。從A-Mix、T-Mix和G-Mix中觀察到的四種延伸組合結(jié)果(即零、單一、二重及單一加二重堿基延伸)，可辨別出六類SNP雜合性組合體(即橫欄六的A/T、橫欄七的A/C、橫欄八的A/G、橫欄九的T/C、橫欄十的T/G和橫欄十一的C/G)及四類SNP純合性組合體(如橫欄二到五所示)。例如沒有一個(gè)純合性的A/A、T/T、C/C和G/G預(yù)計(jì)會(huì)于多過一個(gè)反應(yīng)混合物內(nèi)作二重堿基延伸，而所有雜合性的A/T、A/C和T/C會(huì)于兩個(gè)反應(yīng)混合物內(nèi)作二重堿基延伸。還有，如橫欄六的A/T組合體預(yù)計(jì)會(huì)于A-Mix和T-Mix中作二重堿基延伸。相反地，橫欄七的A/C組合體預(yù)計(jì)會(huì)于T-Mix和G-Mix中作二重堿基延伸，而橫欄九的T/C組合體預(yù)計(jì)會(huì)于A-Mix和G-Mix中作二重堿基延伸。剩下的三類雜合性組合體A/G、T/G和C/G，以及橫欄五的純合性G/G預(yù)計(jì)會(huì)于A-Mix、T-Mix和G-Mix中作單一堿基延伸?？墒牵瑱M欄八的A/G只會(huì)于T-Mix中作二重堿基延伸，橫欄十的T/G只會(huì)于A-Mix中作二重堿基延伸，而橫欄十一的C/G只會(huì)于G-Mix中作二重堿基延伸。相反地，純合性G/G不會(huì)于A-Mix、T-Mix和G-Mix中作二重堿基延伸，所以利用三個(gè)(或事實(shí)上只利用其中兩個(gè))反應(yīng)混合物中發(fā)生的零、單一、二重及單一加二重堿基延伸型式已能鑒定靶DNA中雜合雙倍體的SNP組合。
由此可見，采用三組并行的延伸/終止反應(yīng)及對(duì)照反應(yīng)(沒有加入ddNTP的混合物)，并根據(jù)各組的引物延伸長度，可迅速鑒定單倍體基因、純合雙倍性和雜合雙倍性基因的單核苷酸多態(tài)性，而鏈長度分析可利用諸如電泳法或質(zhì)譜等技術(shù)。引物的長度取決于許多因素，包括堿基序列的構(gòu)成成分(影響溶解溫度Tm)、反應(yīng)溫度和進(jìn)行雜交的條件等。檢測方面可應(yīng)用沒標(biāo)記雙脫氧核苷酸或同位素標(biāo)記雙脫氧核苷酸，如以色譜分析作檢測，則可用熒光或酶標(biāo)記的雙脫氧核苷酸。就放射性同位素系統(tǒng)而言，可先把單一及二重堿基延伸產(chǎn)物作凝膠分離，進(jìn)一步采用放射自動(dòng)顯影證實(shí)延伸顯像結(jié)果。如采用質(zhì)譜或毛細(xì)管電泳法作鏈長度分析，可用沒標(biāo)記的雙脫氧核苷酸。另外，熒光標(biāo)記亦可和凝膠或毛細(xì)管電泳法一道運(yùn)用。
如果標(biāo)記測量法是采用標(biāo)記了的鏈終止核苷酸進(jìn)行而沒有完成鏈長度分析去分辨單一或二重堿基延伸，則所得結(jié)果會(huì)指示在已知反應(yīng)混合物中標(biāo)記了的核苷酸滲入到引物的量，而不考慮引物延伸的實(shí)際長度。圖4顯示了采用標(biāo)記鏈終止核苷酸進(jìn)行寡核苷酸引物延伸反應(yīng)(如圖1所示)，不須作引物延伸長度分析，以標(biāo)記滲入量鑒定單倍體靶核苷酸是否SNP；圖表中的0代表沒標(biāo)記滲入，而2x代表因引物延伸的標(biāo)記滲入；表中直列標(biāo)題表示寡核苷酸引物延伸反應(yīng)的條件；橫欄標(biāo)題則表示具有可能置換SNP的核酸序列；在直列標(biāo)題和橫欄標(biāo)題交匯處的每一方框內(nèi)列出延伸了的寡核苷酸引物的預(yù)報(bào)標(biāo)記量。像圖4所示的四個(gè)可能的單倍體SNP基因結(jié)果，顯示了此項(xiàng)發(fā)明不須作引物延伸長度分析，只須根據(jù)A-Mix、T-Mix和G-Mix三個(gè)反應(yīng)混合物內(nèi)不同(“0”和“2x”)標(biāo)記滲入型式的預(yù)報(bào)，就能取得SNP檢測結(jié)果。利用適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件，標(biāo)記終止核苷酸滲入引物量會(huì)隨著模板的多少而改變，有助分辨是由單倍體/半組(1x)或雙倍體/全組(2x)模板上進(jìn)行的引物延伸。采用此反應(yīng)條件，以標(biāo)記鏈終止核苷酸進(jìn)行寡核苷酸引物延伸(如圖1所示)，能獲得如圖5所示的十個(gè)可能的雙倍體SNP基因結(jié)果。這顯示了此項(xiàng)發(fā)明不須作實(shí)際的引物延伸長度分析，而以標(biāo)記滲入量鑒定雙倍體靶核苷酸是否SNP；圖表中的0代表沒標(biāo)記滲入；1x代表從半組DNA模板(即單一SNP對(duì)偶基因)復(fù)印出的延伸引物的半量標(biāo)記滲入；2x則代表從全組DNA模板(即整對(duì)SNP對(duì)偶基因)復(fù)印出的延伸引物的全量標(biāo)記滲入；圖表中直列標(biāo)題表示寡核苷酸引物延伸反應(yīng)的條件；橫欄標(biāo)題則表示具有可能置換純合或雜合SNP位置的靶核苷酸的核酸序列；在直列標(biāo)題和橫欄標(biāo)題交匯處的每一方框內(nèi)列出延伸了的寡核苷酸引物的預(yù)報(bào)同位素標(biāo)記量。另外，根據(jù)三個(gè)反應(yīng)混合物中不同(“0”、“1x”和“2x”)標(biāo)記滲入型式的預(yù)報(bào)，可完全辨別每一個(gè)組合(四個(gè)純合性和六個(gè)雜合性)。
利用含已知SNP的靶多核苷酸作為預(yù)報(bào)標(biāo)準(zhǔn)，跟DNA樣品并排一起進(jìn)行測試，能清晰及有效地辨別“0”、“1x”和“2x”標(biāo)記滲入量(如圖4和5所采用的)。例如A/A多核苷酸標(biāo)準(zhǔn)就是含純合性A/A SNP的雙倍體DNA，而G/G多核苷酸標(biāo)準(zhǔn)就是含純合性G/G SNP的雙倍體DNA。A/A多核苷酸會(huì)于A-Mix和G-Mix帶來零堿基滲入，但是可于T-Mix中帶來2x滲入。G/G多核苷酸則于三個(gè)反應(yīng)混合物中獲得2x滲入。當(dāng)A/A多核苷酸與G/G多核苷酸混合，結(jié)果會(huì)是跟A/G雜合DNA相同，于T-Mix中帶來2x滲入，但A-Mix和G-Mix中則只有1x滲入。滲入量的差異說明了所采用的測試條件能有效地分辨“0”、“1x”和“2x”標(biāo)記滲入量。
圖4和5的結(jié)果清晰地說明了不同的標(biāo)記鏈終止核苷酸滲入引物量能鑒定靶單倍性或雙倍性多核苷酸上的SNP核苷酸，不管引物是否作單一、二重或單一加二重堿基延伸，亦不須依賴鏈長度測定。不但如此，這些結(jié)果跟圖2和3能夠互相補(bǔ)足，從圖4和5辨認(rèn)到的SNP核苷酸，可利用圖2和3作進(jìn)一步確定，反過來亦成。
例2例2和例1是相類似的，只是于SNP測試中，在延伸/終止反應(yīng)之前會(huì)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。從受試者身上分離出極少量的靶雙鏈基因組DNA，繼而采用兩組引物(引物1及引物2)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)把DNA樣品擴(kuò)增。圖6和7顯示了此項(xiàng)發(fā)明的示意圖解，采用寡核苷酸擴(kuò)增引物1及2以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)把靶核苷酸分子上的3’部分及5’部分(或于引物1與2之間的SNP)作擴(kuò)增。此核酸分子擴(kuò)增物會(huì)再跟第三互補(bǔ)寡核苷酸引物、靶核苷酸或與寡核苷酸引物3’氫氧基末端部分緊接的SNP進(jìn)行雜交。如圖6所示，引物1及引物2分別跟靶DNA上序列1和序列2C以及它的反義DNA鏈互補(bǔ)。
序列1是位于靶SNP核苷酸的3’下游，序列2C則位于互補(bǔ)核酸鏈上，而序列2(跟引物2一樣)是位于SNP的5’上游，且與序列2C互補(bǔ)。為方便說明，引物的相對(duì)位置只依據(jù)雙鏈核酸的其中一鏈(靶DNA鏈)，即依據(jù)序列1和序列2。每當(dāng)要以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)把信號(hào)擴(kuò)增，兩組引物定要與對(duì)向核酸雙鏈互補(bǔ)，此條件已是熟悉的。
進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，采用傳統(tǒng)方法如體積排除色譜，從未起反應(yīng)的引物1和2中凈化擴(kuò)增產(chǎn)物(如圖6步驟2所示)，亦可利用核酸外切酶I(ExoI)和小蝦堿性磷酸酶把擴(kuò)增引物及dNTPs去除。
在延伸/終止反應(yīng)進(jìn)行中(如圖7步驟3所示)，包含重要SNP的擴(kuò)增產(chǎn)物(或稱作擴(kuò)增靶DNA)會(huì)與引物3雜交，而引物3跟靶SNP核苷酸3’鄰近的序列(序列3)是互補(bǔ)的。為方便說明，序列3上只顯示了SNP3’旁的兩個(gè)堿基(TT)，其余的堿基則用Y代表，而引物3上的X堿基跟相對(duì)的Y堿基是互補(bǔ)的。正如此例，靶核苷酸位上的堿基是A，另外靶SNP 5’旁的堿基是C，所以用于鏈終止的雙脫氧核糖核苷酸必須是ddGTP，再利用三組混合物的并行反應(yīng)以取得全面的結(jié)果(像圖8所示的這些為單倍體靶DNA作反應(yīng)的混合物A-Mix、T-Mix和C-Mix)。圖8還顯示了以第三鏈寡核苷酸引物延伸長度分析(如圖7)來鑒定單倍體靶核苷酸上的SNP，表中直列標(biāo)題表示第三鏈寡核苷酸引物延伸反應(yīng)的條件；橫欄標(biāo)題則表示可能的SNP置換；在直列標(biāo)題和橫欄標(biāo)題交匯處的每一方框內(nèi)列出延伸了的寡核苷酸引物的預(yù)報(bào)長度。延伸/終止反應(yīng)可與那些在例1描述的作比較，第三直列顯示了發(fā)生于T-Mix(包含ddGTP和dTTP)內(nèi)的延伸/終止反應(yīng)。既然靶核苷酸是A，dTTP將會(huì)給加上引物3的3’末端，緊接著是ddGTP。當(dāng)加上雙脫氧核糖核苷酸后，鏈終止便會(huì)發(fā)生，結(jié)果是二重堿基延伸。把雙脫氧核糖核苷酸ddGTP以32P放射物標(biāo)記，滲入于二重堿基延伸引物中使其發(fā)亮，并采用凝膠電泳法和放射自動(dòng)顯影將其分離及檢測。
為進(jìn)一步闡明此項(xiàng)發(fā)明能應(yīng)用于分析含不同SNP堿基的單倍體靶DNA序列，圖8顯示三個(gè)反應(yīng)混合物A-Mix、T-Mix和C-Mix內(nèi)的預(yù)期結(jié)果。此分析與圖2所示是大同小異，每組混合物內(nèi)均個(gè)別放置了跟其ddNTP不同堿基的dNTP，在表最右直列便顯示了單倍體靶DNA上的SNP及兩側(cè)包抄部分，而三個(gè)混合物A-Mix、T-Mix、C-Mix(或加上對(duì)照-Mix)中的預(yù)計(jì)引物延伸長度，以及其序列亦顯示于每個(gè)反應(yīng)混合物下的空格內(nèi)。簡單地說，含dTTP的T-Mix會(huì)產(chǎn)生二重堿基引物延伸，表示靶核苷酸是A，含dCTP的C-Mix若產(chǎn)生二重堿基延伸，這表示SNP核苷酸是G，若二重堿基延伸發(fā)生于含dATP的A-Mix中，則靶核苷酸是T。但若所有反應(yīng)混合物均發(fā)生單一堿基延伸，靶核苷酸便會(huì)是C。
另外，標(biāo)記ddGTP滲入引物量可用于量度一個(gè)特定反應(yīng)混合物中延伸引物鏈的數(shù)目，不需使用鏈長度分析來辨別單一或二重堿基延伸，圖10所顯示的預(yù)計(jì)結(jié)果可與圖4所示的作比較。這些數(shù)據(jù)足以鑒定單倍體靶多核苷酸上的SNP，因?yàn)椴煌琒NP核苷酸會(huì)得出不一樣的“0”和“2x”標(biāo)記滲入量型式的預(yù)報(bào)。
若包含SNP地址的靶多核苷酸是屬雙倍體而不是單倍體DNA序列的一部分，此SNP地址便可能由兩個(gè)相同(純合性)或是不一樣(雜合性)的SNP核苷酸所組成。這十類雙倍體SNP組合，其中四類是純合性組合，另外六類是雜合性組合，它們從A-Mix、T-Mix和G-Mix中均得出不一樣的引物延伸型式，即零、單一、二重及單一加二重堿基延伸。采用(如圖7)第三鏈寡核苷酸引物延伸長度分析，圖9可應(yīng)用于鑒定雙倍體靶核苷酸上的SNP，表直列標(biāo)題表示第三鏈寡核苷酸引物延伸反應(yīng)的條件；橫欄標(biāo)題則表示具有潛在純合或雜合SNP的核酸序列；在直列標(biāo)題和橫欄標(biāo)題交匯處的每一方框內(nèi)列出延伸了的寡核苷酸引物的預(yù)報(bào)長度。同樣地，利用標(biāo)記ddNTP終止物，十類雙倍體SNP組合將會(huì)得出不一樣的“0”、“1x”及“2x”標(biāo)記滲入量型式的預(yù)報(bào)((如圖11所示)。
因此，根據(jù)圖8、圖9、圖10和圖11中三組含不同dNTP反應(yīng)混合物的引物延伸長度或標(biāo)記ddNTP滲入量的結(jié)果比較，能夠辨別所有單倍體SNP以及全部十類雙倍體SNP組合。亦可包括無dNTP的對(duì)照混合物(對(duì)照-Mix)作進(jìn)一步確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果之用。
例3例3和例2是相類似的，只是引物3的5’末端是固定于固體基質(zhì)上。在聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)后(如例2所述)，利用核酸外切酶I(ExoI)和小蝦堿性磷酸酶或是凝膠電泳法把反應(yīng)混合物中多余的擴(kuò)增引物及dNTPs去除，然后將擴(kuò)增靶DNA變性及跟固定引物3結(jié)合。這樣采用相同或不同的固定引物排列，就可進(jìn)行大量多樣性標(biāo)本測試。
無論有否dNTP延伸物，當(dāng)把合適的雙脫氧核苷酸加進(jìn)混合物中，便能啟動(dòng)延伸/終止反應(yīng)。如圖7所示，因?yàn)橛赟NP5’旁的堿基是C，所以ddGTP便成為反應(yīng)混合物中的終止物。為著要完全地知悉單倍體或是雙倍體靶DNA上四個(gè)可能出現(xiàn)的SNP核苷酸，延伸反應(yīng)須于不同的核苷酸組合下進(jìn)行。反應(yīng)混合物內(nèi)載有聚合酶反應(yīng)物、固定引物3、鏈終止物ddGTP及鏈延伸物(dNTP)，固定引物延伸長度及鏈終止物滲入量的預(yù)報(bào)型式和非固定引物(如圖8、圖9、圖10和圖11所述)的預(yù)報(bào)結(jié)果是完全一樣的。
對(duì)于固定引物，較不易分析及辨別單一和二重堿基延伸，因此圖10和圖11的預(yù)報(bào)結(jié)果比圖8和圖9更容易應(yīng)用。然而其優(yōu)點(diǎn)在于能夠使用同一引物跟不同的混合物進(jìn)行接連的反應(yīng)。圖12的雙培育方法亦是依據(jù)此優(yōu)點(diǎn)。
將雙培育方法應(yīng)用在圖7中的引物3，反應(yīng)1內(nèi)靶DNA部分跟固定引物3結(jié)合，隨即加進(jìn)聚合酶和標(biāo)記終止核苷酸ddGTP，但并沒加dNTP。圖7中的SNP是A，在這情況下，標(biāo)記ddGTP沒被編入固定引物。同樣地，如果SNP是T或G，標(biāo)記滲入亦不會(huì)發(fā)生。另一方面，如SNP是C，標(biāo)記ddGTP便可被編入，示意該SNP核苷酸是C。
為發(fā)現(xiàn)C以外的SNP核苷酸，需進(jìn)行反應(yīng)2。把靶多核苷酸另一部分跟反應(yīng)1所用的固定引物結(jié)合，加進(jìn)聚合酶和沒標(biāo)記ddGTP作預(yù)培育，讓任何具SNP核苷酸C的靶多核苷酸作引物延伸，并將此雜交物(引物/靶多核苷酸)洗滌，去掉余量的聚合酶及沒標(biāo)記ddGTP，其后再加入聚合酶與標(biāo)記ddGTP，還有dATP、dTTP或dCTP到各自的A-Mix、T-Mix和G-Mix中作主培育。
在反應(yīng)2的預(yù)培育時(shí)期，具核苷酸C的SNP位會(huì)引發(fā)引物延伸，沒標(biāo)記終止ddGTP會(huì)被編入，但若SNP位是A、T或G，引物延伸便不會(huì)發(fā)生?？墒牵鬝NP位是A，于隨后的主培育中(含標(biāo)記ddGTP和dTTP的T-Mix)，引物會(huì)作二重堿基延伸及編入標(biāo)記。這樣的情況亦發(fā)生在SNP位是T和A-Mix(含標(biāo)記ddGTP和dATP)中，以及SNP位是G和混合物C-Mix(含標(biāo)記ddGTP和dCTP)中。
從反應(yīng)1及反應(yīng)2主培育(載有標(biāo)記ddGTP的A-Mix、T-Mix和G-Mix)中所得到的結(jié)果，已足夠辨別那四個(gè)單倍體SNP以及全部十類雙倍體SNP組合(如圖12所示)。
要根據(jù)圖12分辨出所有單倍體SNP及雙倍體SNP組合，僅需辨別實(shí)驗(yàn)中在“0”和“1x”或“0”和“2x”間的標(biāo)記滲入量，而不需辨別在“1x”和“2x”間的標(biāo)記滲入量。因在采用固定引物的情況下，“1x”和“2x”的標(biāo)記滲入量將難于辨別。如圖12，T/T雙倍體SNP經(jīng)過反應(yīng)2中的主培育后，T-Mix和C-Mix混合物中會(huì)得到“0”標(biāo)記滲入而A-Mix則獲得“2x”滲入。若雙倍體SNP是T/C，T-Mix和C-Mix會(huì)得到“0”標(biāo)記滲入而A-Mix則獲得“1x”滲入。但若只須辨別T/T和T/C，則不用依靠反應(yīng)2中的A-Mix主培育結(jié)果，而可直接從反應(yīng)1(T/T得“0”而T/C得“1x”標(biāo)記滲入)得知。要實(shí)現(xiàn)上述的識(shí)別方法，可采用熒光標(biāo)記鏈終止物ddGTP，并使用感光探測器(如熒光點(diǎn)陣掃描儀或是讀數(shù)器)監(jiān)測固定引物中的熒光標(biāo)記滲入。把對(duì)照混合(對(duì)照-Mix)納入圖12的分析，可進(jìn)一步確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
此項(xiàng)發(fā)明可應(yīng)用到許多反應(yīng)組合，并不限于以上所提及的例子，它們只作引證說明。在沒有偏離其精神及范圍下，通過現(xiàn)有的技術(shù)，要改變與修改此項(xiàng)發(fā)明是可行的。為便于解說，在例子中所用的引物長度極短，但可按使用者需要而變更。
例2中，PCR擴(kuò)增以后，須把引物與擴(kuò)增產(chǎn)物分離。應(yīng)理解若能使引物1及2有別于引物3，便可省略此純化步驟，如所采用的引物1和引物2比引物3長很多(甚至像圖7步驟3所示的二重堿基延伸引物3)。在這情況下，即使DNA擴(kuò)增后沒有純化，而引物1和2仍然存在，也能把那些引物及其延伸產(chǎn)物分辨。一般來說，若要以聚合酶延伸產(chǎn)物大小作識(shí)別，引物3則須少于50堿基，因大多數(shù)質(zhì)譜測試方法僅對(duì)少于50堿基的DNA片斷有效。毛細(xì)管電泳法對(duì)少于100堿基的引物長度分析則更有利。因此，最佳的引物3長度是取決于測試方法。作為非限制性的例子，延伸/終止反應(yīng)中使用的引物可以是在15-55堿基之間。
為便于解說，例1和例2中都用上了短引物，但引物長度可因應(yīng)不同的雜交條件而變更，如圖6所示，序列1及序列2分別跟SNP位相距僅七個(gè)及六個(gè)堿基。但實(shí)際上，序列1和序列2可以是SNP位3’下游及5’上游任何位置。只要SNP 5’旁的堿基可擴(kuò)增，而擴(kuò)增了的產(chǎn)物長度足夠跟圖7的引物3結(jié)合并于隨后的延伸/終止反應(yīng)中讓聚合酶轉(zhuǎn)錄。序列2跟SNP應(yīng)最小相距100堿基，但多過100堿基會(huì)更好，圖6序列1連同序列1與SNP位之間插入的序列的長度應(yīng)與引物3是可比較的。
PCR可以是對(duì)稱性的，即反應(yīng)內(nèi)兩組擴(kuò)增引物的摩爾濃度大約相等，或者可以是非對(duì)稱的，就是其中一組擴(kuò)增引物的摩爾濃度比另一組要多出100倍。
例1顯示了若能從來源物質(zhì)上取得足夠DNA，不用作擴(kuò)增，便可直接進(jìn)行延伸/終止反應(yīng)。同樣地，若采用高敏度引物偵察技術(shù)，所需用的DNA量將更小且無須預(yù)先擴(kuò)增。此外，若采用高特性引物進(jìn)行高特性擴(kuò)增反應(yīng)，則DNA純化是不必要的。
在以上例子中用了DNA以及運(yùn)用了dNTP和ddNTP。所用的聚合酶可以是DNA聚合酶或別的可利用的核酸延伸劑，其原理也許能應(yīng)用于把RNA聚合酶作為終止核苷酸，此RNA聚合酶有合適的3’脫氧NTP或2’，3’雙脫氧NTP。不同的核酸延伸劑最好有不同的核苷酸作鏈延伸及鏈終止。要提供合適的核苷酸輔因子和反應(yīng)條件用于鏈延伸及合適的鏈終止核苷酸用于鏈終止。因此，本專利要求中的延伸劑核苷酸意指用于鏈延伸的核苷酸，但不一定局限于2’-脫氧核苷-5’-三磷酸((dNTP)。
有時(shí)候不需要找到在SNP多態(tài)性中的所有四個(gè)堿基。所以，當(dāng)某特定多態(tài)性只包含兩個(gè)堿基時(shí)，就有可能減少提供全面數(shù)據(jù)結(jié)果所需的并行反應(yīng)數(shù)目。
例如，若只要取得某特定堿基出現(xiàn)于SNP位置上的頻率，如堿基G及其5’緊接著的堿基C，基本上含dCTP和ddGTP的單一反應(yīng)已足夠提供所需結(jié)果。不過，亦可包括含dATP加上ddGTP、dTTP加上ddGTP或只含ddGTP的并行反應(yīng)以作進(jìn)一步確定。亦可省略其中一個(gè)延伸/終止反應(yīng)混合物，從而節(jié)省成本而又不影響結(jié)果。例如圖4的A-Mix便可刪除，僅依靠T-Mix及G-Mix已能夠分辨那四個(gè)SNP核苷酸。又例如只須在多態(tài)性位置上對(duì)預(yù)示某一重大疾病的特定堿基的出現(xiàn)作“是”或“否”的判斷。在此情況下，并行反應(yīng)的數(shù)目亦可減少，從而減低篩選成本。
以固定探針為例，把大量的(96或384)探針固定于固體基質(zhì)上個(gè)別的特定位置。每一個(gè)延伸反應(yīng)能以模板-引物結(jié)合和鏈延伸的單一循環(huán)，或以散布式的復(fù)合性熱循環(huán)，利用范本-引物雜交的熱融解提高敏感性來完成。但是，圖12反應(yīng)2的模板-引物雜交在預(yù)培育步驟后不能融解。
采用小蝦或小牛腸堿性磷酸酶進(jìn)行延伸后處理，把每個(gè)熱循環(huán)后沒滲入的ddNTP去掉。這樣的處理方法，適合于使用毛細(xì)管電泳法監(jiān)測熒光標(biāo)記ddNTP的滲入，因沒滲入的熒光標(biāo)記ddNTP會(huì)跟延伸引物交迭，造成干擾。以磷酸酶去除5’磷酸基，可改變沒滲入熒光標(biāo)記ddNTP的游移速度，從而減少干擾。這樣的處理不須于每個(gè)熱循環(huán)中進(jìn)行，僅在偵察延伸產(chǎn)物之前便可。
此項(xiàng)發(fā)明提供了SNP篩選方法。把多樣的探針固定于一個(gè)芯片上，這樣，可同時(shí)篩選從不同個(gè)體得到的遺傳物質(zhì)及代表不同多態(tài)性的SNP。
據(jù)上述所示，此項(xiàng)發(fā)明具有許多優(yōu)點(diǎn)寧可采用一種而不是四種ddNTP進(jìn)行單一堿基引物延伸有助減低標(biāo)記ddNTP的成本，從而對(duì)大規(guī)模測試及熒光標(biāo)記測試有利。此特點(diǎn)亦適用于其它只容納一種標(biāo)記的偵察方法，如大多數(shù)的放射性或與酶關(guān)聯(lián)的有色標(biāo)記。
滲入檢測只需使用一種鏈終止核苷酸，因此是項(xiàng)多至二重堿基延伸分析為基礎(chǔ)的發(fā)明比其它需要四種標(biāo)記ddNTP作單一堿基延伸的方法更廣為應(yīng)用。像這樣，上述的二重堿基延伸方法可用于未能同時(shí)偵察多樣信號(hào)的技術(shù)平臺(tái)，如不同的熒光標(biāo)記。這樣的平臺(tái)包括固體基質(zhì)上的檢測(像96孔板或基因芯片)，及液態(tài)中延伸探針與沒延伸的分離步驟，如采用高效液相色譜法或毛細(xì)管電泳法。此項(xiàng)發(fā)明中的反應(yīng)混合物能夠迅速地實(shí)現(xiàn)于這些環(huán)境。
從是項(xiàng)發(fā)明衍生出的方法，因其簡易的監(jiān)測及標(biāo)記成本下降，有可能發(fā)展成廣為應(yīng)用的基因分型工具。
二重堿基延伸方法能易于應(yīng)用到易于發(fā)生量誤差的SNP對(duì)偶基因出現(xiàn)率及集合的DNA的聯(lián)系研究。因只用一種ddNTP作二重堿基延伸，ddNTP滲入量的量化比起那些采用具交迭光譜的多至四種不同的熒光染料，會(huì)出現(xiàn)較少實(shí)驗(yàn)變化。
因含不同dNTP的反應(yīng)是單獨(dú)進(jìn)行(如獨(dú)立試管)的，二重堿基延伸方法中所采用的分離技術(shù)亦較簡單，只須分離一種而不是四種沒滲入ddNTP(像在單一堿基延伸進(jìn)行的情況下)便可。
熒光異向性或質(zhì)譜等方法可應(yīng)用到引物延伸的檢測，無須任何分離。熒光異向性能迅速分析如是項(xiàng)發(fā)明中的單一熒光標(biāo)記，比采用四種不同熒光標(biāo)記(像在單一堿基延伸進(jìn)行的情況下)更為實(shí)用。
質(zhì)譜測量法是利用離子化、分離和測量等技術(shù)，并根據(jù)分子離子的質(zhì)量對(duì)電荷比率(mass-to-charge ratio，m/z)，提供有關(guān)分子重量甚至結(jié)構(gòu)上的數(shù)據(jù)。質(zhì)譜儀在無機(jī)、有機(jī)及生物有機(jī)化學(xué)品的分析應(yīng)用上是關(guān)鍵性的，此外，隨著質(zhì)譜法的改進(jìn)及提升，其應(yīng)用更廣。
權(quán)利要求
1.一種檢測靶核苷酸的方法，在核酸分子中有一個(gè)3’末端和一個(gè)5’末端，而該靶核苷酸是位于此核酸分子的3’末端和5’末端之間，該方法包含(a)在眾多的反應(yīng)容器內(nèi)將寡核苷酸引物與核酸分子混合，在其中寡核苷酸引物有一個(gè)自由氫氧基部分在緊鄰靶核苷酸3’端的核酸分子上雜交成一互補(bǔ)序列；(b)供給每一容器相應(yīng)的鏈終止核苷酸，在其中緊接靶核苷酸5’端的一個(gè)相鄰核苷酸與相應(yīng)的鏈終止核苷酸互補(bǔ)；(c)加入獨(dú)特的鏈延伸核苷酸至每一反應(yīng)容器中，在其中每一反應(yīng)容器有相同的相應(yīng)鏈終止核苷酸，但獨(dú)特的鏈延伸核苷酸在每一反應(yīng)容器中則不相同；(d)寡核苷酸引物延伸是通過加入聚合酶反應(yīng)混合物到每一反應(yīng)容器中，并取決于模板；(e)檢測滲入到延伸引物的核苷酸，在其中靶核苷酸本體取決于延伸引物的大小。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中靶核苷酸包含單核苷酸多態(tài)性(“SNP”)，或包含一個(gè)點(diǎn)突變。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中核酸分子包含一個(gè)孤立的基因組的脫氧核糖核酸(“DNA”)分子，或包含一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增了的DNA分子。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中寡核苷酸引物有一長度在約15至55核酸殘基的范圍內(nèi)，或包含一個(gè)附著于固體表面的5’部分。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中鏈終止核苷酸包含一個(gè)在化學(xué)上標(biāo)記了的核苷酸，該在化學(xué)上標(biāo)記了的核苷酸是從包括有放射性同位素，熒光部分及可發(fā)出色彩信號(hào)的酶的組合中挑選出來，或其中鏈終止核苷酸包含一個(gè)雙脫氧核苷三磷酸(“ddNTP”)化合物。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中鏈延伸核苷酸包含一個(gè)脫氧核苷三磷酸(“dNTP”)化合物。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中聚合酶鏈反應(yīng)混合物包含一個(gè)核酸聚合酶和一個(gè)緩沖劑。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中識(shí)別在核酸分子中的靶核苷酸包含用相應(yīng)的預(yù)測要滲入到延伸引物的在化學(xué)上標(biāo)記了的核苷酸，該在化學(xué)上標(biāo)記了的核苷酸是從包括有放射性同位素，熒光部分及可發(fā)出色彩信號(hào)的酶的組合中挑選出來；或其中識(shí)別在核酸分子中的靶核苷酸包含對(duì)延伸引物用相應(yīng)的預(yù)測長度圖表去選配延伸引物在實(shí)驗(yàn)上確定的長度。
9.一種識(shí)別靶核苷酸的方法，在核酸分子中有一個(gè)3’末端和一個(gè)5’末端，而該靶核苷酸是位于此核酸分子的3’末端和5’末端之間，該方法包含a)在眾多的反應(yīng)容器中固定一個(gè)寡核苷酸引物到一個(gè)固體表面上，從而形成一個(gè)固化引物；b)加入核酸分子到眾多的帶有固化引物的反應(yīng)容器中，在其中固化引物有一互補(bǔ)于3’的氫氧基部分在緊鄰靶核苷酸3’端的核酸分子上雜交成一互補(bǔ)序列；c)供給每一容器第一個(gè)相應(yīng)的鏈終止核苷酸，在其中第一個(gè)相應(yīng)的鏈終止核苷酸與靶核苷酸互補(bǔ)；d)當(dāng)眾多預(yù)培養(yǎng)反應(yīng)容器存在預(yù)培養(yǎng)聚合酶反應(yīng)混合物時(shí)，會(huì)得到預(yù)培養(yǎng)引物；e)清洗眾多的反應(yīng)容器，去除預(yù)培養(yǎng)聚合酶反應(yīng)混合物和第一個(gè)相應(yīng)的鏈終止核苷酸；f)供給每一容器第二個(gè)相應(yīng)的鏈終止核苷酸，在其中第二個(gè)相應(yīng)的鏈終止核苷酸與緊鄰靶核苷酸5’端的相鄰核酸互補(bǔ)；g)加入獨(dú)特的鏈延伸核苷酸至每一反應(yīng)容器中，在其中每一反應(yīng)容器有相同的第二個(gè)相應(yīng)鏈終止核苷酸，但獨(dú)特的鏈延伸核苷酸在每一反應(yīng)容器中則不相同；h)寡核苷酸引物延伸是通過加入聚合酶反應(yīng)混合物到每一反應(yīng)容器中，并取決于模板；i)檢測滲入到延伸引物的核苷酸，在其中靶核苷酸本體取決于延伸引物的大小。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，其中靶核苷酸包含單核苷酸多態(tài)性(“SNP”)，或包含一個(gè)點(diǎn)突變。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，其中核酸分子包含一個(gè)孤立的基因組的脫氧核糖核酸(“DNA”)分子，或包含一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增了的DNA分子。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，其中固化引物有一長度在約15至55核酸殘基的范圍內(nèi)。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，其中第一個(gè)鏈終止核苷酸包含一個(gè)雙脫氧核苷三磷酸(“ddNTP”)化合物，或包含一個(gè)在化學(xué)上標(biāo)記了的核苷酸，該在化學(xué)上標(biāo)記了的核苷酸是從包括有放射性同位素，熒光部分及可發(fā)出色彩信號(hào)的酶的組合中挑選出來。
14.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，其中第二個(gè)鏈終止核苷酸包含一個(gè)脫氧核苷三磷酸(“dNTP”)化合物，或包含一個(gè)在化學(xué)上標(biāo)記了的核苷酸，該在化學(xué)上標(biāo)記了的核苷酸是從包括有放射性同位素，熒光部分及可發(fā)出色彩信號(hào)的酶的組合中挑選出來。
15如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，其中鏈延伸核苷酸包含一個(gè)脫氧核苷三磷酸(“dNTP”)化合物，或包含一個(gè)在化學(xué)上標(biāo)記了的核苷酸，該在化學(xué)上標(biāo)記了的核苷酸是從包括有放射性同位素，熒光部分及可發(fā)出色彩信號(hào)的酶的組合中挑選出來。
16.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，其中預(yù)培養(yǎng)聚合酶反應(yīng)混合物包含一個(gè)核酸聚合酶和一個(gè)緩沖劑。
17.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，其中聚合酶反應(yīng)混合物包含一個(gè)核酸聚合酶和一個(gè)緩沖劑。
18.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，其中檢測滲入到延伸引物的核苷酸包含確定延伸引物的長度。
19.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，其中識(shí)別在核酸分子中的靶核苷酸包含對(duì)延伸引物用相應(yīng)的預(yù)測長度圖表去選配延伸引物在實(shí)驗(yàn)上確定的長度。
20.一種識(shí)別靶核苷酸的方法，在核酸分子中有一個(gè)3’末端和一個(gè)5’末端，而該靶核苷酸是位于此核酸分子的3’末端和5’末端之間，該方法包含a)寡核苷酸引物與在溶解液中的核酸分子反應(yīng)成混合物，在其中寡核苷酸引物有一互補(bǔ)3’氫氧基部分在緊鄰靶核苷酸3’端的核酸分子上雜交成一序列；b)等分混合物容積至第一個(gè)，第二個(gè)，第三個(gè)和對(duì)照反應(yīng)容器；c)供給第一個(gè)，第二個(gè)，第三個(gè)和對(duì)照反應(yīng)容器一個(gè)鏈終止核苷酸，在其中鏈終止核苷酸與直接在5’端與靶核苷酸相鄰的核苷酸互補(bǔ)；d)加入獨(dú)特的鏈延伸核苷酸至第一，第二和第三反應(yīng)容器中，在其中獨(dú)特的鏈延伸核苷酸包含一個(gè)核基，它不同于鏈終止核苷酸的核基；e)當(dāng)存在聚合酶反應(yīng)混合物時(shí)，培養(yǎng)第一，第二，第三和對(duì)照反應(yīng)容器去形成零個(gè)-，一個(gè)-，二個(gè)-互補(bǔ)堿基，它伸展到寡核苷酸引物的3’氫氧基部分上去，從而培養(yǎng)了引物；f)分析在每一個(gè)第一，第二，第三和對(duì)照反應(yīng)容器中培養(yǎng)了的引物的零個(gè)-，一個(gè)-或二個(gè)-互補(bǔ)堿基的延伸長度；和g)比較在每一個(gè)第一，第二，第三和對(duì)照反應(yīng)容器中培養(yǎng)了的引物的零個(gè)-，一個(gè)-或二個(gè)-互補(bǔ)堿基的延伸長度去識(shí)別靶核苷酸。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，其中靶核苷酸包含單核苷酸多態(tài)性(“SNP”)，或包含一個(gè)點(diǎn)突變。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，其中核酸分子包含一個(gè)孤立的基因組的脫氧核糖核酸(“DNA”)分子，或包含一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增了的DNA分子。
23.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，其中寡核苷酸引物有一長度在約15至55核酸殘基的范圍內(nèi)，或包含一個(gè)5’端附著于一個(gè)固體表面。
24.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，其中鏈終止核苷酸包含一個(gè)雙脫氧核苷三磷酸(“ddNTP”)化合物，或包含一個(gè)在化學(xué)上標(biāo)記了的核苷酸堿基。
25.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，其中鏈延伸核苷酸包含一個(gè)脫氧核苷三磷酸(“dNTP”)化合物。
26.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，其中聚合酶反應(yīng)混合物包含一個(gè)核酸聚合酶和一個(gè)緩沖劑。
27.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，其中比較在第一，第二，第三和對(duì)照反應(yīng)容器內(nèi)培養(yǎng)了的引物中加入到零個(gè)-，一個(gè)-或二個(gè)-互補(bǔ)堿基延伸長度的互補(bǔ)堿基延伸長度包含利用培養(yǎng)了的引物在第一，第二，第三和對(duì)照反應(yīng)容器內(nèi)的預(yù)測長度圖表，以及，對(duì)在培養(yǎng)了的引物中零個(gè)-，一個(gè)-或二個(gè)-互補(bǔ)堿基延伸長度的實(shí)際核苷酸堿基配對(duì)延伸長度和在培養(yǎng)了的引物中的預(yù)測核苷酸堿基配對(duì)延伸作比較。
28.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，其中預(yù)測長度圖表包含橫標(biāo)題欄展示第一，第二，第三及對(duì)照反應(yīng)容器和單倍體DNA序列，而直標(biāo)題欄在分開的各行中以四種可能的靶核苷酸的核苷酸堿基組合列出核苷酸序列，且在其中在培養(yǎng)了的引物中的零個(gè)-，一個(gè)-或二個(gè)-互補(bǔ)堿基延伸長度的預(yù)測核苷酸延伸數(shù)目在展示四種或十種可能的核苷酸堿基的核苷酸序列的橫標(biāo)題欄和直標(biāo)題欄的交匯處列出。
全文摘要
一種以利用聚合酶之鏈延伸為基礎(chǔ)而將核酸內(nèi)之單核苷酸多態(tài)性(SNP)與點(diǎn)突變作基因分型的方法。本發(fā)明是根據(jù)下列事實(shí)緊鄰在任何一個(gè)SNP/點(diǎn)突變位置之5′端的核苷是已知的，且緊接于該位置之3′端的相鄰序列也是已知的。一個(gè)互補(bǔ)于緊鄰在靶多核苷酸內(nèi)SNP3′側(cè)之序列的引物被用于鏈延伸。聚合酶反應(yīng)混合物包含有一個(gè)鏈終止核苷酸，該鏈終止核苷酸所具的堿基互補(bǔ)于緊鄰該靶多核苷酸之SNP5′側(cè)的核苷酸。可加入一個(gè)額外的dNTP以產(chǎn)生一個(gè)最多有兩個(gè)堿基延伸的引物。對(duì)引物的鏈延伸長度或者從終止核苷酸標(biāo)記了的形式滲入的標(biāo)記量，以所形成的延長/終止反應(yīng)產(chǎn)物來分析。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1670222SQ20041002952
公開日2005年9月21日 申請(qǐng)日期2004年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月18日
發(fā)明者薛紅, 王子暉 申請(qǐng)人:華晶基因技術(shù)有限公司