專利名稱：小球藻營養(yǎng)缺失突變體的高效表達(dá)體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中生物體轉(zhuǎn)化及生產(chǎn)技術(shù)。即以導(dǎo)入外源基因的小球藻營養(yǎng)缺失突變體為表達(dá)體系，通過轉(zhuǎn)基因藻的繁殖，規(guī)模生產(chǎn)目的基因的產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
小球藻在植物分類學(xué)上屬綠藻綱綠球藻目小球藻科，是具有原始形態(tài)的單細(xì)胞真核藻類，大約在20億年前就出現(xiàn)在地球上。通常在淡水中進(jìn)行浮游生活，形狀呈球形或橢圓形，直徑3-12微米，細(xì)胞壁平滑，進(jìn)行無性分裂繁殖，分裂周期為10-20小時(shí)。目前世界上已知的小球藻有15種左右，加上它的變種可達(dá)數(shù)百種之多，且分布范圍廣泛，生態(tài)習(xí)性多樣。小球藻具有很強(qiáng)的光合作用能力，它通過空氣中的二氧化碳和水在陽光的照射下能合成包括蛋白質(zhì)在內(nèi)的各種有機(jī)物。如用有機(jī)物做為碳源也能進(jìn)行無光繁殖。因此，小球藻外源基因表達(dá)體系的培養(yǎng)簡單，生產(chǎn)成本低。
近年來，隨著藻類分子遺傳學(xué)的發(fā)展，將外源基因?qū)朐孱惒⒏咝П磉_(dá)，把藻類作為新型的生物反應(yīng)器，生產(chǎn)貴重的藥品，保健品和精細(xì)化工產(chǎn)品，以及通過基因工程方法提高藻類蛋白含量，改善其營養(yǎng)品質(zhì)是近年來藻類生物技術(shù)發(fā)展的主要趨勢之一。
做為單細(xì)胞真核藻類與大型藻類相比具有以下特點(diǎn)一其培養(yǎng)條件簡單，生產(chǎn)成本低；二繁殖迅速；三體積相對較小，結(jié)構(gòu)簡單，便于外源基因表達(dá)產(chǎn)物的提取。小球藻硝酸還原酶功能缺失突變體在利用氮源上有一定的缺陷，不能在以硝酸鹽為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長，其余的生理功能與普通的小球藻是一樣的。因此硝酸還原酶基因就可以作為轉(zhuǎn)基因藻的篩選標(biāo)記基因，賦予轉(zhuǎn)基因藻利用硝酸鹽的能力。該篩選標(biāo)記是與抗生素篩選標(biāo)記相比，成本低廉、安全性好，不存在對環(huán)境污染的風(fēng)險(xiǎn)，這是本項(xiàng)目的特色。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在建立成熟的小球藻營養(yǎng)缺失突變體外源基因轉(zhuǎn)化體系，將目前從動物、植物、微生物中分離到的基因通過電擊穿孔轉(zhuǎn)化技術(shù)導(dǎo)入小球藻營養(yǎng)缺失突變體中，使其成為新型高效的生物反應(yīng)器，低成本地規(guī)模生產(chǎn)有用產(chǎn)品，特別是來源緊俏、造價(jià)昂貴的藥物。本發(fā)明主要包括以下八方面的技術(shù)一、小球藻硝酸還原酶功能缺失突變體的培養(yǎng)技術(shù)；二、小球藻中硝酸還原酶基因的克隆技術(shù)；三、哺乳動物防御素的小球藻表達(dá)載體構(gòu)建；四、病毒乙肝疫苗基因小球藻表達(dá)載體構(gòu)建；五、植物天麻凝集素的小球藻表達(dá)載體構(gòu)建。
六、用電擊穿孔法將外源目的基因?qū)胄∏蛟宓募夹g(shù)；
七、轉(zhuǎn)基因小球藻的篩選、分離純化技術(shù)；八、轉(zhuǎn)基因小球藻中外源基因產(chǎn)物的分離提取技術(shù)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1小球藻營養(yǎng)缺失突變體的培養(yǎng)技術(shù)小球藻硝酸還原酶功能缺失突變體的培養(yǎng)基成份為(NH4)2SO41.0g/l，K2HPO40.2g/l，MgSO4·7H2O 0.2g/l，KCl 0.12g/L，F(xiàn)eCl310mg/l，附加0.4％的葡萄糖。
固體培養(yǎng)液體培養(yǎng)基附加1.8％的瓊脂，劃線培養(yǎng)使藻長成單藻落。
液體培養(yǎng)將在固體培養(yǎng)基中生長的直徑約1mm左右的單藻落接種于20ml液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如下轉(zhuǎn)速120-130rpm，溫度20-25℃，每天光照培養(yǎng)16小時(shí)，光照條件3000-4000lux，黑暗培養(yǎng)8小時(shí)。在這樣的培養(yǎng)條件下，小球藻營養(yǎng)缺失突變體生長良好。
由于藻類極易與菌類共生，因此在未長出菌落之前，將單藻落在固體培養(yǎng)基上劃線，經(jīng)幾次繼代直到無菌落出現(xiàn)為止。
實(shí)施例2小球藻硝酸還原酶基因的克隆和特性分析通過對擬南芥、萊茵衣藻等NR基因的氨基酸功能區(qū)進(jìn)行分析，根據(jù)它們的氨基酸最保守的功能區(qū)序列及小球藻密碼子的偏愛性，設(shè)計(jì)兼并引物，通過RT-PCR和5′RACE的方法，克隆了橢圓小球藻全長的NR基因的cDNA序列3304bp，該序列已經(jīng)提交GenBank，接收號為AY275834。該cDNA編碼898個(gè)氨基酸，編碼這些氨基酸的密碼子多偏愛G/C。NR具有Molyb氧化區(qū)、MoCo二聚體結(jié)合區(qū)、Heme區(qū)、FAD結(jié)合區(qū)及NAD結(jié)合區(qū)五個(gè)保守的功能區(qū)。同時(shí)通過RT-PCR的方法，對該基因在不同氮鹽(硝酸鹽、銨鹽及無任何氮鹽)處理的情況下的mRNA豐度定量，結(jié)果表明該基因的mRNA在有銨鹽存在的情況下幾乎檢測不到，具有非常低的量。而在含有硝酸鹽或沒有氮鹽的情況下，其mRNA強(qiáng)度則較強(qiáng)，在硝酸鹽中，強(qiáng)度最大。這和在高等植物中的表達(dá)調(diào)控是不同的，在高等植物中只有在硝酸鹽誘導(dǎo)的情況下才具有較強(qiáng)的活性，在不含有氮鹽時(shí)，mRNA的表達(dá)量是很弱的。
實(shí)施例3以硝酸還原酶為篩選標(biāo)記的防御素小球藻表達(dá)載體構(gòu)建首先構(gòu)建含硝酸還原酶完整基因的質(zhì)粒載體。將PCR擴(kuò)增得到的硝酸還原酶下游啟動子NRPro用HindIII酶切開成線形，37℃3hr，酶切體系20μl，質(zhì)粒DNA約1μg，10×buffer2μl，HindIII 3U在酶切體系中加1mmoldNTP，0.5μl Klenow酶，37℃溫育30min，75℃ 10min終止反應(yīng)，回收片段備用。
同樣的方法將pBluescript SK的用EcoRI酶切，得到線形分子。載體pGEMT-NR2.8也用EcoRI酶切，得到2.8KB的NR基因。連接兩酶切產(chǎn)物，連接比例為1∶1.5，45℃溫育5分鐘，冰上放置2分鐘，加入0.5μlT4DNA連接酶，1μl 10×buffer用無菌水補(bǔ)至10μl，4℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，蘭白斑篩選陽性克隆，并進(jìn)行酶切鑒定，鑒定正確的即為質(zhì)粒載體pSK-NR2.8?；厥眨賹⑵溆肏indIII酶切，37℃3hr，酶切體系20μl，質(zhì)粒DNA約1μg，10×buffer2μl，SmaI3U在酶切體系中加1mmoldNTP，0.5μl Klenow酶，37℃溫育30min，75℃ 10min終止反應(yīng)，回收片段，產(chǎn)物與上述NRPro連接，連接比例為1∶1.5，45℃溫育5分鐘，冰上放置2分鐘，加入0.5μlT4DNA連接酶，1μl 10×buffer用無菌水補(bǔ)至10μl，4℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，篩選陽性克隆并進(jìn)行酶切鑒定，鑒定正確的即為質(zhì)粒載體pSK-NRPro-NR2.8。
從工具載體pBI101上PCR擴(kuò)增nos中止子，用酶XbaI和NotI切，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μg中加入XbaI和NotI各3U，兩者10xbuffer 2μl，加水補(bǔ)至20μl，37℃酶切3小時(shí)，用試劑盒回收小片段nos。用同樣的方法，同樣的酶來切pSK-NRPro-NR2.8，連接兩酶切產(chǎn)物，連接比例為1∶1.5，45℃溫育5分鐘，冰上放置2分鐘，加入0.5μlT4DNA連接酶，1μl 10×buffer用無菌水補(bǔ)至10μl，4℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，篩選陽性克隆并進(jìn)行酶切鑒定，鑒定正確的即為NRPro-NR2.8，中止子nos相串連的載體pBluescriptSK-NR。
工具載體pBinUΩNP1中含有串聯(lián)的Ubiquitin啟動子，Ω增強(qiáng)子，NP1基因和nos中止子，nos中止子下游帶有EcoRI酶切位點(diǎn)，首先用該酶將pBinUΩNP1切開成線形，37℃3hr，酶切體系20μl，質(zhì)粒DNA約1μg，10×buffer2μl，EcoRI 3U在酶切體系中加1mmoldNTP，0.5μl Klenow酶，37℃溫育30min，75℃ 10min終止反應(yīng)。Klenow酶補(bǔ)平，回收，回收試劑盒購自鼎國生物技術(shù)有限公司。用同樣的實(shí)驗(yàn)方法將已構(gòu)建好的硝酸還原酶表達(dá)載體pBluescript SK-NR用BssHII酶切下NR基因，兩端補(bǔ)平后，與上述線形pBinUΩNP1酶切回收產(chǎn)物連接，連接體系同上。產(chǎn)物即為我們的目的載體pBinUΩNP1-NR。直接通過基因槍或電激法轉(zhuǎn)化硝酸還原酶缺失突變體小球藻，得到的轉(zhuǎn)基因藻可以恢復(fù)其在硝酸鹽的培養(yǎng)基上正常生長的能力。從該轉(zhuǎn)基因小球藻分離純化獲得了防御素NP-1。
實(shí)施例4乙肝疫苗的小球藻表達(dá)載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的工具載體pBinUΩNP1-NR，NP1片段兩端為BamHI和SacI酶切位點(diǎn)，首先取5μl pBinUΩNP1-NR，加入BamHI 3U，10×buffer2μl，0.5μl Klenow酶，無菌水補(bǔ)至20μl，37℃溫育3小時(shí)，回收線狀片段。大片段pBinU-NR。同法再將其用SacI酶切，但不加Klenow酶，完成后，回收大片段pBinU-NR。將含有乙肝疫苗基因(HbsAg)的工具載體pUΩHBsAg同樣用XbaI和SacI酶切，酶切體系20μl，同質(zhì)粒載體pBinUΩNP1-NR。切下的HbsAg基因回收后與pBinU-NR片段連接，連接比例為2∶1，45℃溫育5分鐘，以解開粘端，冰上放置2分鐘，加入0.5μlT4DNA連接酶，1μl 10×buffer無菌水補(bǔ)至10μl，4℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，篩選陽性克隆并進(jìn)行酶切鑒定，鑒定正確的即為乙肝疫苗的小球藻表達(dá)載體pBinUΩHBsAg-NR。此載體直接通過基因槍或電激法轉(zhuǎn)化小球藻營養(yǎng)缺失突變體，得到的轉(zhuǎn)基因藻在硝酸鹽培養(yǎng)基上正常生長，并檢測到了其表達(dá)的乙肝抗原蛋白。
實(shí)施例5植物天麻凝集素的小球藻表達(dá)載體構(gòu)建天麻凝集素(Gastrodia Antifungal Protein簡稱GAFP)來自傳統(tǒng)中藥天麻的一種抗真菌蛋白，對許多植物的病原菌都有非常強(qiáng)的抑制作用，在抗病基因工程中有非常重要的應(yīng)用。
工具載體pBinUΩNP1上Ω增強(qiáng)子，NP1基因兩端的酶切位點(diǎn)分別是BamHI和SacI。首先取5μl pBinUΩNP1-NR，加入BamHI 3U，10×buffer2μl，0.5μl Klenow酶，無菌水補(bǔ)至20μl，37℃溫育3小時(shí)，回收線狀片段pBinUΩNP1-NR。然后取5μl線狀pBinUΩNP1-NR，加入SacI 3U，10×buffer2μl，無菌水補(bǔ)至20μl，37℃溫育3小時(shí)，回收大片段pBinU-nos。
同樣的方法將工具載體pBI35SGAFP-Bar先用酶XbaI切，補(bǔ)平，再用SacI酶切，得到GAFP基因片段。將pBinU-nos與GAFP基因片段連接，連接比例為2∶1，45℃溫育5分鐘，以解開粘端，冰上放置2分鐘，加入0.5μlT4DNA連接酶，1μl 10×buffer無菌水補(bǔ)至10μl，4℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，篩選陽性克隆并進(jìn)行酶切鑒定，鑒定正確的即為植物天麻凝集素的小球藻表達(dá)載體pBinUGAFP-NR。通過基因槍法或電穿孔方法將此載體導(dǎo)入小球藻營養(yǎng)缺失突變體，得到的表達(dá)天麻凝集素的轉(zhuǎn)基因小球藻在硝酸鹽為唯一氮源的培養(yǎng)基上正常生長。
實(shí)施例6用電擊法將外源目的基因?qū)胄∏蛟宓募夹g(shù)取培養(yǎng)第四天的小球藻培養(yǎng)液，1000rpm離心10min，棄上清，用含有0.2M甘露醇和0.2M山梨醇的培養(yǎng)液處理2hr，1000rpm離心10min，棄上清，加入一定量的小球藻液體培養(yǎng)液，使其密度達(dá)到107-108個(gè)/ml，加入電擊緩沖液(Electroporation buffer)，成分為(80mM KCl，5mM CaCl2，10mM HEPES(N-2-Hydrox-yethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid，0.425MMannitol，pH 7.2)，使其密度達(dá)107-108個(gè)/ml。同時(shí)加入終濃度為10μg/ml的質(zhì)粒DNA及25μg/ml的鮭精DNA，混勻后，在冰上放置5-10min，吸取0.4ml置于轟擊小室中待用。
采用Baekon2000型電擊儀進(jìn)行電擊，電壓為9.5KV，每次電擊時(shí)間為0.05sec，電擊次數(shù)為210，循環(huán)次數(shù)為100次，電擊高度為2mm，每次電擊間隔時(shí)間為62.5sec。
實(shí)施例7轉(zhuǎn)基因小球藻的篩選分離與純化取電擊轉(zhuǎn)化法的小球藻0.4ml，鋪于以硝酸鹽為唯一氮源的固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行篩選培養(yǎng)。非轉(zhuǎn)基因的小球藻因?yàn)橄跛徇€原酶功能的缺陷，在篩選培養(yǎng)基上是不能生長的，只有轉(zhuǎn)基因的藻株才能生長，在適宜培養(yǎng)條件下，3-4周后形成菌落，用牙簽將此菌落挑取后，分別懸浮培養(yǎng)于只以硝酸鹽為氮源的20ml液體培養(yǎng)基中，以后不斷繼代培養(yǎng)，大量繁殖后再進(jìn)行外源基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測。
實(shí)施例8轉(zhuǎn)基因小球藻中外源基因產(chǎn)物的分離純化與活性測定(以防御素為例)轉(zhuǎn)基因小球藻在含硝酸鹽的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期時(shí)，8000rpm離心5分鐘收獲細(xì)胞，用3倍體積的磷酸緩沖液(PBS)重懸細(xì)胞后，同樣條件下離心收獲細(xì)胞，然后再用PBS(W/V＝1/2)重懸細(xì)胞，400V超聲破碎1分鐘，4℃放置2-4hr后，12000rpm離心10分鐘，棄沉淀，上清放入50ml離心管中，沸水浴中煮10分鐘，將再次12000rpm離心10分鐘后的上清過SephadexG-50分子篩柱，收集第二個(gè)峰，用無離子水充分透析后，凍干成粉末，即得到較為純凈的防御素蛋白。
活性測定以大腸桿菌為指示菌，將37℃培養(yǎng)過夜的大腸桿菌100ul涂布在LB固體培養(yǎng)基上，待表面液體消失后，用無菌打孔器在培養(yǎng)基上做點(diǎn)樣孔(孔徑1cm)，吸取200ul待測樣品加入孔中，對照是野生型小球藻的蛋白提取液，37℃培養(yǎng)過夜，觀察到指示菌生長受抑制的情況，從而確定樣品中活性成分的含量。
權(quán)利要求
1.一種小球藻的外源基因表達(dá)體系，該體系轉(zhuǎn)基因小球藻含有外源目的基因、篩選標(biāo)記基因，并能產(chǎn)生外源基因的產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)體系，其特征在于用小球藻硝酸還原酶功能缺失突變體為載體，突變體在以硝酸鹽為唯一氮源的培養(yǎng)基上是不能生長的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)體系，其特征在于用電擊穿孔法將外源基因?qū)胄∏蛟鍫I養(yǎng)突變體并得到表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其特征在于將來自人與哺乳動物的基因，如防御素基因和抗菌肽基因等導(dǎo)入小球藻營養(yǎng)突變體中，并得到表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其特征在于將來自病毒等的基因，如乙肝疫苗基因?qū)胄∏蛟逯?，并得到表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其特征在于將來自高等植物的基因，如天麻凝集素基因?qū)胄∏蛟逯校⒌玫奖磉_(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其特征在于導(dǎo)入外源基因后，以硝酸鹽基因作為轉(zhuǎn)基因小球藻的篩選標(biāo)記，轉(zhuǎn)基因小球藻可以在以硝酸鹽為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長。
全文摘要
本發(fā)明將外源目的基因?qū)氲叫∏蛟鍫I養(yǎng)缺失突變體中，以硝酸還原酶基因作為篩選基因，以硝酸鹽作為轉(zhuǎn)基因藻的篩選標(biāo)記，建立了成熟的小球藻外源基因轉(zhuǎn)化體系，可將目前從動物、植物中分離到的基因通過基因槍、電擊穿孔轉(zhuǎn)化技術(shù)導(dǎo)入小球藻營養(yǎng)缺失突變體中，使其成為新型高效的生物反應(yīng)器，可大量、低成本地生產(chǎn)有用產(chǎn)品，特別是緊俏價(jià)高的各種生物活性物質(zhì)、生長因子等藥物的規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/12GK1676597SQ200410029679
公開日2005年10月5日 申請日期2004年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月31日
發(fā)明者王義琴, 孫勇如, 王鵬, 張利明, 李文彬, 趙世民, 白琴華, 張小宇, 李霞 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所