專利名稱：一種人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的方法，具體地說涉及一種調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的新方法。
背景技術(shù)：
通過組織工程技術(shù)體外分離和培養(yǎng)所需的靶細(xì)胞用于體內(nèi)相關(guān)疾病的細(xì)胞或組織替代治療已為多種臨床疾病的治療提供了新的途徑，近年來受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注和重視。但由于多種組織細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)難度極大，限制了這一技術(shù)的開展和推廣。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源較廣泛，取材較方便，可以分化為骨、軟骨、腱、肌肉、韌帶、血管內(nèi)皮、肝、神經(jīng)、皮膚和脂肪等多種組織細(xì)胞，分離培養(yǎng)較為容易，且植入反應(yīng)較弱，是一種良好的替代治療的靶細(xì)胞。在組織器官性損傷疾病、組織器官退行性疾病、遺傳缺陷疾病等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。目前通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單獨(dú)應(yīng)用可以較好地促進(jìn)骨折愈合和軟骨組織損傷修復(fù)，通過體外培養(yǎng)使其覆蓋于陶瓷支架和碳纖維網(wǎng)等再植入患處效果更明顯。國外還開展了將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于治療因I型膠原基因突變導(dǎo)致的兒童骨發(fā)育不良的臨床實(shí)驗(yàn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植還具有不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)或程度較低的優(yōu)點(diǎn)，而且易于控制。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不僅具有多向分化潛能，還易于外源基因的導(dǎo)入和表達(dá)，因而，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有可能成為一種新型的基因治療的靶細(xì)胞，這樣再與其多向分化潛能相結(jié)合，通過導(dǎo)入目的基因，將細(xì)胞治療和基因治療結(jié)合起來，對上述疾病的治療無疑將有更廣闊的前景。
研究人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的重要性主要是其潛在的治療應(yīng)用價值，目前，用于臨床治療的人間充質(zhì)干細(xì)胞主要來源于骨髓。盡管骨髓樣品易獲取，但其中間充質(zhì)干細(xì)胞含量較少，約占骨髓單個核細(xì)胞的10萬分之一；特別是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外無血清培養(yǎng)條件下，增殖緩慢，并且隨著傳代次數(shù)的增加而處于負(fù)增殖狀態(tài)，因此，獲得充足、安全而合格的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是研究和應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療疾病的前提條件。然而，目前還沒有一條切實(shí)可行的生理方法來促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外增殖。
氧是生命存在的必要條件，也是細(xì)胞生理功能的一種重要調(diào)節(jié)因子。而低氧是生命發(fā)育的基本環(huán)境，如哺乳動物的胚胎是在低氧環(huán)境中發(fā)育生長的；成體哺乳動物腦組織內(nèi)的局部氧水平也只有1％～5％，骨髓中的氧濃度為4％～7％，均是一種生理性的低氧環(huán)境。然而，目前體外哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)條件是在37℃下，5％二氧化碳和95％空氣的混合氣(氧含量是20％)。近年來關(guān)于低氧對干細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用研究只有零星的報道，2000年SeanJ.Morrison and Studer Lorenz分別研究報道低氧(3％)可促進(jìn)來源于胎鼠的外周神經(jīng)嵴干細(xì)胞(Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenicsympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells.JNeurosciencce，2000，207370-7376)和中樞神經(jīng)前體細(xì)胞(Enhanced proliferation，survival，and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen.JNeurosciencce，2000，207377-7383)的增殖；5％氧氣可促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖(Lennon DP，et al.Cultivation of rat marrow-derived mesenchymal stemcell in reduced oxygen tensioneffects on in vitro and in vivo osteochondrogenesis.J Cell Physiol，2001，187345-355)。然而，迄今未見有關(guān)低氧對體外培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖影響的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的新方法。
本發(fā)明的發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)中意外的發(fā)現(xiàn)適宜的低氧濃度對體外培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有促進(jìn)其增殖作用，使這些細(xì)胞能夠繼續(xù)保持增殖狀態(tài)。
本發(fā)明的方法包括以下內(nèi)容人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定抽取胎兒股骨骨髓，移入含DMEM-LG培養(yǎng)基的離心管中，離心去脂肪及上清，向細(xì)胞團(tuán)加入Percoll分離液，離心。取界面云霧狀細(xì)胞層加入DMEM-LG，吹打成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)有核細(xì)胞，將細(xì)胞接種于25ml培養(yǎng)瓶中，進(jìn)行常規(guī)原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。
用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，當(dāng)蓋玻片上的細(xì)胞融合約50％時，取出蓋玻片，用PBS沖洗，室溫自然風(fēng)干，酒精固定，蒸餾水洗；用TritonX-100和雙氧水處理；滴加正常羊血清室溫封閉；分別滴加一抗工作液和生物素化二抗；用DAB試劑盒室溫顯色；蘇木精輕度復(fù)染，脫水、透明、中性樹膠封片。
低氧對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的促增殖作用將傳代的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)分別放在含氧量為20％的常氧和含氧量分別為3％和10％的低氧環(huán)境中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察在低氧環(huán)境中培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞較多。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，與常氧對照組相比，3％低氧組和10％低氧組hMSCs數(shù)量均顯著增多(P＜0.001)，并且3％低氧組hMSCs數(shù)量較10％低氧組明顯增多(P＜0.01)。用流式細(xì)胞儀測定hMSCs的DNA含量，發(fā)現(xiàn)常氧對照組的hMSCs中只有很少的細(xì)胞處于分裂期，增殖指數(shù)均值為5.27％，說明有5.27％細(xì)胞處于分裂期，有近95％的細(xì)胞處于G0/G1期。與常氧對照組相比，3％低氧組和10％低氧組hMSCs增殖指數(shù)均顯著增高(P＜0.001)，并且3％低氧組hMSCs增殖指數(shù)較10％低氧組明顯增高(P＜0.01)。
綜上所述，低氧可促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外增殖，使這些細(xì)胞能夠繼續(xù)保持增殖狀態(tài)。利用環(huán)境中的低氧調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，具有實(shí)驗(yàn)流程簡單，重復(fù)性強(qiáng)，結(jié)果可靠，在體外易調(diào)控，對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無損傷和毒副作用，實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn)。


圖1.為體外培養(yǎng)接近融合的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖(×100)。
圖2.為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定圖。
圖3.為低氧對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量的作用圖。(p＜0.001)圖4.為低氧對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖指數(shù)的作用圖。(p＜0.001)具體實(shí)施方式
實(shí)施例一人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定1.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)無菌抽取胎兒(6個月水囊引產(chǎn)胎兒，經(jīng)產(chǎn)婦知情同意提供)股骨骨髓約1ml，移入含3ml DMEM-LG培養(yǎng)基(Hyclone公司產(chǎn)品)的無菌離心管中，900g離心5min。去脂肪及上清，向細(xì)胞團(tuán)加入70％Percoll分離液(Pharmacia公司產(chǎn)品)，900g離心30min。取界面云霧狀細(xì)胞層加入含20％胎牛血清的DMEM-LG，吹打成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)有核細(xì)胞，將細(xì)胞以105個/ml的密度接種于25ml培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后更換新鮮培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞，以后每3～4d換液一次。當(dāng)細(xì)胞相互融合達(dá)到約90％的生長表面(見圖1)時，用0.25％胰蛋白酶消化分散細(xì)胞，以1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
2.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定當(dāng)培養(yǎng)瓶中蓋玻片上的細(xì)胞融合約50％時，取出蓋玻片，0.01M PBS沖洗，室溫自然風(fēng)干，95％酒精固定30min，蒸餾水洗；0.2％TritonX-100處理10min，0.5％雙氧水10min；滴加正常羊血清，室溫封閉20min，甩去多余液體；滴加一抗工作液(小鼠抗人Vimentin，購自北京中山生物公司)，4℃過夜，0.01M PBS洗；滴加生物素化二抗，37℃ 20min，0.01M PBS洗；滴加SABC，37℃ 20min，0.01M PBS洗；用DAB試劑盒室溫顯色；蘇木精輕度復(fù)染，脫水、透明、中性樹膠封片。在顯微鏡下計(jì)數(shù)結(jié)果顯示98％細(xì)胞Vimentin陽性(見圖2)。
實(shí)施例二低氧環(huán)境對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的促增殖作用1.實(shí)驗(yàn)分組及低氧條件的確定實(shí)驗(yàn)分3組，分別為常氧對照組(20％O2)3％低氧組(3％O2)和10％低氧組(10％O2)。自制細(xì)胞低氧培養(yǎng)箱，向密閉箱中分別通入含3％或10％O2，5％CO2和氮?dú)馄胶獾幕旌蠚怏w，開始通氣量1L/min，持續(xù)通氣30min后，調(diào)整至維持量0.1L/min繼續(xù)通氣，保持密閉容器內(nèi)的氧含量分別為3％或10％O2。
2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的檢測方法1)細(xì)胞計(jì)數(shù)法將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別放在不同氧濃度的環(huán)境中培養(yǎng)3天后，用0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞，并用含胎牛血清的培養(yǎng)液終止，制成單個細(xì)胞懸液，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。每組8皿，計(jì)算其平均值，組間比較用非配對Student’s T-test。
2)細(xì)胞周期的測定將培養(yǎng)3d的hMSCs消化，體積分?jǐn)?shù)為75％冷乙醇4℃固定24h；離心去除乙醇，0.1M PBS洗滌細(xì)胞2遍，將細(xì)胞懸浮于0.5ml PBS中，加入10mg/mlRNase A 10μl，37℃水浴孵育30min后，立即放入冰浴中；加入5mg/100ml溴化乙錠(PI，Sigma公司產(chǎn)品)染色(4℃，避光30min)，用流式細(xì)胞儀(FACSCalibur型，Becton Dickinson產(chǎn)品)檢測并分析結(jié)果。
3.低氧環(huán)境對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的促增殖作用將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別放在常氧(含氧量為20％)和低氧(含氧量分別為3％和10％)環(huán)境中培養(yǎng)3天，顯微鏡下觀察在低氧環(huán)境中培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增多。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果與常氧對照組相比，3％低氧組和10％低氧組hMSCs數(shù)量均顯著增多(P＜0.001)，并且3％低氧組hMSCs數(shù)量較10％低氧組明顯增多(P＜0.01)(見表1和圖3)。用流式細(xì)胞儀測定hMSCs的DNA含量，發(fā)現(xiàn)常氧對照組的hMSCs中只有很少的細(xì)胞處于分裂期，增殖指數(shù)均值為5.27％，說明有5.27％細(xì)胞處于分裂期，有近95％的細(xì)胞處于G0/G1期。與常氧對照組相比，3％低氧組和10％低氧組hMSCs增殖指數(shù)均顯著增高(P＜0.001)，并且3％低氧組hMSCs增殖指數(shù)較10％低氧組明顯增高(P＜0.01)(見表2和圖4)。
表1.低氧和CoCl2對hMSCs(5×103)數(shù)量的影響

*Significantly higher(P＜0.001)than cell yield for hMSCsmaintained in control oxygen when data are analyzedwith the paired t-test.
表2.低氧和CoCl2對hMSCs增殖指數(shù)(％)的影響

*P＜0.00權(quán)利要求
1.一種人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增的新方法，其特征在于采用低氧環(huán)境，促進(jìn)體外培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所說的低氧環(huán)境為氧濃度低于20％的環(huán)境。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于低氧環(huán)境中氧的濃度為3％至10％。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于低氧環(huán)境中的氧濃度為3％。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于低氧環(huán)境中的氧濃度為10％。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增的新方法。本發(fā)明通過適宜的低氧濃度對體外培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)，使這些細(xì)胞能夠繼續(xù)保持較高的增殖狀態(tài)。通過本發(fā)明的方法，采用一種可調(diào)控的無損傷的物理手段，體外調(diào)節(jié)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，實(shí)現(xiàn)少量取樣、體外擴(kuò)增、大量獲取，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)應(yīng)用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療多種臨床損傷疾病、退行性疾病、遺傳缺陷疾病等，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
文檔編號C12N5/08GK1676603SQ20041002984
公開日2005年10月5日 申請日期2004年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月30日
發(fā)明者李海生, 趙彤, 朱玲玲, 丁愛石, 趙惠卿, 范明 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所