專利名稱：人高密度脂蛋白受體表達(dá)上調(diào)劑篩選模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩選人高密度脂蛋白受體表達(dá)上調(diào)劑的方法，其用于從組合化學(xué)庫、微生物次級代謝產(chǎn)物庫以及天然產(chǎn)物庫中高通量篩選人高密度脂蛋白受體表達(dá)上調(diào)劑。
背景技術(shù)：
冠心病(coronary heart disease，CHD)等心血管疾病嚴(yán)重危害人類健康，而動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是其主要病理基礎(chǔ)。流行病學(xué)和臨床研究表明，血漿中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平與AS的發(fā)病率呈正相關(guān)，而高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平則與AS的發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)。膽固醇攝取的LDL受體調(diào)節(jié)通路的發(fā)現(xiàn)及他汀類藥物的廣泛應(yīng)用使得發(fā)達(dá)國家心血管疾病致死率下降了50％以上，盡管如此，心血管疾病仍是發(fā)達(dá)國家和大多數(shù)發(fā)展中國家的主要健康殺手。
為更有效地降低心血管疾病的危害，在利用現(xiàn)有藥物降低血漿中LDL-C的同時，還必須從預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)AS的新的治療靶點(diǎn)出發(fā)，來尋找具有新作用機(jī)制的藥物。
近年來的研究表明，HDL的抗AS作用主要基于HDL參與的膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport，RCT)過程，并確定以前發(fā)現(xiàn)的清道夫受體SR-BI即為功能性的HDL受體[1]，在RCT過程中起著關(guān)鍵作用，被認(rèn)為是發(fā)現(xiàn)新型心血管藥物的有潛力的新靶標(biāo)[2]。膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的增強(qiáng)將有利于動脈粥樣硬化病灶積蓄的膽固醇減少和病變的逆轉(zhuǎn)，因此可以通過升高SR-BI表達(dá)來加速RCT過程，促進(jìn)機(jī)體富余膽固醇酯的清除。
由上述可知，能升高SR-BI基因表達(dá)的化合物有望開發(fā)成為有效治療動脈粥樣硬化性心血管疾病的新型藥物[2，6，7，8]。
隨著組合化學(xué)、天然產(chǎn)物化學(xué)和藥物篩選技術(shù)的迅猛發(fā)展，藥物的高通量篩選(high throughput screening，HTS)已成為新藥早期發(fā)現(xiàn)的重要手段。構(gòu)建新型的適于高通量篩選的藥物篩選模型是新藥發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)?；跈z測報告基因的藥物篩選方法近年來取得了較大的進(jìn)展和廣泛的應(yīng)用[9]。利用基于檢測報告基因的藥物篩選方法已篩選到細(xì)胞因子、激素等的受體激動劑[10，11]以及人LDL受體表達(dá)上調(diào)劑[12，13，14]等。
本發(fā)明人以人高密度脂蛋白受體SR-BI為靶點(diǎn)，成功構(gòu)建了新型抗動脈粥樣硬化藥物的高通量篩選模型，用于從大量微生物代謝產(chǎn)物和待測化合物中篩選人高密度脂蛋白受體SR-BI的上調(diào)劑，并利用所述模型獲得了具有上調(diào)人高密度脂蛋白受體活性的代謝產(chǎn)物。

發(fā)明內(nèi)容
在人和一些動物模型中，血漿中HDL膽固醇(通常被稱為“好膽固醇”)與AS的發(fā)病率成反比。近年來對HDL功能受體SR-BI與AS關(guān)系的研究表明，SR-BI具有抗AS的作用。Trigatti等[4]發(fā)現(xiàn)在ApoE敲除小鼠中，如果SR-BI被敲除將更易發(fā)生AS。Arai等[5]發(fā)現(xiàn)在高脂飲食的LDL受體敲除的小鼠中過量表達(dá)SR-BI將明顯減少AS損傷。動物實(shí)驗的結(jié)果表明，以提高肝中SR-BI表達(dá)水平為目的的藥物治療或基因治療有可能在動脈粥樣硬化的防治中取得突破性進(jìn)展[2，6，7，8]。
本發(fā)明在此基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了適于高通量篩選人高密度脂蛋白受體SR-BI表達(dá)上調(diào)劑的模型，應(yīng)用于從微生物代謝產(chǎn)物和組合化學(xué)庫中尋找可以上調(diào)人SR-BI基因表達(dá)水平的活性物質(zhì)。
人高密度脂蛋白受體SR-BI基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是通過許多轉(zhuǎn)錄因子(如C/EBP，SF-1，SREBP-1(固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1，sterolregulatory element binding protein-1)與其上游調(diào)控序列相互作用來實(shí)現(xiàn)的。人高密度脂蛋白受體基因CLA-1的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游大約1kb為已知的啟動子序列，含有與不同轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的順式元件[3]。
為構(gòu)建本發(fā)明所述的人高密度脂蛋白受體篩選模型，可以選擇參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程的細(xì)胞作為測試細(xì)胞，包括但不限于肝細(xì)胞，例如肝癌BEL-7402細(xì)胞；外周細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞或血管壁細(xì)胞(血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞)。對于上述測試細(xì)胞而言，能夠造成人SR-BI基因啟動子活性狀態(tài)增加的化合物，即為具有上調(diào)SR-BI基因表達(dá)的活性化合物。其中，可以選擇適當(dāng)?shù)谋绢I(lǐng)域知曉的報告基因替換目標(biāo)基因SR-BI，從而能夠以便于檢測的方式反映出所述啟動子的活性變化。具體地，可以將待測化合物加入測試細(xì)胞培養(yǎng)體系，與不加入所述化合物的對照測試細(xì)胞相比，如果其能夠影響報告基因，例如熒光素酶的表達(dá)，則利用檢測所述報告基因例如熒光素酶活性的方法，檢測所述報告基因，例如熒光素酶基因表達(dá)的改變，從而確定所述化合物是否為人高密度脂蛋白SR-BI表達(dá)上調(diào)劑。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明人利用PCR的方法，從人肝癌BEL-7402細(xì)胞總DNA中擴(kuò)增出人SR-BI基因CLA-1(CD36 andLIMPII Analogous-1)的調(diào)控序列(SEQ ID NO1)，克隆至熒光素酶報告基因上游。得到用于轉(zhuǎn)染BEL-7402細(xì)胞的重組表達(dá)載體。將所得重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BEL-7402細(xì)胞后，用于檢測人高密度脂蛋白受體表達(dá)上調(diào)劑。其中，熒光素酶基因的表達(dá)受人SR-BI基因上游調(diào)控序列的控制。
本發(fā)明所述模型中采用的以螢火蟲熒光素酶基因為報告基因的體系具有不使用同位素，靈敏性好，線性范圍寬，在哺乳動物細(xì)胞中內(nèi)源性活性極小，相對廉價等優(yōu)點(diǎn)。運(yùn)用熒光素酶分析試劑盒，采用適用于96孔甚至384孔培養(yǎng)板的熒光光度計檢測，又具有通量高、系統(tǒng)誤差小、可自動化的特點(diǎn)。與傳統(tǒng)的受體配基結(jié)合法相比，基于檢測報告基因的藥物篩選方法可以直接給出有關(guān)化合物的功能性信息，篩出的陽性化合物更易進(jìn)入結(jié)構(gòu)優(yōu)化過程。
利用本發(fā)明人建立的人高密度脂蛋白表達(dá)上調(diào)劑篩選模型，針對小分子類藥物的特點(diǎn)，能夠在細(xì)胞水平上大規(guī)模篩選可以影響人高密度脂蛋白受體表達(dá)水平的小分子化合物，適于對天然產(chǎn)物、合成化合物、組合化合物庫等進(jìn)行高通量篩選。


圖1脫氧新羥曲霉酸(2101C)抑制巨噬細(xì)胞泡沫化的鏡檢結(jié)果(油紅O染色法)。
實(shí)施例1重組表達(dá)質(zhì)粒pGL3-CLAP的構(gòu)建菌株和細(xì)胞株E.coli DH5α用于質(zhì)粒DNA的遺傳操作。肝癌BEL-7402細(xì)胞株(購自上海午立生物技術(shù)有限公司)用于人高密度脂蛋白受體表達(dá)上調(diào)劑篩選模型的構(gòu)建。
質(zhì)粒pGEM-T(購自Promega公司)用于PCR產(chǎn)物的克隆。pGL3-Basic(購自Promega公司)為報告基因載體，含有無啟動子的螢火蟲(Photinus pyralis)熒光素酶編碼基因，用于人高密度脂蛋白受體調(diào)控序列的克隆。
pGL3-control(購自Promega公司)含有SV40啟動子和增強(qiáng)子序列，用于熒光素酶表達(dá)的陽性對照。pRL-TK(購自Promega公司)包含編碼海腎(Renilla reniformis)熒光素酶的cDNA，與實(shí)驗載體共轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，用于雙熒光素酶報告基因體系的內(nèi)對照。
高密度脂蛋白受體基因調(diào)控序列的獲得根據(jù)文獻(xiàn)[3]報道的CLA-1基因序列，利用軟件Primer Premier5.0設(shè)計PCR引物P1(5’-CCTCGAGTGG AGC CAT TGT GTG CAAAG-3’)(SEQ ID NO2)和P2(5’-CAAGCTTCGG CGA CAG AGACGA CAC AG-3’)(SEQ ID NO3)，用于擴(kuò)增人SR-BI基因上游1055bp 62bp(以SR-BI基因起始密碼子ATG的A為+1)長度為996bp的片段，其中P1引入了XhoI酶切位點(diǎn)，P2引入了HindIII酶切位點(diǎn)。
以人肝癌細(xì)胞BEL-7402總DNA為模板設(shè)立25μl PCR反應(yīng)體系1×PCR緩沖液，0.5μmol/L P1和P2，2.5μmol/L dNTPs，0.5U TaqDNA聚合酶。反應(yīng)條件為94℃變性5min；94℃變性40s，54℃退火40s，72℃延伸1min 20s(30個循環(huán))；72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增的目的片段用pGEM-T載體克隆后酶切鑒定并測定所得調(diào)控序列的序列，如SEQ ID NO1所示。
依據(jù)分子克隆實(shí)驗室指南中所述的方法，將PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α受體菌，用藍(lán)白斑法挑選轉(zhuǎn)化子。對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行快速質(zhì)粒提取后進(jìn)行酶切鑒定，用XhoI，HindIII雙切后含目的片段的轉(zhuǎn)化子為克隆有目的片段的重組子，命名為pGEM-CLAP。
重組質(zhì)粒pGL3-CLAP的構(gòu)建用XhoI，HindIII雙切重組質(zhì)粒pGEM-CLAP得到目的片段后，將目的片段與經(jīng)過相同雙酶切的pGL3-basic質(zhì)粒相連，從而將人SR-BI基因上游調(diào)控序列定向插入到pGL3-basic的熒光素酶基因上游，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGL3-CLAP。
實(shí)施例2人高密度脂蛋白受體SR-BI上調(diào)劑的篩選細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染RPMI-1640 Medium(Hyclone)(含10％標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(Hyclone)，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素)用于肝癌細(xì)胞BEL-7402的培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒DNA的提取采用WizardRPureFection Plasmid DNAPurification System試劑盒(Promega)。采用LipofectAMINETM2000Reagent(Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
熒光素酶表達(dá)活性的測定細(xì)胞熒光素酶表達(dá)活性的測定采用熒光檢測試劑盒LuciferaseAssay System和Dual-Luciferase Assay System(Promega)。用BMGPolarstar Galaxy紫外-可見-熒光臺式培養(yǎng)板用分光光度計檢測熒光素酶活性。
篩選樣品待篩化合物溶于DMSO。微生物發(fā)酵液用等體積丙酮或乙酸乙酯提取后干燥，溶于DMSO。
初篩條件的確定以pGL3-basic為陰性對照質(zhì)粒，pGL3-control為陽性對照質(zhì)粒，與構(gòu)建的質(zhì)粒pGL3-CLAP同時分別瞬時轉(zhuǎn)染肝癌BEL-7402細(xì)胞，對轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化，確定用96孔培養(yǎng)板初步篩選化合物和微生物次級代謝產(chǎn)物的條件如下每孔接種5×104個細(xì)胞，200ng質(zhì)粒DNA，0.5μl脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)染時間為6小時，轉(zhuǎn)染6小時后換為無血清無抗生素培養(yǎng)基。加入待篩選的樣品后繼續(xù)溫育18小時后，測定肝癌BEL-7402細(xì)胞中熒光素酶活性，結(jié)果見表1。
實(shí)驗結(jié)果表明不同孔的變異系數(shù)(CV)不超過10％，孔間一致性較好，而pGL3-CLAP與pGL3-basic組間差別顯著。
表1 96孔培養(yǎng)板讀數(shù)的孔間差異(x±s，n＝10)

DMSO對篩選結(jié)果的影響待篩樣品采用DMSO溶解，因此測定了不同濃度DMSO熒光素酶活性的影響，結(jié)果表明，在DMSO濃度為0.1％-0.01％時對熒光素酶活性影響較小，篩選時采用此范圍濃度并設(shè)置溶媒對照孔。
待測樣品對熒光素酶表達(dá)活性改變率的計算用如下方程計算待測樣品對熒光素酶表達(dá)活性的改變率改變率(％)＝(A-B)/B×100其中，A為加入待測樣品后測定的熒光素酶表達(dá)活性(或相應(yīng)的熒光單位)，B為加入陰性對照樣品(空白)后測定的熒光素酶表達(dá)活性。
對于改變率在+20％以上的待測樣品可初步認(rèn)定為具有人高密度脂蛋白受體表達(dá)上調(diào)劑活性。
初篩結(jié)果應(yīng)用上述確定的篩選條件對124個化合物，800個微生物次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行了初步篩選，其中1個化合物2101C和4個菌株為陽性，初篩陽性率為5.4‰。
篩選結(jié)果應(yīng)用上述確定的篩選條件測定本發(fā)明所述脫氧新羥曲霉酸，結(jié)果見表2，其中本發(fā)明所述脫氧新羥曲霉酸使得熒光素酶活性改變率大于+60％，顯示為強(qiáng)人高密度脂蛋白受體上調(diào)劑。
表2.脫氧新羥曲霉酸(2101C)上調(diào)高密度脂蛋白活性結(jié)果(熒光報告基因法，熒光強(qiáng)度)

復(fù)篩對有陽性結(jié)果的化合物和發(fā)酵液采用雙熒光素酶檢測試劑盒進(jìn)一步檢測。用質(zhì)粒pGL3-CLAP轉(zhuǎn)染肝癌BEL-7402細(xì)胞的同時，轉(zhuǎn)染另一種熒光素酶(Renilla reniformis，sea pansy)報告基因質(zhì)粒pRL-TK，此質(zhì)粒用量是前者的十分之一。Renilla熒光素酶報告基因上游含有SV40啟動子，在不同類型的哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)穩(wěn)定，并且其表達(dá)活性對外界藥物刺激不敏感，可以用來校正轉(zhuǎn)染效率不同造成的誤差。用Firefly熒光素酶活性對Renilla熒光素酶活性的相對值作為相對表達(dá)活性。
待測樣品對雙熒光素酶表達(dá)活性改變率的計算用如下方程計算待測樣品對雙熒光素酶表達(dá)活性的改變率改變率(％)＝(A-B)/B×100其中，A為加入待測樣品后測定的熒光素酶相對表達(dá)活性，B為加入陰性對照樣品(空白)后測定的熒光素酶相對表達(dá)活性。
對于改變率在+10％以上的待測樣品可初步認(rèn)定為具有人高密度脂蛋白受體表達(dá)上調(diào)劑活性。
復(fù)篩結(jié)果1個化合物2101C和3個菌株復(fù)篩陽性。
2101C的活性結(jié)果2μg/ml時熒光素酶相對表達(dá)活性上調(diào)23.01％。
實(shí)施例4脫氧新羥曲霉酸抑制巨噬細(xì)胞泡沫化活性的測定A)氧化的低密度脂蛋白(OX-LDL)的制備將低密度脂蛋白(LDL)溶于0.15mol/L，pH7.4的NaCl溶液中，然后放入透析袋中置于含10μmol/L CuSO4的PBS中，37℃透析12小時后，在含0.1％EDTA的PBS中透析24小時，0.2μm微孔濾膜過濾除菌，備用。用硫代巴比妥酸反應(yīng)物含量來鑒定LDL氧化程度。以四乙氧基丙烷為標(biāo)準(zhǔn)品，按丙二醛(MDA)測定試劑盒說明書操作，測定此批氧化后每毫克LDL的丙二醛含量。
B)將人類單核細(xì)胞株U937，置于37℃含0.5％CO2培養(yǎng)箱中，倍增時間為24～48小時，在含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中懸浮生長，培養(yǎng)液中加青霉素和鏈霉素各1.0×105IU/L。U937細(xì)胞實(shí)驗前用100nmol/L的佛波酯(PMA)刺激72小時，使其由單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。換無血清培養(yǎng)液并加到96孔培養(yǎng)板上，每孔150μl，細(xì)胞密度為1×106個/毫升左右，此時將U937細(xì)胞分為對照組、泡沫細(xì)胞組和加樣組。對照組只加無血清培養(yǎng)液，泡沫細(xì)胞組另加OX-LDL至每孔終濃度為80mg/L，加樣組在泡沫組的基礎(chǔ)上，再加入待測樣品(5μl微生物發(fā)酵液)，培養(yǎng)48小時后，進(jìn)行染色。
C)U937細(xì)胞油紅O染色①油紅O染色液的配制方法油紅0.3克溶于30毫升異丙醇，攪拌下60℃保溫過夜，然后再加20毫升蒸餾水?dāng)嚢柽^夜，過濾。使用時必須用新鮮過濾好的濾液。
②U937細(xì)胞中性脂質(zhì)的油紅O染色法按步驟2)提到的方法，將加好樣的96孔培養(yǎng)板從二氧化碳孵箱中取出，10％戊二醛固定液固定(15μl/孔)，10分鐘后棄去溶液，水洗兩次，再加入60％異丙醇(150μl/孔)放置5分鐘，棄去溶液，用油紅O染色液(150μl/孔)染色1小時，棄去溶液用60％異丙醇(150μl/孔)洗孔，然后水(150μl/孔)洗兩次，最后每孔加150μl水放到顯微鏡下觀察。
D)鏡檢結(jié)果經(jīng)油紅O染色后，鏡下觀察不加OX-LDL的對照組細(xì)胞內(nèi)無明顯紅色油滴狀顆粒，而泡沫細(xì)胞組的細(xì)胞可見到細(xì)胞漿內(nèi)有較多的紅色油滴顆粒，并且由于個別細(xì)胞吞噬的油滴過多使得這些細(xì)胞體積增大，樣品組中若有對巨噬細(xì)胞泡沫化有抑制作用的樣品，其細(xì)胞中幾乎無紅色油滴顆粒。由附圖所示，本發(fā)明所述脫氧新羥曲霉酸的加入，使得能夠有效抑制對巨噬細(xì)胞的泡沫化。
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1.一種篩選人高密度脂蛋白受體表達(dá)上調(diào)劑的方法，其包括1)將含有位于報告基因上游的人高密度脂蛋白受體調(diào)控序列之重組表達(dá)載體的測試細(xì)胞與待測化合物混合；2)在適于報告基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)所得混合物；3)檢測加入待測化合物后報告基因表達(dá)水平的改變。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述測試細(xì)胞與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程相關(guān)的肝細(xì)胞和/或外周細(xì)胞。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述肝細(xì)胞選自肝癌BEL-7402細(xì)胞株，肝癌HepG2細(xì)胞株，外周細(xì)胞選自巨噬細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述人高密度脂蛋白受體調(diào)控序列為SEQ ID NO1。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述報告基因為熒光素酶報告基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種篩選人高密度脂蛋白受體表達(dá)上調(diào)劑的方法，其用于從組合化學(xué)庫、微生物次級代謝產(chǎn)物庫以及天然產(chǎn)物庫中高通量篩選人高密度脂蛋白受體表達(dá)上調(diào)劑。
文檔編號C12Q1/68GK1673390SQ20041002990
公開日2005年9月28日 申請日期2004年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月26日
發(fā)明者洪斌, 司書毅, 劉曉輝, 王麗非, 楊媛, 巫曄翔, 田德峰, 姜威 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所