專(zhuān)利名稱(chēng)：水稻的一種耐逆相關(guān)基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域中水稻的一種耐逆相關(guān)基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，特別涉及水稻的一種耐逆相關(guān)基因及其編碼蛋白與利用該基因提高植物耐逆性的方法。
背景技術(shù)：
在干旱、高鹽和低溫等環(huán)境脅迫的逆境條件下，植物能夠在分子、細(xì)胞和整體水平上做出相應(yīng)的調(diào)整，以最大程度上減少環(huán)境所造成的傷害并得以生存。許多基因受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)(Shinozaki，K.and Yamaguchi-Shinozaki，K.(1994).Molecular responses to drought and cold stress.Curr.Opin.Biotechnol 7，161-167；Thomashow，M.F.(1999).Plant cold acclimationfreezing tolerancegenes and regulatory mechanisms.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50,571-599)，這些基因的產(chǎn)物不僅能夠直接參與植物的脅迫應(yīng)答，而且能夠調(diào)節(jié)其它相關(guān)基因的表達(dá)或參與信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而使植物避免或減少傷害，增強(qiáng)對(duì)脅迫環(huán)境的抗性。與脅迫相關(guān)的基因產(chǎn)物可以分為兩大類(lèi)(Kasuga，M.，Liu，Q.，Miura，S.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，and Shinozaki，K.(1999).Improving plantdrought，salt，and freezing tolerance by gene transfer of a singlestress-inducible transcription factor.Nature biotechnol.17，287-291)第一類(lèi)基因編碼的產(chǎn)物包括離子通道蛋白、水通道蛋白、滲透調(diào)節(jié)因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜堿等)合成酶等直接參與植物脅迫應(yīng)答的基因產(chǎn)物；第二類(lèi)基因編碼的產(chǎn)物包括參與脅迫相關(guān)的信號(hào)傳遞和基因表達(dá)調(diào)節(jié)的蛋白因子，如蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等。其中，轉(zhuǎn)錄因子在植物脅迫應(yīng)答的基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用。
在植物的整個(gè)基因組中，編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因占了很大一部分，比如，擬南芥中編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因至少有1500個(gè)(Riechmann，J.L.，Heard，J.，Martin，G.，Reuber，L.，Jiang，C.-Z.，Keddie，J.，Adam，L.，Pineda，O.，Ratcliffe，O.J.，Samaha，R.R.，Creelman，R.，Pilgrim，M.，Broun，P.，Zhang，J.-Z.，Ghandehari，D.，Sherman，B.K.，and Yu，G.-L.(2000).Arabidopsis transcription factorsgenome-wide comparative analysis among eukaryotes.Science 290，2110)，占整個(gè)基因組的5％以上。這些轉(zhuǎn)錄因子大多屬于大的基因家族，有的基因家族又可包括許多亞族，而且有些轉(zhuǎn)錄因子家族是植物所特有的。目前已知在植物中與脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子主要有具有AP2結(jié)構(gòu)域的AP2(APETALA2)/EREBP(ethyleneresponsive element binding protein)轉(zhuǎn)錄因子家族、含有堿性區(qū)域和亮氨酸拉鏈的bZIP(basic region/leucine zipper motif transcription factors)類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族、含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉鏈的MYC家族和具有色氨酸簇(Trp cluster)的MYB家族。這五個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，除WRKY家族不參與植物的水脅迫反應(yīng)外，其它四個(gè)家族均參與調(diào)節(jié)植物對(duì)干旱、高鹽和低溫等的逆境脅迫反應(yīng)。其中，AP2/EREBP類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在高等植物中廣泛存在，它是植物所特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，近年來(lái)，在擬南芥、煙草、玉米、水稻、大豆和油菜中均有報(bào)道(Elliott，R.C.，Betzner，A.S.，Huttner，E.，Oakes，M.P.，Tucker，W.Q.，Gerentes，D.，Perez，P.，and Smyth，D.R.(1996).AINTEGUMENTA，an APETALA2-like gene of Arabidopsis with pleiotropic rolesin ovule development and floral organ growth.Plant Cell 8，155-168；Kevin，M.K.，Leonore Reiser，and Robert，L.F.(1996).The AINTEGUMENTA gene ofArabidopsis required for ovule and female gametophyte development is relatedto the floral homeotic gene APETALA2.Plant Cell 8，137-153)，這表明AP2/EREBP類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在高等植物中普遍存在并具有重要作用。
AP2轉(zhuǎn)錄因子家族成員的主要特點(diǎn)是含有一個(gè)高度保守的、具有三個(gè)β折疊的DNA結(jié)合區(qū)，稱(chēng)作AP2域(AP2 domain)，序列分析顯示，AP2蛋白除了至少含有一個(gè)AP2域的共同特征外，其它氨基酸序列高度不同。在AP2域中，有兩個(gè)保守序列，一個(gè)是堿性的YRG區(qū)，是由19-22個(gè)氨基酸組成的高度保守的一段序列，它含有YRG這幾個(gè)保守的氨基酸序列，YRG元件已經(jīng)被證明參與與DNA的結(jié)合；第二個(gè)保守區(qū)是RAYD區(qū)，RAYD區(qū)是由42-43個(gè)氨基酸組成的一段氨基酸序列，它的核心結(jié)構(gòu)是一個(gè)由18個(gè)氨基酸組成的雙親性的α-螺旋結(jié)構(gòu)，這個(gè)核心結(jié)構(gòu)的氨基酸序列高度保守(Okamour，J.K.，Brian Caster，Raimundc Villarroel，Marc Van Montagu，andJofuku，K.D.(1997).The AP2 domain of APETALA2 defines a large new familyof DNA binding proteins in Arabidopsis.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94，7076-7081)，RAYD元件可能參與蛋白與蛋白的相互作用。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)，在YRG和RAYD保守區(qū)中，有幾個(gè)氨基酸殘基在是極度保守的，比如RAYD保守區(qū)中第40個(gè)氨基酸——甘氨酸，在所有的AP2蛋白中都是不改變的，它對(duì)于AP2蛋白發(fā)揮其生理功能很重要(Jofuku，K.D.，den Boer，B.G.，Van Montagu，M.，and Okamuro，J.K.(1994).Control of Arabidopsis flower and seed development by thehomeotic gene APETALA2.Plant Cell 6，1211-1225)。
根據(jù)AP2域數(shù)目的不同，可以把AP2轉(zhuǎn)錄因子家族分為兩個(gè)亞家族AP2-like家族和EREBP-like家族。AP2-like家族成員最主要的特征是在其蛋白結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)AP2域，這兩個(gè)AP2域被一個(gè)由25-26個(gè)氨基酸組成的鉸鏈區(qū)連接，鉸鏈區(qū)的氨基酸序列也是高度保守的，AP2-like家族的另一個(gè)特征是，在其YRG序列中均含有WEAR/WESH這樣一段高度保守的氨基酸序列。AP2-like家族主要在植物發(fā)育中起作用，比如擬南芥基因AP2(homeotic gene APETALA2)是這個(gè)家族中的成員之一，它不僅參與調(diào)控花分生組織的建立、花器官的分化，同時(shí)還能夠調(diào)控其它與花發(fā)育有關(guān)的同源異型基因的表達(dá)，在擬南芥花發(fā)育過(guò)程中起重要作用，而且，它還參與擬南芥子房發(fā)育和種子發(fā)育過(guò)程的調(diào)節(jié)(Jofuku，K.D.，den Boer，B.G.，VanMontagu，M.，and Okamuro，J.K.(1994).Control of Arabidopsis flower and seeddevelopment by the homeotic gene APETALA2.Plant Cell 6，1211-1225)，該家族的另一成員ANT，在擬南芥的子房發(fā)育和雌配子體的發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用。
EREBP-like家族的成員的特征是僅含有一個(gè)AP2域，而且在YRG保守區(qū)中沒(méi)有WEAR/WESH，而是由7個(gè)氨基酸——WAAEIRD組成的一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)(Okamour，J.K.，Brian Caster，Raimundc Villarroel，Marc Van Montagu，and Jofuku，K.D.(1997).The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA bindingproteins in Arabidopsis.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94，7076-7081)。據(jù)估計(jì)，在擬南芥中，EREBP-like家族有124個(gè)成員之多(Riechmann，J.L.，Heard，J.，Martin，G.，Reuber，L.，Jiang，C.-Z.，Keddie，J.，Adam，L.，Pineda，O.，Ratcliffe，O.J.，Samaha，R.R.，Creelman，R.，Pilgrim，M.，Broun，P.，Zhang，J.-Z.，Ghandehari，D.，Sherman，B.K.，and Yu，G.-L.(2000).Arabidopsistranscription factorsgenome-wide comparative analysis among eukaryotes.Science 290，2110)，家族如此龐大，也許與EREBP-like轉(zhuǎn)錄因子在植物體中所參與的廣泛的生物學(xué)作用有關(guān)。EREBP-like轉(zhuǎn)錄因子參與植物對(duì)低溫、干旱、病原侵害、機(jī)械傷害等的脅迫應(yīng)答反應(yīng)，并受乙烯、水楊酸、茉莉酮酸的調(diào)節(jié)(Singh，K.，F(xiàn)oley，R.C.，and Onate-Sanchez，L.(2002).Transcription factors in plantdefense and stress responses.Curr.Opin.Plant Biol 5，430-436)。
EREBP-like轉(zhuǎn)錄因子能夠與GCC盒(GCC box)和DRE/CRT(dehydrationresponsive element/C-repeat)兩種順式作用元件結(jié)合。GCC盒的序列是AGCCGCC，它存在于植物與抗性有關(guān)的基因的啟動(dòng)子中，它對(duì)于乙烯誘導(dǎo)的PR基因(pathogenesis related genes)的表達(dá)是必須和足夠的(Fujimoto，S.Y.，Ohta，M.，Usui，A.，Shinshi，H.，and Ohme-Takagi，M.(2000).Arabidopsisethylene-responsive element binding factors act as transcriptionalactivators or repressors of GCC box-mediated gene expression.Plant Cell 12，393-404)；而DRE/CRT序列存在于植物對(duì)干旱、高鹽和低溫等環(huán)境脅迫的抗性有關(guān)的基因的啟動(dòng)子中，它們的過(guò)量表達(dá)能使植物抵抗干旱、高鹽和冷害的襲擊，所以，EREBP-like家族成員在植物的生物脅迫和非生物脅迫中都起重要的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，他們還發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，一些EREBP蛋白在GCC介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起激活作用，而另一些則起轉(zhuǎn)錄抑制作用(Fujimoto，S.Y.，Ohta，M.，Usui，A.，Shinshi，H.，and Ohme-Takagi，M.(2000).Arabidopsis ethylene-responsive element bindingfactors act as transcriptional activators or repressors of GCC box-mediatedgene expression.Plant Cell 12 393-404)。
與AP2-like亞家族結(jié)合的順式作用元件目前還沒(méi)有報(bào)道，但它識(shí)別的序列很可能與EREBP-like亞家族識(shí)別的序列不同，因?yàn)橹苯优cGCC盒結(jié)合的EREBP-like成員的氨基酸序列在AP2-like亞家族成員中并不存在(Allen，M.D.，Yamaguchi，K.，Ohme-Takagi，M.，Tateno，M.，and Suzuki，M.(2003).A novel mode of DNArecognition by a b-sheet revealed by the solution structure of the GCC-boxbinding domain in complex with DNA.EMBO J.17，5484-5496)。
DREB(DRE-binding protein)類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子是AP2家族中EREBP-like亞家族中的一個(gè)成員。根據(jù)其結(jié)構(gòu)上的同源性，擬南芥中的DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子可以將其分為DREB1和DREB2兩大類(lèi)。DREB1包括CBF1/DREB1B、CBF2/DREB1C、CBF3/DREB1A、CBF4/DREB1D、DREB1E和DREB1F六個(gè)成員，其中CBF1/DREB1B、CBF2/DREB1C、CBF3/DREB1A位于擬南芥的第四染色體上，目前研究的比較透徹(Gilmour，S.J.，Zarka，D.G.，Stockinger，E.J.，Salazar，M.P.，Houghton，J.M.，and Thomashow，M.F.(1998).Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family ofAP2 transcriptional activators as an early step in cold-induced COR geneexpression.Plant J.16，433-442；Liu，Q.，Kasuga，M.，Sakuma，Y.，Abe，H.，Miura，S.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，and Shinozaki，K.(1998).Twotranscription factors，DREB1 and DREB2 with an EREBP/AP2 DNA binding domainseparate two cellular signal transduction pathways in drought-andlow-temperature-responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis.Plant Cell.10，1391-1406)，CBF4/DREB1D位于第五條染色體上(Nakamura，Y.，Sato，S.，Asamizu，E.，Kaneko，T.，Kotani，H.，Miyajima，N.，and Tabata，S.(1998).Structural analysis of Arabidopsis thaliana chromosome 5VII.Sequence features of the regions of 1,013,767 bp covered by sixteen physicallyassigned P1 and TAC clones.DNA Res.5，297-308；Thomashow，M.F.，Gilmour，S.J.，Stockinger，E.J.，Jaglo-Ottosen，K.R.，and Zarka，D.G.(2001).Roleof Arabidopsis CBF transcriptional activators in cold acclimation.PlantPhysiol 112，171-175)，DREB1E和DREB1F位于第一條染色體上(Sakuma，Y.，Liu，Q.，Dubouzet，J.G.，Abe，H.，Shinozaki，K.，and Yamaguchi-Shinozaki，K.(2002).DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs，transcription factors involved in dehydration-and cold-inducible geneexpression.Biochem Biophys Res Commun.290，998-1009)。CBF1、CBF2和CBF3受低溫誘導(dǎo)表達(dá)，而不受干旱和高鹽誘導(dǎo)(Liu，Q.，Kasuga，M.，Sakuma，Y.，Abe，H.，Miura，S.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，and Shinozaki，K.(1998).Twotranscription factors，DREB1 and DREB2 with an EREBP/AP2 DNA binding domainseparate two cellular signal transduction pathways in drought-andlow-temperature-responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis.Plant Cell.10.1391-1406；Shinwari，Z.K.，Nakashima，K.，Miura，S.，Kasuga，M.，Seki，M.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，and Shinozaki，K.(1998).AnArabidopsis gene family encoding DRE/CRT binding proteins involved inlow-temperature-responsive gene expression.Biochem Biophys Res Commun.250，161-170)。但目前，不同的研究者對(duì)于DREB1的表達(dá)模式的報(bào)道并不一致，也許是不同的實(shí)驗(yàn)條件所造成的。
DREB2類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子包括DREB2A和DREB2B兩個(gè)成員(Nakashima，K.，Shinwari，Z.K.，Sakuma，Y.，Seki，M.，Miura，S.，Shinozaki，K.，and Yamaguchi-Shinozaki，K.(2000).Organization and expression of two Arabidopsis DREB2 genesencoding DRE-binding proteins involved in dehydration-andhigh-salinity-responsive gene expression.Plant Mol Biol.42，657-665)。DREB2A位于擬南芥的第五條染色體上，DREB2B位于第三條染色體上。除了均含有AP2域和核定位信號(hào)外，它們?cè)谛蛄猩吓cDREB1類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子沒(méi)有明顯的同源性。DREB2類(lèi)蛋白中含有一段富含絲氨酸/蘇氨酸的保守序列，DREB2的表達(dá)模式與DREB1不同，它們受干旱和高鹽誘導(dǎo)(Gilmour，S.J.，Zarka，D.G.，Stockinger，E.J.，Salazar，M.P.，Houghton，J.M.，and Thomashow，M.F.(1998).Low temperatureregulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activatorsas an early step in cold-induced COR gene expression.Plant J.16，433-442；Sakuma，Y.，Liu，Q.，Dubouzet，J.G.，Abe，H.，Shinozaki，K.，andYamaguchi-Shinozaki，K.(2002).DNA-binding specificity of the ERF/AP2domain of Arabidopsis DREBs.transcription factors involved in dehydration-and cold-inducible gene expression.Biochem Biophys Res Commun.290，998-1009)，而不受低溫誘導(dǎo)表達(dá)。所以，DREB1和DREB2在脅迫誘導(dǎo)條件下的信號(hào)傳導(dǎo)途徑可能不同。
DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子能夠與DRE/CRT順式作用元件結(jié)合，誘導(dǎo)啟動(dòng)子中含有DRE/CRT順式作用元件(TACCGACAT)的基因的表達(dá)，這些基因都是與植物對(duì)干旱、高鹽和低溫等環(huán)境脅迫的抗性有關(guān)的基因。DRE/CRT的核心序列是ACCGAC，普遍存在于干旱、高鹽或低溫脅迫應(yīng)答基因的啟動(dòng)子中，比如rd29A、kin1、cor6.6、cor15a、rd17和erd10等，對(duì)這些脅迫條件下的基因誘導(dǎo)表達(dá)起調(diào)控作用。所以，在植物對(duì)干旱、高鹽或低溫脅迫的分子應(yīng)答中，一個(gè)DREB轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控一群?jiǎn)?dòng)子中含有DRE/CRT元件的與脅迫耐性相關(guān)的基因的表達(dá)。
在植物中過(guò)量表達(dá)DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子能夠顯著增強(qiáng)植物對(duì)干旱、高鹽或低溫等脅迫環(huán)境的抗性。在擬南芥中過(guò)量表達(dá)CBF1，轉(zhuǎn)基因植物比沒(méi)有轉(zhuǎn)基因的植物對(duì)低溫具有更強(qiáng)的耐性(Jaglo-Ottosen，K.R.，Gilmour，S.J.，Zarka，D.G.，Schabenberger，O.，and Thomashow，M.F.(1998).Arabidopsis CBF1overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance.Science280，104-106)；過(guò)量表達(dá)CBF3，轉(zhuǎn)基因擬南芥獲得了對(duì)干旱、高鹽和低溫脅迫的較高的抵抗能力(Gilmour，S.J.，Sebolt，A.M.，Salazar，M.P.，Everard，J.D.，andThomashow，M.F.(2003).Overexpression of the Arabidopsis CBF3transcriptional activator mimics multiple biochemical changes associatedwith cold acclimation.Plant Physiol.124，1854-1865；Kasuga，M.，Liu，Q.，Miura，S.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，and Shinozaki，K.(1999).Improving plantdrought，salt，and freezing tolerance by gene transfer of a singlestress-inducible transcription factor.Nature biotechnol.17，287-291)，但同時(shí)也引起轉(zhuǎn)基因植物的高度矮化，而用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子比如rd29A的啟動(dòng)子代替組成型啟動(dòng)子就可以克服這個(gè)負(fù)面效應(yīng)，在提高植物耐逆性能的同時(shí)不會(huì)造成植物其它性狀的改變。
水稻中也存在能夠識(shí)別DRE/CTR順式作用元件或其核心序列并與之結(jié)合的DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。2003年，Dubouzet等從水稻中分離得到了與五個(gè)擬南芥DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子同源的序列的cDNA，并命名為OsDREB1A、OsDREB1B、OsDREB1C、OsDREB1C、OsDREB2A，其中，OsDREB1A、OsDREB1B被低溫、高鹽和機(jī)械損傷誘導(dǎo)，OsDREB2A受干旱、高鹽和低溫誘導(dǎo)表達(dá)，而且，在擬南芥中過(guò)量表達(dá)OsDREB1A和OsDREB2A的轉(zhuǎn)基因植株都表現(xiàn)了較高的耐干旱、高鹽和低溫的性能。而且，近年來(lái)已經(jīng)從大麥、黑麥、番茄和油菜里得到了與擬南芥中的DREB轉(zhuǎn)錄因子序列上同源、功能上相同或相似的基因，這些研究結(jié)果表明，DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在植物界是廣泛存在的，并且在不同的植物體中，它們執(zhí)行著相似或相同的功能。
大量對(duì)轉(zhuǎn)錄因子研究的結(jié)果表明，一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能對(duì)一類(lèi)相關(guān)性狀的很多基因?qū)嵤┱{(diào)節(jié)控制，從而有效改變植物的相關(guān)特性，同時(shí)很多研究結(jié)果也表明，在植物體內(nèi)，包括擬南芥、煙草、大麥和玉米等，過(guò)量表達(dá)DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的植株都表現(xiàn)了較高抵抗干旱、高鹽和低溫脅迫耐逆性能。所以，通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法去改善作物的耐逆性，是一種行之有效的途徑。
水稻是世界上最重要的糧食作物，也是單子葉植物的模式植物，它為全球近一半的人口提供食物。然而，干旱、高鹽和低溫等逆境脅迫，每年都會(huì)在全世界范圍內(nèi)造成水稻大面積的減產(chǎn)，全球約有40％的水稻種植區(qū)受到不同程度的環(huán)境脅迫。隨著全球人口的不斷增加和可耕種面積的逐年減少，提高水稻產(chǎn)量成為全球所共同面臨的一個(gè)緊迫的挑戰(zhàn)，而減少逆境脅迫所造成的產(chǎn)量損失，就能夠在很大程度上緩解糧食危機(jī)。
旱稻作為和水稻親源關(guān)系極為相近卻具有相對(duì)極端生態(tài)型的禾谷類(lèi)作物，對(duì)旱稻相關(guān)基因資源的研究和發(fā)掘，有著極為重要的意義。一方面，旱稻和水稻在進(jìn)化上親源關(guān)系極為相近，可以充分利用水稻的全基因組序列信息；另一方面，轉(zhuǎn)基因受體材料本身的調(diào)控機(jī)制上的差異，很大程度上與基因來(lái)源(基因供體材料)和轉(zhuǎn)基因受體材料的親源關(guān)系遠(yuǎn)近密切相關(guān)，因此導(dǎo)入近源作物的目的基因可最大程度地克服這些障礙。從旱稻中分離克隆的基因，將可用于水稻和其它禾谷類(lèi)作物的耐逆基因工程，培育出真正的耐逆品種。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供水稻的一種耐逆相關(guān)基因及其編碼蛋白。
本發(fā)明所提供的水稻耐逆相關(guān)基因，名稱(chēng)為OsCBF4，來(lái)源于稻屬水稻(Oryzasativa L.)，是下述核苷酸序列之一1)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的多核苷酸序列。
其中，所述與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列可為序列表中的SEQ ID №1(來(lái)源于巴西旱稻)或SEQ ID №3(來(lái)源于日本晴)；它們均編碼序列表中的SEQ ID №2的氨基酸殘基序列。
序列表中的SEQ ID №1和SEQ ID №3的cDNA序列均由660個(gè)堿基組成，它們的開(kāi)放閱讀框架為自5’端第1到第660位堿基。
水稻的一種耐逆相關(guān)基因編碼蛋白，名稱(chēng)為OsCBF4，來(lái)源于稻屬水稻(Oryzasativa L.)，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列2的氨基酸殘基序列是由219個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體及細(xì)胞系，如重組載體pMD18-T Vector-OsCBF4和含有該基因的大腸桿菌(E.coli)DH5α均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增OsCBF4中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種提高植物耐逆性的方法，包括以下步驟(a)構(gòu)建一種DNA片段，使其包含OsCBF4基因；(b)用所構(gòu)建的DNA片段或含有所述DNA片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；(c)篩選出被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；(d)使被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生出完整植株，得到耐逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
使步驟(d)中被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生出完整植株后，可對(duì)該轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行擴(kuò)繁，可使轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性(耐旱或耐鹽堿)進(jìn)一步改善和提高。所述轉(zhuǎn)基因植物的擴(kuò)繁包括無(wú)性繁殖和/或種子繁殖。所述耐逆性提高包括抗旱或耐鹽、耐低溫、抗病蟲(chóng)害等性能的改善和提高。
在上述方法中，步驟(a)所述的DNA片段還包括組成性或組織特異性或誘導(dǎo)表達(dá)(ABA、干旱、鹽堿或化學(xué)誘導(dǎo)等)的啟動(dòng)子序列。
在本發(fā)明的方法中，所述組成性表達(dá)啟動(dòng)子可以是CaMV 35S，玉米Ubiquitin，水稻actinl啟動(dòng)子等；所述組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子可以是根特異性表達(dá)啟動(dòng)子、葉片特異性表達(dá)啟動(dòng)子或維管特異性表達(dá)啟動(dòng)子；所述誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子可以是低溫、ABA、干旱、鹽堿或化學(xué)誘導(dǎo)等的啟動(dòng)子序列。
在本發(fā)明的方法中，所述DNA片段可為含有由組成性或組織特異性表達(dá)或誘導(dǎo)表達(dá)(ABA、干旱、鹽堿或化學(xué)誘導(dǎo)等)啟動(dòng)子控制的OsCBF4基因的DNA分子；也可是人工合成的DNA片段。所述DNA片段可插入在用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體質(zhì)粒如pBin 19，pCambia或pBI 101等，和可在原核生物中繁殖的其他質(zhì)粒如pUC，pBluescript或PCR載體質(zhì)粒中。將所述DNA片段插入這些質(zhì)粒的方法可通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法進(jìn)行。
所述控制OsCBF4基因表達(dá)的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)可以是異源誘導(dǎo)系統(tǒng)，也可以是植物內(nèi)源誘導(dǎo)系統(tǒng)如熱激，除草劑，干旱、鹽脅迫或低溫脅迫等誘導(dǎo)系統(tǒng)等。
本發(fā)明的方法中，所述植物細(xì)胞可來(lái)源于煙草、油菜、棉花、大豆、楊樹(shù)、桉樹(shù)、馬鈴薯、牧草等雙子葉植物，或水稻、玉米、小麥、大麥、高梁、谷子、草坪草等單子葉植物的愈傷組織、莖尖、葉片等組織或器官。
本發(fā)明的方法中，所述DNA片段可通過(guò)原生質(zhì)體-化學(xué)介導(dǎo)法(Ca2+，PEG)，基因槍介導(dǎo)法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，電激法，花粉管導(dǎo)入，微注射等方法中的任何一種方法或幾種方法的組合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
本發(fā)明的方法中，所述被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞指利用上述轉(zhuǎn)化方法將OsCBF4基因或與其同源的克隆基因?qū)氩⑼ㄟ^(guò)分子手段證明是陽(yáng)性的植物細(xì)胞。
本發(fā)明的方法中，所述被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的篩選可利用抗生素或其他篩選標(biāo)記基因完成，如含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因的細(xì)胞或愈傷組織可由卡那霉素或其替衍生代物如G 418等進(jìn)行篩選；含潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycinphosphotransferase)基因的細(xì)胞或愈傷組織可由潮霉素進(jìn)行篩選等。在獲得抗性愈傷組織細(xì)胞后可采用Southern或PCR法，點(diǎn)雜交等分子檢測(cè)手段對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，以確定其含有OsCBF4或其同源克隆基因。
本發(fā)明的方法中，使被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生出的完整植株主要指通過(guò)離體由包含有上述DNA元件的轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生的植株，也包括非離體的其他營(yíng)養(yǎng)繁殖方法再生的植株。
本發(fā)明基于AP2類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子(包括DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子)在植物耐逆中的重要作用及旱稻在禾谷類(lèi)作物的耐逆基因工程中的重要作用，以巴西旱稻(Brazilian uplandrice)和日本晴為材料，利用消減抑制雜交的方法，結(jié)合基因芯片雜交的結(jié)果，分離得到一個(gè)耐逆相關(guān)基因OsCBF4。實(shí)驗(yàn)證明，將OsCBF4導(dǎo)入水稻中，可顯著提高水稻對(duì)干旱、高鹽和低溫等脅迫的耐受性。本發(fā)明將在培育耐逆性增強(qiáng)的植物中發(fā)揮重要作用。


圖1為OsCBF4與已知的擬南芥DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化關(guān)系樹(shù)圖2為受鹽誘導(dǎo)的巴西旱稻和日本晴的RT-PCR電泳圖譜圖3為受鹽誘導(dǎo)的日本晴的RT-PCR電泳圖譜圖4為9311、日本晴、蘭勝、巴西旱稻經(jīng)鹽處理12天的照片圖5為9311、日本晴、蘭勝、巴西旱稻經(jīng)低溫處理4天的照片圖6為部分轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)電泳圖譜圖7為轉(zhuǎn)基因T0代植株經(jīng)60天鹽處理的照片圖8為部分T1代植株鹽脅迫處理7天的照片圖9為部分T1代植株低溫脅迫處理7天的照片圖10為部分T1代植株干旱脅迫處理5小時(shí)的照片具體實(shí)施方式
水稻(Oryza sativa L.)品種9311，日本晴，蘭勝，巴西旱稻(Iapar 9)等被用于以下實(shí)施例的各種實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1、OsCBF4的獲得1、抑制性消減雜交獲得水稻鹽脅迫差異表達(dá)片段巴西旱稻和日本晴的種子分別在37℃浸種兩天，露白后鋪在放有兩層紗布的平皿上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28℃，持續(xù)光照強(qiáng)度為2500lux，光周期為16/8小時(shí)。培養(yǎng)兩周后，將巴西旱稻和日本晴的幼苗分別移至150mM NaCl溶液中脅迫處理，同時(shí)設(shè)對(duì)照，分不同的時(shí)間點(diǎn)取根(時(shí)間點(diǎn)從15分鐘到2天)。按照王關(guān)琳等(2002)方法分別提取總RNA，然后按照Clontech試劑盒(Clontech PCR-Select cDNASubtraction Kit，購(gòu)自Clontech公司)的步驟進(jìn)行操作，構(gòu)建抑制性消減雜交cDNA文庫(kù)。按照Clontech試劑盒的步驟依次進(jìn)行酶切、連接、點(diǎn)雜交、及兩輪PCR擴(kuò)增，獲得差異表達(dá)的片段。差異表達(dá)的片段與pMD 18-T Vector(TAKARA，大連)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α菌株，隨機(jī)選擇700個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。所獲得的差異表達(dá)片段在NCBI和BGI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示表達(dá)差異最大的為一349bp的cDNA片段，與擬南芥CBF4基因具有較大的同源性，在水稻中為單拷貝，沒(méi)有內(nèi)含子，命名為OsCBF4。
2、OsCBF4的克隆及驗(yàn)證設(shè)計(jì)引物forward primer5’＞TTA AGC TTA TGG ACA CCG AGG ACA CGT C＞3’和reverse primer 5’＞TTA AGC TTT CAG TCC ATC CAT AGC TTG T＞3’，按常規(guī)PCR方法分別從巴西旱稻和日本晴基因組中將該基因克隆出來(lái)，裝入pMD 18-TVector，得到重組質(zhì)粒pMD18-T Vector-OsCBF4，通過(guò)CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α菌株，挑選陽(yáng)性菌落加入到5ml含50mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm培養(yǎng)12-16小時(shí)，提取質(zhì)粒，PCR和酶切鑒定后，序列測(cè)定。
抑制性消減雜交所獲得的克隆測(cè)序結(jié)果表明，OsCBF4是所獲得豐度差異最大的一個(gè)片段，所得EST長(zhǎng)為349bp中，有344個(gè)核苷酸完全相同。序列測(cè)定結(jié)果表明OsCBF4全長(zhǎng)660bp，其中來(lái)自巴西旱稻的OsCBF4全長(zhǎng)cDNA序列如序列表中的序列1所示，來(lái)自日本睛的OsCBF4全長(zhǎng)cDNA序列如序列表中的序列3所示，序列1與序列3僅白5′端的第402位堿基存在差異，它們均編碼由219個(gè)氨基酸殘基組成的如序列2所示的編碼蛋白，位于水稻基因組的第一條染色體上，有一個(gè)典型的AP2保守區(qū)，與AP2/EREBP的DNA結(jié)合區(qū)具有96.7％的同源性，與AtCBF4具有50.6％的同源性?；诎被嵝蛄斜容^得到的結(jié)果建立了OsCBF4與擬南芥已知的DREB類(lèi)的轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化樹(shù)，如圖1所示，表明OsCBF4在氨基酸序列上與擬南芥中的AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3和AtCBF4的同源性分別是50.2％，49.6％，49.3％，50.6％。
實(shí)施例2、OsCBF4在巴西旱稻和日本晴的根中受鹽誘導(dǎo)的表達(dá)模式取野生型日本晴和巴西旱稻的種子，先在37℃浸種兩天，露白后鋪在放有兩層紗布的平皿上，于28℃光照(2500lux，16/8)培養(yǎng)。10天后，換1/4×Hogland營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)兩天，然后將日本晴和巴西旱稻的幼苗移至加有150mM NaCl的1/4×Hogland營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行鹽脅迫處理，分別在0、0.5、1、3、6、12和24小時(shí)這7個(gè)時(shí)間點(diǎn)快速取日本晴和巴西旱稻的根和葉片，迅速在液氮中冷凍，-80℃保存，然后按照王關(guān)琳等(2002)方法提取水稻日本晴和巴西旱稻的不同組織的總RNA，然后按照Promega公司的Reverese Transcription System(cat.#3500，購(gòu)自Promega公司)說(shuō)明書(shū)的步驟對(duì)鹽處理的日本晴和巴西旱稻的不同時(shí)間點(diǎn)的根部總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后分別以5’＞TTA AGC TTA TGG ACA CCG AGG ACA CGT C＞3’和5’＞TTAAGC TTT CAG TCC ATC CAT AGC TTG T＞3’為正向和反向引物，用RT-PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖2所示，表明OsCBF4在巴西旱稻中受鹽誘導(dǎo)后的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于相同處理?xiàng)l件下OsCBF4在日木晴中的表達(dá)量，在巴西旱稻和日本晴根中，OsCBF4的表達(dá)在鹽誘導(dǎo)30分鐘內(nèi)迅速達(dá)到最高峰，1小時(shí)時(shí)開(kāi)始明顯下降，至6小時(shí)已完全檢測(cè)不到。
實(shí)施例3、OsCBF4在日本晴不同器官組織中的表達(dá)模式取野生型日本晴種子，先在37℃浸種兩天，露白后鋪在放有兩層紗布的平皿上，于28℃光照(2500lux，16/8)培養(yǎng)。10天后，換1/4×Hogland營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)兩天，然后將日本晴幼苗移至加有150mM NaCl的1/4×Hogland營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行鹽脅迫處理，分別在0、0.5、1、6、12、24和48小時(shí)這7個(gè)時(shí)間點(diǎn)快速取日本晴的根和葉片，迅速在液氮中冷凍，-80℃保存，然后按照王關(guān)琳等(2002)方法提取水稻日本晴不同組織的總RNA，然后按照Promega公司的Reverese TranscriptionSystem(cat.#3500，購(gòu)自Promega公司)說(shuō)明書(shū)的步驟對(duì)鹽處理的日本晴的根和葉片的不同時(shí)間點(diǎn)的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后分別以5’＞TTA AGC TTA TGG ACA CCG AGGACA CGT C＞3’和5’＞TTA AGC TTT CAG TCC ATC CAT AGC TTG T＞3’為正向和反向引物，用RT-PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖3所示，表明OsCBF4在同一品種不同器官組織中的表達(dá)模式不同，在日本晴根中，OsCBF4在鹽誘導(dǎo)后迅速表達(dá)，30分鐘即達(dá)到其最大表達(dá)量，1小時(shí)即開(kāi)始下降，至6小時(shí)已檢測(cè)不到；而在葉中，6小時(shí)開(kāi)始表達(dá)，然后表達(dá)量迅速下降，至12小時(shí)時(shí)檢測(cè)不到其表達(dá)。這個(gè)現(xiàn)象暗示著在植物受到高鹽脅迫后，其根部最先感受并產(chǎn)生相應(yīng)的脅迫反應(yīng)，然后，才經(jīng)過(guò)一系列的信號(hào)傳導(dǎo)途徑將脅迫信號(hào)傳至地上部分，也暗示著OsCBF4可能在植物鹽脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起感應(yīng)脅迫信號(hào)或傳遞脅迫信息的信號(hào)分子的作用。圖3中，陰性對(duì)照為未經(jīng)鹽處理的日本晴植株，陽(yáng)性對(duì)照為日本晴基因組DNA。
實(shí)施例4、不同水稻品種耐逆性能檢測(cè)取野生型9311，日本晴，蘭勝和巴西旱稻的種子，先在37℃浸種兩天，露白后鋪在放有兩層紗布的平皿上，于28℃光照(2500lux，16/8)培養(yǎng)。10天后，換1/4×Hogland營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)兩天，然后進(jìn)行脅迫處理，同時(shí)設(shè)野生型的日本晴做對(duì)照。鹽處理將水稻幼苗移至加有150mM NaCl的1/4×Hogland營(yíng)養(yǎng)液中，相同培養(yǎng)條件下處理12天；冷處理將水稻幼苗移至4℃培養(yǎng)箱中處理4天。結(jié)果如圖4和圖5所示，圖4表明9311、日本晴、蘭勝、巴西旱稻對(duì)高鹽處理的耐受能力不同，相同培養(yǎng)條件下的這四個(gè)不同的水稻品種150mmol/L NaCl處理12天，9311葉片卷曲、干枯死亡，日本晴嫩葉全部卷曲、干枯，老葉葉尖卷曲、干枯，蘭勝嫩葉全部卷曲、干枯，老葉無(wú)卷曲，而巴西旱稻僅葉尖稍有卷曲。圖5表明9311、日本睛、蘭勝、巴西旱稻對(duì)低溫的耐逆能力不同，相同培養(yǎng)條件下的這四個(gè)不同的水稻品種4℃處理4天，9311葉片全部干枯，日本晴、蘭勝嫩葉葉片干枯卷曲，只有最下面的一片老葉伸展，巴西旱稻葉片直立、伸展，沒(méi)有脅迫表型。這說(shuō)明巴西旱稻無(wú)論是在耐鹽還是在耐低溫上都明顯優(yōu)于其他幾個(gè)品種。
實(shí)施例5、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻用HindIII酶切實(shí)施例1中構(gòu)建的pMD18-T Vector-OsCBF4(其中的OsCBF4為序列表中的SEQ ID №1的DNA序列)重組質(zhì)粒，用玻璃奶回收OsCBF4基因片段，純化后的片段用Klenow Fragment補(bǔ)平后與經(jīng)SmalI酶切、脫磷后的雙元載體pCAMBIA 1300-35S-tOCS(Cambia，Australia)連接，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α菌株，挑選陽(yáng)性菌落加入到5ml含50mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm培養(yǎng)12-16小時(shí)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定，隨后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL1。
挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于20ml YEB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素50mg/L，利福平50mg/L)中，28℃，150rpm振蕩培養(yǎng)2-3天。于4℃下5000rpm離心3分鐘，去上清，重懸于AAM培養(yǎng)基(含0.1mmol/L乙酰丁香酮)中，28℃避光振蕩培養(yǎng)1-2小時(shí)，至OD600＝0.6-0.9。選按常規(guī)植物組織培養(yǎng)方法制備的日本晴的生長(zhǎng)狀態(tài)良好、顆粒狀愈傷組織浸入農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中搖動(dòng)20分鐘后，靜置30分鐘，取出用無(wú)菌濾紙吸干多余菌液，將愈傷組織接種于共培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基+10g/L葡萄糖+1mg/L己酰丁香酮)上培養(yǎng)。2-3天后，將愈傷組織放入廣口瓶中，用無(wú)菌水沖洗3-5次，每次搖動(dòng)數(shù)次，直到水中不見(jiàn)絲狀菌體，然后在含500mg/L羧芐青霉素的無(wú)菌水中浸泡30-60分鐘，最后再?zèng)_洗一遍，置于無(wú)菌濾紙上涼干，轉(zhuǎn)入NB共培養(yǎng)基共培養(yǎng)。
侵染后的水稻愈傷組織于NB共培養(yǎng)基共培養(yǎng)3-5天后，轉(zhuǎn)至含30mg/L潮霉素和400mg/L頭飽霉素)的NB培養(yǎng)基(N6大量元素+B5微量元素+B5有機(jī)成分+300mg/L水解酪蛋白+500mg/L脯氨酸+30g/L蔗糖+7-8g/L瓊脂，pH5.8)上篩選3周，再轉(zhuǎn)入含50mg/L潮霉素和200mg/L頭飽霉素的NB培養(yǎng)基上篩選4周，隨后抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入預(yù)分化培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基+1mg/L奈乙酸+2mg/L6-芐基氨基嘌呤+5mg/L脫落酸)，光照培養(yǎng)3周，再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基+1mg/L奈乙酸+2mg/L6-芐基氨基嘌呤)上進(jìn)行分化，再生植株在壯苗培養(yǎng)基(1/2MS無(wú)機(jī)鹽+0.5mg/L奈乙酸+0.25mg/L多效唑)上生根后移至溫室中。一個(gè)月后取植株葉片，按常規(guī)方法提取總DNA，以5’＞AGC TGC GCC GAT GGT TTC TAC AA＞3’和5’＞ATC GCC TCG CTC CAGTCA ATG＞3’為正向和反向引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，檢測(cè)所獲得的植株是否為陽(yáng)性植株，結(jié)果表明獲得了13株陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株，圖6給出部分轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)結(jié)果。圖6中，N為陰性對(duì)照，未被轉(zhuǎn)基因的植株；P為陽(yáng)性對(duì)照(證明為轉(zhuǎn)基因的陽(yáng)性水稻植株)；151-162為不同的轉(zhuǎn)基因株系的編號(hào)。
實(shí)施例6、轉(zhuǎn)基因T0代植株耐逆性能鑒定將實(shí)施例5中的過(guò)表達(dá)OsCBF4的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株在溫室中培養(yǎng)，待其產(chǎn)生分蘗后，取每一陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的部分分蘗進(jìn)行耐鹽和干旱試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)相同生長(zhǎng)狀態(tài)的野生型日本晴對(duì)照。
鹽處理轉(zhuǎn)移至鹽池中的陽(yáng)性植株分蘗，恢復(fù)生長(zhǎng)15天后進(jìn)行鹽處理，用0.5％NaCl溶液連續(xù)灌溉2個(gè)月；干旱處理轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)容器中的陽(yáng)性植株分蘗，恢復(fù)生長(zhǎng)15天后進(jìn)行干旱處理16天，從處理即日起不再澆水。
結(jié)果表明過(guò)表達(dá)OsCBF4的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系，其對(duì)高鹽和干旱的耐受能力明顯增強(qiáng)。圖7表明在鹽池中用0.5％的NaCl處理轉(zhuǎn)基因水稻和野生型的日本晴對(duì)照，60天后對(duì)照死亡，而部分轉(zhuǎn)基因株系的生長(zhǎng)狀態(tài)尚好。圖7中，箭頭所示151、154、155、157、159為不同的轉(zhuǎn)基因株系的編號(hào)，WT為野生型的日本晴對(duì)照。
實(shí)施例7、轉(zhuǎn)基因T1代植株耐鹽性鑒定收獲T0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻種子，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163株系的種子(T1代)先在37℃浸種兩天，露白后鋪在放有兩層紗布的平皿上，于28℃光照(2500lux，16/8)培養(yǎng)。10天后，換1/4×Hogland營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)兩天，然后將水稻幼苗移至加有100mM NaCl的1/4×Hogland營(yíng)養(yǎng)液中，相同培養(yǎng)條件下進(jìn)行鹽脅迫處理7天，同時(shí)設(shè)野生型的日本晴做對(duì)照。部分T1代植株耐鹽試驗(yàn)的結(jié)果如圖8所示，表明對(duì)照的葉片卷曲、干枯，而三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系葉片伸展，沒(méi)有脅迫表型。圖8中，151、154、157為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系的株號(hào)；WT為野生型，日本晴對(duì)照。
繼續(xù)上述鹽脅迫處理至野生型對(duì)照死亡后，除去脅迫條件，在正常的培養(yǎng)條件下恢復(fù)生長(zhǎng)15天后統(tǒng)計(jì)分離比，結(jié)果如表1所示，表明T1代植株對(duì)鹽脅迫的耐受性明顯提高，并表現(xiàn)出3∶1的分離比(復(fù)水后存活植株數(shù)目死亡植株數(shù)目)，說(shuō)明表型與轉(zhuǎn)基因直接連鎖。表1中，151-163是不同的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系的株號(hào)。
表1.過(guò)表達(dá)OsCBF4陽(yáng)性株系T1代不同處理?xiàng)l件下分離比分析

實(shí)施例8、轉(zhuǎn)基因T1代植物耐低溫性鑒定收獲T0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻種子，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163株系的種子(T1代)先在37℃浸種兩天，露白后鋪在放有兩層紗布的平皿上，于28℃光照(2500lux，16/8)培養(yǎng)。10天后，換1/4×Hogland營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)兩天，然后將水稻幼苗移至加有100mMNaCl的1/4×Hogland營(yíng)養(yǎng)液中，將培養(yǎng)苗放入10℃培養(yǎng)條件下進(jìn)行低溫處理7天，同時(shí)設(shè)野生型的日本晴做對(duì)照。部分T1代植株的耐低溫處理試驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，表明陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系151、154、157的T1代和野生型的日本晴對(duì)照(WT)10℃處理第7天時(shí)，對(duì)照的葉片卷曲、干枯，而三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系僅葉尖部分稍有卷曲。試驗(yàn)結(jié)果亦顯示，T1代植株對(duì)低溫的耐受能力明顯高于野生型。
實(shí)施例9、轉(zhuǎn)基因T1代植株干旱處理試驗(yàn)結(jié)果收獲T0代種子，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163株系的種子先在37℃浸種兩天，露白后鋪在放有兩層紗布的平皿上，于28℃光照(2500lux，16/8)培養(yǎng)。10天后，換1/4×Hogland營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)兩天后，用紗布吸去其根部殘留的水份，轉(zhuǎn)移到干凈無(wú)水的平皿中進(jìn)行干旱處理5小時(shí)，部分T1代植株干旱處理結(jié)果如圖10所示，表明對(duì)照的葉片干枯、莖桿脫水彎曲，不能直立，而三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，葉片稍下垂，莖桿直立。
序列表<160>3<210>1<211>660<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.)<400>1atggacaccg aggacacgtc gtcggcttcg tcctcgtcgg tgtcgccgcc gtcgtcgccg 60ggcggcgggc accaccaccg gctgccgccg aagcggcggg cggggcggaa gaaattccgg120gagacgcggc acccggtgta ccgcggtgtg cgcgcgcggg cggaggggag caggtgggtg180tgcgaggtgc gcgagccgca ggcgcaggcg cgcatctggc tcggcaccta cccgacgccg240gagatggcgg cgcgcgcgca cgacgtcgcg gccatcgccc tccgcggcga gcgcggcgcc300gagctcaact tcccggactc cccctccacg ctcccgcgcg cgcgcacggg gtcgcccgag360gacatccgcc tcgccgccgc gcaggccgcc gagctgtacc gccgcccgcc gccgccgctg420gcattgccgg aggatccgca ggaaggcacg agtggcggcg gcgccaccgc cacctcgggg480cgtccggctg ccgtgttcgt ggacgaggac gccatcttcg acatgccggg gctgatcgac540gacatggcga gggggatgat gctgacgccg ccggcgattg ggagatctct cgacgactgg600gccgccatcg acgacgacga tgaccattac cacatggact acaagctatg gatggactga660<210>2<211>219<212>PRT<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.)<400>2Met Asp Thr Glu Asp Thr Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ser Val Ser Pro1 5 10 15Pro Ser Ser Pro Gly Gly Gly His His His Arg Leu Pro Pro Lys Arg20 25 30
Arg Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro Val Tyr Arg35 40 45Gly Val Arg Ala Arg Ala Glu Gly Ser Arg Trp Val Cys Glu Val Arg50 55 60Glu Pro Gln Ala Gln Ala Arg Ile Trp Leu Gly Thr Tyr Pro Thr Pro65 70 75 80Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Ile Ala Leu Arg Gly85 90 95Glu Arg Gly Ala Glu Leu Asn Phe Pro Asp Ser Pro Ser Thr Leu Pro100 105 110Arg Ala Arg Thr Gly Ser Pro Glu Asp Ile Arg Leu Ala Ala Ala Gln115 120 125Ala Ala Glu Leu Tyr Arg Arg Pro Pro Pro Pro Leu Ala Leu Pro Glu130 135 140Asp Pro Gln Glu Gly Thr Ser Gly Gly Gly Ala Thr Ala Thr Ser Gly145 150 155 160Arg Pro Ala Ala Val Phe Val Asp Glu Asp Ala Ile Phe Asp Met Pro165 170 175Gly Leu Ile Asp Asp Met Ala Arg Gly Met Met Leu Thr Pro Pro Ala180 185 190Ile Gly Arg Ser Leu Asp Asp Trp Ala Ala Ile Asp Asp Asp Asp Asp195 200 205His Tyr His Met Asp Tyr Lys Leu Trp Met Asp210 215<210>3<211>660<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.)<400>3atggacaccg aggacacgtc gtcggcttcg tcctcgtcgg tgtcgccgcc gtcgtcgccg60
ggcggcgggc accaccaccg gctgccgccg aagcggcggg cggggcggaa gaaattccgg120gagacgcggc acccggtgta ccgcggtgtg cgcgcgcggg cggaggggag caggtgggtg180tgcgaggtgc gcgagccgca ggcgcaggcg cgcatctggc tcggcaccta cccgacgccg240gagatggcgg cgcgcgcgca cgacgtcgcg gccatcgccc tccgcggcga gcgcggcgcc300gagctcaact tcccggactc cccctccacg ctcccgcgcg cgcgcacggg gtcgcccgag360gacatccgcc tcgccgccgc gcaggccgcc gagctgtacc ggcgcccgcc gccgccgctg420gcattgccgg aggatccgca ggaaggcacg agtggcggcg gcgccaccgc cacctcgggg480cgtccggctg ccgtgttcgt ggacgaggac gccatcttcg acatgccggg gctgatcgac540gacatggcga gggggatgat gctgacgccg ccggcgattg ggagatctct cgacgactgg600gccgccatcg acgacgacga tgaccattac cacatggact acaagctatg gatggactga660
權(quán)利要求
1.水稻的一種耐逆相關(guān)基因，是下述核苷酸序列之一1)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的多核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于所述與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列為序列表中的SEQ ID №1或SEQ ID №3。
3.水稻的一種耐逆相關(guān)基因編碼蛋白，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQID №2衍生的蛋白質(zhì)。
4.含有權(quán)利要求1或2所述基因的表達(dá)載體及細(xì)胞系。
5.一種提高植物耐逆性的方法，包括以下步驟(a)構(gòu)建一種DNA片段，使其包含水稻耐逆相關(guān)基因；所述水稻耐逆相關(guān)基因，選自下述核苷酸序列之一1)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的多核苷酸序列；(b)用所構(gòu)建的DNA片段或含有所述DNA片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；(c)篩選出被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；(d)使被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生出完整植株，得到耐逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(a)所述的DNA片段還包括組成性或組織特異性或誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述DNA片段插入在用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體質(zhì)粒和可在原核生物中繁殖的其他質(zhì)粒中。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體質(zhì)粒為pBin 19，pCambia或pBI 101；所述可在原核生物中繁殖的其他質(zhì)粒為pUC，pBluescript或PCR載體質(zhì)粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述植物細(xì)胞來(lái)源于雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物為煙草、油菜、棉花、大豆、楊樹(shù)、桉樹(shù)、馬鈴薯和牧草；所述單子葉植物為水稻、小麥、大麥、玉米、高梁、谷子和草坪草。
10.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述DNA片段通過(guò)原生質(zhì)體-化學(xué)介導(dǎo)法，基因槍介導(dǎo)法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，電激法，花粉管導(dǎo)入和微注射方法中的任何一種或幾種方法的組合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了水稻的一種耐逆相關(guān)基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，其目的是提供水稻的一種耐逆相關(guān)基因及其編碼蛋白與利用該基因提高植物耐逆性的方法。本發(fā)明所提供的水稻的一種耐逆相關(guān)基因，選自下述核苷酸序列之一1)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的多核苷酸序列。實(shí)驗(yàn)證明，將上述水稻耐逆相關(guān)基因?qū)胨局?，可顯著提高水稻對(duì)干旱、高鹽和低溫等脅迫的耐受性。本發(fā)明將在培育耐逆性增強(qiáng)的植物中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1680552SQ20041002995
公開(kāi)日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2004年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月6日
發(fā)明者儲(chǔ)成才, 王秋韞, 吳耀榮 申請(qǐng)人:北京未名凱拓農(nóng)業(yè)生物技術(shù)有限公司