專利名稱：一種防治土壤病蟲害的復(fù)合菌劑與有機(jī)菌肥的發(fā)酵與制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及防治植物土傳真菌與細(xì)菌性病害及根部線蟲與蛆類，能夠抗重茬并促進(jìn)植物生長的復(fù)合共生的“功能菌液-SS”及生物有機(jī)的“功能菌肥-SS”的制備與發(fā)酵工藝。
植物的土傳病蟲害(包括真菌、細(xì)菌、線蟲、韭蛆等)一直是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中比較難防治的種類，如枯黃萎病的危害使得大豆、西瓜等不能夠重茬或迎茬種植，溫室種植黃瓜、番茄3-5年以后由于線蟲的嚴(yán)重危害只好廢棄。由于缺乏能夠有效地防治韭蛆的藥劑，劇毒化學(xué)農(nóng)藥在韭菜、蔥蒜類上的施用屢禁不止，不僅污染生態(tài)環(huán)境，更危害人類自身的健康。根據(jù)自然生態(tài)系統(tǒng)中生物間相生相克的平衡理論，在植物土傳病蟲害發(fā)生比較嚴(yán)重的農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，可能存在能夠相抗并抑制該類土傳病蟲害的復(fù)合共生的“功能菌群”。
本發(fā)明的目的在于以植物根際微生物生態(tài)系統(tǒng)理論為基礎(chǔ)，以現(xiàn)有的3個菌株〔分別為蠟狀芽胞桿菌ACCC11077(中國科學(xué)院微生物所AS1.0230)、地衣芽胞桿菌ACCC11106(中國科學(xué)院微生物所AS1.1216)、枯草芽胞桿菌ACCC11088(中國科學(xué)院微生物所AS1.0933)，保藏于中國微生物菌種管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心，中國農(nóng)業(yè)菌種目錄，2001年版，中國農(nóng)業(yè)科技出版社，4～7頁〕為基礎(chǔ)，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室的生物測定與田間的實(shí)際應(yīng)用，配制出防治植物土傳真菌與細(xì)菌性病害及根部線蟲與蛆類，能夠抗重茬并促進(jìn)植物生長的復(fù)合共生的“功能菌液-SS”，再以有機(jī)載體(腐殖酸銨、草炭粉、污泥粉)為吸附劑制成生物有機(jī)的“功能菌肥-SS”，并提供這種菌肥的配制與發(fā)酵工藝。
復(fù)合共生的“功能菌群”可以是真菌、細(xì)菌等各式各樣的共生菌群，由于考慮到這些菌抗逆境的生物學(xué)特性，以及產(chǎn)品生產(chǎn)、保藏、運(yùn)輸?shù)谋憷?，本發(fā)明所采用的為抗逆性較強(qiáng)的芽孢桿菌類(Bacillus)菌株。
本發(fā)明的特征在于包括復(fù)合共生的“功能菌液-SS”及生物有機(jī)的“功能菌肥-SS”的制備與發(fā)酵工藝。
一、復(fù)合共生的“功能菌液-SS”的培養(yǎng)方法1、速生營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基配方蛋白胨-8克；NaCl-5克；牛肉膏-5克；葡萄糖-10克；酵母膏-5克；山梨醇-5克；0.2％的5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉(促進(jìn)菌落快速良好生長)-1毫升；MgSO4·7H2O-0.2克；KCl-0.2克；(NH4)H2PO4-1克；酒石酸鈉-0.09克；鉬酸銨-0.035克；FeCl2-0.098克；ZnSO4-0.8克；MnCl2-0.07克；CaCl2-0.3克；CuSO4-0.2克；NaHCO3-20毫克；MnSO4-5毫克；營養(yǎng)瓊脂-20克；添加蒸餾水至1000毫升；PH值6.5-7.5；121℃高壓滅菌30分鐘。取出冷卻至60℃左右，在超潔凈工作臺上，于無菌條件下倒入滅過菌的培養(yǎng)皿中，分別將蠟狀芽胞桿菌ACCC、地衣芽胞桿菌ACCC、枯草芽胞桿菌ACCC轉(zhuǎn)到速生營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，然后進(jìn)行生物測定。
2、生物測定將培養(yǎng)好的蠟狀芽胞桿菌ACCC11077、地衣芽胞桿菌ACCC11106、枯草芽胞桿菌ACCC11088分別制成濃度為100萬/毫升的菌液100毫升，然后各取25毫升以1∶1∶1的比例配成混合菌液。將配好的上述菌液，分別接種于涂有濃度適中的不同病原指示菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)，測定對各種作物土傳病害的抑菌活性。將從田間采集到的鮮活線蟲與韭蛆，分別于配好的上述3種菌液及混合菌液中浸蘸3秒鐘，然后在30℃室溫中飼養(yǎng)，測定對線蟲與韭蛆的殺蟲效果。(抑菌活性與殺蟲效果見表1)。
表1、ACCC、ACCC、ACCC的抗菌活性與殺蟲效果病蟲名稱 ACCC11077 ACCC11106 ACCC11088 混合菌液大豆枯、黃萎病Fusarium oxysporum ++++ +++++++ +++++F.graminearum +++++++ +++ ++++Pythium ultimum ++++ ++++ +++++ +++++Rhizoctonia solani ++++++++ +++ ++++西瓜枯、黃萎病F.oxysporium f.sp niveum+++++++ +++ +++++F.oxysporium f.sp melom ++++ +++++++ ++++F.bulbigenum var.nireum ++++ ++++ +++ +++++番茄枯、黃萎病F.oxysporum f.sp Lycopersici++++ ++++ ++++ +++++Verticillium alb-atrum +++++++++ ++++辣椒疫病Colletotrichum capasici +++++++ ++++ +++++蘋果根腐病Helicobasidium mompa++++ ++++ +++ +++++大豆胞囊線蟲Heterodera glycines 83.5％ 75.3％ 78.2％98.2％黃瓜根結(jié)線蟲Meloidogyne Goeld 82.2％ 71.2％ 76.5％96.7％小麥粒線蟲Anguina tritici 75.3％ 78.5％ 82.2％95.3％韭蛆(遲眼蕈蚊幼蟲)Bradysia odoriphaga 81.6％ 73.9％ 78.5％97.6％注“+”表示抑菌圈直徑(mm)；+10.0-15.0；++15.0-20.0；+++20.0-25.0；++++25.0-30.0；+++++30.0以上從表1可以看出蠟狀芽胞桿菌ACCC11077、地衣芽胞桿菌ACCC11106、枯草芽胞桿菌ACCC11088本身抑菌活性與殺蟲效果不是很高，但是經(jīng)過混合以后，三者發(fā)揮復(fù)合共生的作用，共同抑菌殺蟲的效果得到了顯著的提高。
3、拮抗試驗(yàn)將蠟狀芽胞桿菌ACCC11077、地衣芽胞桿菌ACCC11106、枯草芽胞桿菌ACCC11088分別兩兩組合，在速生營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基上，兩點(diǎn)放置相距4cm，每個組合重復(fù)三次，進(jìn)行交叉拮抗試驗(yàn)，結(jié)果表明三者相互之間不存在拮抗，能夠共同生長。將三者以1∶1∶1的比例混合配制成復(fù)合共生的“功能菌液”，然后在速生營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基上共同培養(yǎng)，試驗(yàn)表明三者能夠共同均勻地生長形成一個“復(fù)合共生系統(tǒng)”。
4、菌種的培養(yǎng)與保藏分別將蠟狀芽胞桿菌ACCC11077、地衣芽胞桿菌ACCC11106、枯草芽胞桿菌ACCC11088接種于速生營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)，然后劃線接種于斜面試管的速生營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中，在30℃下培養(yǎng)72小時后，在長好菌的斜面試管中倒入滅菌液體石蠟，液面高出培養(yǎng)基2cm，然后直立置于4℃冰箱中保存，每半年轉(zhuǎn)管復(fù)壯一次。
5、菌株的鑒定ACCC11077是芽孢桿菌屬的蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，生物學(xué)特性菌體直桿狀、成鏈，光學(xué)顯微鏡下長2.5-4.5微米，寬0.8-1.0微米，革蘭氏反應(yīng)陽性；芽孢近中生，近圓形，芽孢囊不膨大，原生質(zhì)內(nèi)含不著色顆粒，而且含量較大；菌落近橢圓形，直徑0.5-1.2cm，邊緣不整齊，無隆起，無光澤，不透明，蠟質(zhì)；生長溫度15℃-50℃，最適溫度30℃-35℃，適宜PH6.0-7.5；能厭氧生長，PH5.7生長，接觸酶陽性，碳水化合物產(chǎn)氣陽性，不產(chǎn)生吲哚，苯丙氨酸脫氨酶陰性，液體培養(yǎng)形成菌膜；V.P反應(yīng)陽性，V.P液培養(yǎng)后PH為4.5-6.0；7％NaCl中生長，適宜碳源為葡萄糖、蔗糖，適宜氮源為蛋白胨、牛肉膏，無機(jī)氮源為NH4+，發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖產(chǎn)酸，發(fā)酵木糖、乳糖、甘露醇不產(chǎn)酸，水解淀粉，利用檸檬酸鹽，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，能產(chǎn)生蛋白酶和溶菌酶。
ACCC11106是芽孢桿菌屬的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，生物學(xué)特性菌體直桿狀、成鏈，光學(xué)顯微鏡下長3.0-4.5微米，寬1.0-1.2微米，革蘭氏反應(yīng)陽性；芽孢近中生，近橢圓形，芽孢囊不膨大，原生質(zhì)內(nèi)無不著色顆粒；菌落近橢圓形，直徑0.3-0.5cm，中間微凸起，邊緣不整齊，微隆起，菌落無光澤，不透明；生長溫度15℃-47℃，最適溫度28℃-32℃，接觸酶陽性，V.P陽性，V.P液生長后PH5.5-6.0；能厭氧生長，PH5.7生長，7％NaCl中生長，碳水化合物不產(chǎn)氣；適宜碳源為麥芽糖、蔗糖，適宜氮源為蛋白胨、牛肉膏；水解淀粉，利用檸檬酸鹽與丙酸鹽，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。
ACCC11088芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，生物學(xué)特性菌體直桿狀，光學(xué)顯微鏡下長2.5-3.5微米，寬0.8-1.0微米，革蘭氏反應(yīng)陽性；芽孢近圓形，近中生，芽孢囊不膨大，原生質(zhì)內(nèi)沒有不著色顆粒；菌落近圓形，直徑0.6-0.8cm，中間微凹無褶皺，邊緣不整齊，有隆起，不透明，乳黃色；生長溫度10℃-50℃，最適溫度28℃-32℃，PH4-9都能生長，最適PH為6.5-8；好氧，不能厭氧生長，PH5.7生長，7％NaCl生長；石蕊牛奶不產(chǎn)酸，過氧化氫酶反應(yīng)產(chǎn)氣，接觸酶陽性；V.P反應(yīng)陽性，V.P液生長后PH6.0，利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇產(chǎn)酸，抗溶菌酶，不抗疊氮化鈉，水解淀粉，利用檸檬酸鹽，不利用丙酸鹽，水解淀粉，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，能產(chǎn)生蛋白酶。
(B.E.布坎南和N.E.吉本斯等，伯吉細(xì)菌鑒定手冊第八版)二、“功能菌液-SS”與“功能菌肥-SS”的制備與發(fā)酵工藝1、菌液的制備速生營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)液配方蛋白胨-8克；NaCl-5克；牛肉膏-5克；葡萄糖-10克；酵母膏-5克；山梨醇-5克；0.2％的5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉(促進(jìn)菌落快速良好生長)-1毫升；MgSO4·7H2O-0.2克；KCl-0.2克；(NH4)H2PO4-1克；酒石酸鈉-0.09克；鉬酸銨-0.035克；FeCl2-0.098克；ZnSO4-0.8克；MnCl2-0.07克；CaCl2-0.3克；CuSO4-0.2克；NaHCO3-20毫克；MnSO4-5毫克；營養(yǎng)瓊脂-3克；添加蒸餾水至1000毫升；PH值6.5-7.5。
按上述配方將速生營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基配制好后，倒入三角搖瓶中，然后121℃高壓滅菌30分鐘，待冷卻后在超潔凈工作臺上，在無菌操作的條件下，將保存培養(yǎng)的蠟狀芽胞桿菌ACCC11077、地衣芽胞桿菌ACCC11106、枯草芽胞桿菌ACCC11088三個菌株各自配成菌液，分別接種到三角搖瓶中，每瓶接種比例為3％，在30℃條件下于搖床上振蕩培養(yǎng)72小時后，將三個菌株的菌液以1∶1∶1的比例混合搖勻，然后以3％的比例接種到發(fā)酵罐。
2、“功能菌液-SS”的發(fā)酵發(fā)酵罐速生營養(yǎng)液配方黃豆粉-3％；魚粉-2％；玉米粉-1％；蔗糖-0.3％；甘油-0.2％；酵母片-0.1％；10％鈣鎂磷肥溶液-2％；10％草木灰水上清液-1％；NaCO3-0.02％；NaCl-0.5％；5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉(促進(jìn)菌落快速良好生長)2ppm；營養(yǎng)瓊脂-3％；PH值6.5-7.5。
空罐在125℃/0.15Mpa壓力下滅菌30分鐘，裝料后在121℃/0.12Mpa下滅菌2小時。冷卻至30℃后按3％的比例接種；培養(yǎng)溫度30℃，24小時后增至35℃，48小時后降至32℃；通氣量開始在1∶1(v.v.m)，培養(yǎng)24小時后增至1∶1.5(v.v.m)，48小時后降至1∶1.2(v.v.m)。發(fā)酵至72小時發(fā)酵完畢，經(jīng)過鏡檢蠟狀芽胞桿菌ACCC11077、地衣芽胞桿菌ACCC11106、枯草芽胞桿菌ACCC11088的比例在1∶1∶1左右，含菌量達(dá)到80-100億/毫升時為合格產(chǎn)品。
發(fā)酵液可直接裝袋包裝制成復(fù)合共生的“功能菌液-SS”；發(fā)酵液以有機(jī)載體(腐殖酸銨、草炭粉、污泥粉)為吸附劑制成生物有機(jī)的“功能菌肥-SS。
3、“功能菌肥-SS”的配制吸附劑的制備將腐殖酸、草炭、污泥粉按2∶3∶5的比例混配，再加入千分之一的5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉混勻，經(jīng)121℃高溫高壓滅菌30分鐘。
營養(yǎng)液的制備尿素-20kg；磷酸二氫鉀-30kg；硫酸鉀-20kg；鉬酸銨-0.1kg；硫酸鎂0.1kg；檸檬酸鐵0.1kg；硫酸鋅0.1kg；硼酸0.1kg；加入100升水中溶解均勻后，經(jīng)121℃高溫高壓滅菌30分鐘。
菌肥的配制將滅菌后溫度降至30℃的吸附劑800kg加入攪拌裝置的容器內(nèi)，加入100升營養(yǎng)液，加入100升菌液，以每分鐘250-300轉(zhuǎn)的速度攪拌10分鐘，直至攪拌均勻，即為生物有機(jī)的“功能菌肥-SS”，該菌肥經(jīng)過鏡檢蠟狀芽胞桿菌ACCC11077、地衣芽胞桿菌ACCC11106、枯草芽胞桿菌ACCC11088的比例在1∶1∶1左右，總含菌量在5-8億個/克，雜菌數(shù)＜100個/克時為合格產(chǎn)品。
本發(fā)明的工藝流程詳見附

圖1。
三、“功能菌液-SS”與“功能菌肥-SS”的施用方法1、拌種每畝用30-50毫升菌液，加5倍的水均勻噴灑于種子表面，噴灑的過程中不斷的翻動，使菌液均勻粘附于種子表面，稍晾干后即可播種。
2、蘸根每畝根苗用30-50毫升菌液，按按每畝蘸根所需水量進(jìn)行稀釋，然后將根苗均勻蘸上菌液，稍晾干即可栽植。
3、灌根每畝用30-50毫升菌液，稀釋1000倍左右，隨灌溉水少量不斷地均勻噴灑于水中，灌溉水灌勻整個地塊為止。
如若滴灌，可直接加入滴灌水中。
4、底肥采用條施、穴施的方法將菌肥均勻?yàn)⑷霔l溝、穴內(nèi)和種子或植株的根部附近，然后覆土，最好再配合灌水。
本“功能菌液-SS”與“功能菌肥-SS”適用于小麥、玉米、水稻、大豆、棉花、花生、西瓜、黃瓜、韭菜、辣椒、茄子、西紅柿、果樹等多種植物，尤其是在土壤病蟲害發(fā)生較嚴(yán)重的地塊使用效果更好，能夠顯著抑制土壤病蟲害，包括枯黃萎病、線蟲、韭蛆、根腐等。
防病機(jī)理初步研究表明，該復(fù)合菌株可以分泌抗菌蛋白、溶菌酶、幾丁質(zhì)酶等，對真菌的分生孢子、細(xì)菌細(xì)胞、蟲蛆幾丁質(zhì)有溶解作用，對土壤中的有機(jī)質(zhì)有分解轉(zhuǎn)化的作用。施入土壤中可以迅速繁殖擴(kuò)增，能夠?qū)⑼寥乐斜还潭ǖ牧?、鉀等元素轉(zhuǎn)化為可被植物吸收利用的速效磷、鉀，可以與根瘤固氮菌良好共生，促進(jìn)植物對氮的吸收與利用。無毒無污染，不影響生態(tài)環(huán)境，在作物周圍土壤形成局部優(yōu)勢，可以在土壤中長期存在，但菌量會逐步下降。
實(shí)施例1、對大豆枯、黃萎病的防效浸種處理對大豆枯、黃萎病的防效苗期為100％，成株期為97.2％，田間灌根防效為83.6％，以菌肥做底肥防治效果為94.5％，增產(chǎn)26.2％。
實(shí)施例2、對西瓜枯、黃萎病的防效浸種與蘸根處理對西瓜枯萎病苗期防效為100％，成株期防效96.4％，田間灌根防效為88.7％，以菌肥作底肥防治效果為95.6％，增產(chǎn)26.8％。
實(shí)施例3、對大豆線蟲的防效浸種處理對大豆線蟲苗期的防效為100％，成株期防效為95.3％，田間灌根防效為85.8％，以菌肥作底肥防治效果為95.6％，增產(chǎn)28.5％。
實(shí)施例4、對黃瓜線蟲的防效浸種與蘸根處理對黃瓜線蟲苗期的防效為100％，成株期防效為93.2％，田間灌根防效為84.5％，以菌肥作底肥防治效果為92.4％，增產(chǎn)25.3％。
實(shí)施例5、對韭菜韭蛆的防效田間灌根防治效果為87.9％，以菌肥作底肥防治效果為92.1％，增產(chǎn)27.8％。
實(shí)施實(shí)例6、對辣椒疫病的防效浸種與蘸根處理對辣椒疫病苗期的防治效果為100％，成株期防效為94.8％，田間灌根防效為90.3％，以菌肥作底肥防治效果為93.6％，增產(chǎn)23.5％。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合共生的“功能菌液-SS”，其特征在于該復(fù)合共生菌液由蠟狀芽胞桿菌ACCC11077、地衣芽胞桿菌ACCC11106、枯草芽胞桿菌ACCC11088三個菌株組成，其比例為1∶1∶1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的“功能菌液-SS”，所述的三個菌株是在速生營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基的配方為蛋白胨-8克；NaCl-5克；牛肉膏-5克；葡萄糖-10克；酵母膏-5克；山梨醇-5克；0.2％的5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉-1毫升；MgSO4·7H2O-0.2克；KCl-0.2克；(NH4)H2PO4-1克；酒石酸鈉-0.09克；鉬酸銨-0.035克；FeCl2-0.098克；ZnSO4-0.8克；MnCl2-0.07克；CaCl2-0.3克；CuSO4-0.2克；NaHCO3-20毫克MnSO4-5毫克；營養(yǎng)瓊脂-20克；添加蒸餾水至1000毫升。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的“功能菌液-SS”，所述的三個菌株的發(fā)酵罐速生營養(yǎng)液配方是黃豆粉-3％；魚粉-2％；玉米粉-1％；蔗糖-0.3％；甘油-0.2％；酵母片-0.1％；10％鈣鎂磷肥溶液-2％；10％草木灰水上清液-1％；NaCO3-0.02％；NaCl-0.5％；5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉-2ppm；營養(yǎng)瓊脂-3％。
4.采用如權(quán)利要求1所述的“功能菌液-SS”防治土傳病蟲害的用途，用于防治大豆與西瓜的枯黃萎病、大豆與黃瓜的線蟲病、韭蛆。
5.一種生物有機(jī)的“功能菌肥-SS”，其特征在于該菌肥是以如權(quán)利要求1所述的“功能菌液-SS”的發(fā)酵液以有機(jī)載體為吸附劑制成生物有機(jī)的“功能菌肥-SS”。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的“功能菌肥-SS”，所述的有機(jī)載體為腐殖酸銨、草炭粉、污泥粉，三者的比例為2∶3∶5。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的“功能菌肥-SS”，該菌肥營養(yǎng)液的制備方法為將尿素-20kg；磷酸二氫鉀-30kg；硫酸鉀-20kg；鉬酸銨-0.1kg硫酸鎂0.1kg；檸檬酸鐵0.1kg；硫酸鋅0.1kg；硼酸0.1kg；加入100升水中溶解均勻后，經(jīng)121℃高溫高壓滅菌30分鐘。
8.采用如權(quán)利要求5所述的“功能菌肥-SS”防治土傳病蟲害的用途，用于防治大豆與西瓜的枯黃萎病、大豆與黃瓜的線蟲病、韭蛆。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種復(fù)合共生的“功能菌液－SS”，該菌液由蠟狀芽胞桿菌ACCC11077、地衣芽胞桿菌ACCC11106、枯草芽胞桿菌ACCC11088三個菌株組成，其比例為1∶1∶1?！肮δ芫海璖S”的發(fā)酵液以有機(jī)載體為吸附劑可制成生物有機(jī)的“功能菌肥－SS”。本發(fā)明的“功能菌液－SS”與“功能菌肥－SS”均可防治大豆與西瓜的枯黃萎病、大豆與黃瓜的線蟲病、韭蛆等土傳病蟲害。
文檔編號C12N1/00GK1616648SQ20041003119
公開日2005年5月18日 申請日期2004年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月14日
發(fā)明者任承才, 荀云端, 朱莉 申請人:北京天地新生力生物技術(shù)有限公司