專利名稱：細(xì)胞抑制劑及其晶形的發(fā)酵制備方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為1999年2月17日、申請(qǐng)?zhí)枮?9803121.6、發(fā)明名稱為“細(xì)胞抑制劑及其晶形的發(fā)酵制備方法”的申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及一種可以以工業(yè)規(guī)模用于生產(chǎn)愛潑斯龍的新的生物技術(shù)制備方法，尤其是一種用于濃縮培養(yǎng)基中的這些化合物的方法，以及用于發(fā)酵制備這些化合物的新的菌株。本發(fā)明還涉及可以由所述新方法獲得的愛潑斯龍的新晶形、尤其是愛潑斯龍B的新晶形，其在生產(chǎn)藥物制劑中的用途，包括這些新晶形的新的藥物制劑和/或這些化合物在治療如腫瘤之類的增殖性疾病中或者在生產(chǎn)適合于這種治療的藥物制劑中的用途。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)存的用于治療腫瘤的細(xì)胞毒性活性成分中，紫杉醇_(Taxol_)(紫杉醇；Bristol-Myers Squibb)—一種微管穩(wěn)定劑起到了重要的作用并且取得了顯著的商業(yè)上的成功。但是，紫杉醇具有許多缺點(diǎn)。具體地講，其在水中的溶解性極差便是一個(gè)問題。因而變得必須于含有Cremophor EL_(聚氧乙基化蓖麻油；BASF，Ludwigshafen，德國)的制劑中的紫杉醇_給藥。Cremophor EL_具有嚴(yán)重的副作用；例如它導(dǎo)致過敏反應(yīng)，其中至少在一個(gè)病例中甚至已經(jīng)導(dǎo)致病人的死亡。
盡管已將紫杉烷類微管穩(wěn)定抗癌劑稱贊為“可能是近十年來在抵抗癌癥的藥物裝備中最重要的補(bǔ)充”(參見Rowinsky E.K.《醫(yī)學(xué)年度回顧》48，353-374(1997))，并且盡管紫杉醇_在商業(yè)上的成功，但是這些化合物似乎仍然不能代表在癌癥化療中真正的巨大的突破。采用紫杉醇_的治療與一系列明顯的副作用有關(guān)，并且許多原發(fā)性致密腫瘤(即結(jié)腸和前列腺腫瘤)對(duì)該化合物僅僅產(chǎn)生很小程度的響應(yīng)(特別參見Rowinsky E.K.)。此外，通過獲得抗性機(jī)制可以損害、甚至可以完全中和紫杉醇的功效，尤其是那些基于磷蛋白超量表達(dá)的過程，其起到了活性成分的流出泵的作用，諸如由于多藥物轉(zhuǎn)運(yùn)糖蛋白“P-糖蛋白”的超量表達(dá)導(dǎo)致的“多藥物抗性”。
愛潑斯龍(epothilone)A和B代表具有下列通式的一類新的微管穩(wěn)定細(xì)胞毒性活性成分(參見Gerth，K.等人《抗生素雜志》49，560-3(1966)) 其中R表示氫(愛潑斯龍A)或甲基(愛潑斯龍B)。
與紫杉醇_相比，這些化合物具有下列優(yōu)點(diǎn)a)它們具有更好的水溶性，因而更易于制劑使用；b)據(jù)報(bào)道在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，它們對(duì)于抵御細(xì)胞的增殖同樣具有活性，其中這些細(xì)胞由于使它們具有“多藥物抗性”的P-糖蛋白流出泵的活性，顯示出對(duì)采用包括紫杉醇_在內(nèi)的其它化療劑治療的抗性(參見Bolag，D.M.等人“愛潑斯龍s，一類新的具有類似于紫杉醇作用機(jī)制的微管穩(wěn)定劑”《癌癥研究》55，2325-33(1995))；以及c)可以表明在體外它們對(duì)帶有修飾的β-微管蛋白的紫杉醇_-抗性卵巢癌細(xì)胞系仍然非常有效(參見Kowalski，R.J.等人《生物化學(xué)雜志》272(4)，2534-2541(1997))。
愛潑斯龍的藥物應(yīng)用方式(例如用于腫瘤的治療)可能類似于針對(duì)紫杉醇所述的方式，例如參見US 5.641.803；US 5.496.804；US5.565.478。
為了出于制藥的目的能夠大規(guī)模地使用愛潑斯龍，那么必須獲得合適數(shù)量的這些化合物。
迄今為止，在文獻(xiàn)中描述了通過粘細(xì)菌提取天然物質(zhì)，尤其是來自于細(xì)胞菌株纖維堆囊菌Soce90(在德國微生物保藏中心(GermanCollection of Microorganisms)以編號(hào)6773保藏，參見WO93/10121)的愛潑斯龍。為了獲得令人滿意的濃度的天然物質(zhì)、尤其是愛潑斯龍，在用于隨后提取的培養(yǎng)基中，總是事先加入以聚苯乙烯為基礎(chǔ)的吸附樹脂，例如Amberlite XAD-1180(Rohm & Haas，法蘭克福，德國)。
但是，該方法的缺點(diǎn)為在以大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，它帶來了大量的問題。樹脂球損害了閥門，管道堵塞，由于機(jī)械摩擦設(shè)備可能經(jīng)歷更多的磨損。樹脂球是多孔的，因而具有大的內(nèi)表面積(約為825m2/克樹脂)。由于封閉在樹脂中的空氣不被高壓滅菌，因此滅菌成為一個(gè)問題。于是，當(dāng)采用樹脂添加時(shí)，實(shí)際上不能大規(guī)模地實(shí)現(xiàn)該方法。
另一方面，在不添加樹脂球時(shí)，在培養(yǎng)基中不能實(shí)現(xiàn)令人滿意的濃度的愛潑斯龍。
令人吃驚的是現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)找到一條擺脫這一困境的方法的需要，它可以使得在不添加樹脂的情況下從微生物(特別是粘細(xì)菌)中獲得令人滿意的濃度的天然物質(zhì)，其中所述的微生物在培養(yǎng)基中產(chǎn)生如愛潑斯龍A或B之類的愛潑斯龍(特別是一定濃度的愛潑斯龍A和B)，于是可以使得在沒有上述缺點(diǎn)的情況下以技術(shù)和工業(yè)規(guī)模實(shí)現(xiàn)這些化合物(尤其是愛潑斯龍)的生產(chǎn)。
發(fā)明的詳細(xì)描述為了以生物技術(shù)的規(guī)模生產(chǎn)以下這些化合物，本發(fā)明一方面涉及一種用于濃縮培養(yǎng)基中的愛潑斯龍(尤其是愛潑斯龍A和/或B，特別是愛潑斯龍B)的方法，該方法包括產(chǎn)生這些化合物的微生物(尤其是粘細(xì)菌(作為天然物質(zhì)的生產(chǎn)者))、并從而將在培養(yǎng)基中可溶的復(fù)合物形成成分加入所述培養(yǎng)基中。
再一方面涉及相應(yīng)的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括相應(yīng)的復(fù)合物形成成分以及適于生產(chǎn)愛潑斯龍(尤其是愛潑斯龍A和/或B)的微生物，所述微生物尤其是粘細(xì)菌、特別是堆囊菌屬的微生物。
本發(fā)明再一方面涉及一種用于生產(chǎn)愛潑斯龍(尤其是愛潑斯龍A和/或B，尤其是兩種純的化合物，特別是愛潑斯龍B)的方法，其特征在于通過處理用于生物技術(shù)制備這些化合物的培養(yǎng)基，其中所述的培養(yǎng)基包括作為天然物質(zhì)生產(chǎn)者的產(chǎn)生這些化合物的微生物(尤其是粘細(xì)菌)以及向其中加入在培養(yǎng)基中可溶的復(fù)合物形成成分，以及接下來進(jìn)行純化來獲得愛潑斯龍，并且如果需要的話，分離愛潑斯龍(例如愛潑斯龍A和B)。
本發(fā)明第四方面涉及一種分離愛潑斯龍的方法，尤其是使愛潑斯龍A和B彼此分離的方法，其特征在于在反相柱中用包括低級(jí)烷基氰的洗脫液進(jìn)行的層析。
本發(fā)明再一方面涉及一種通過誘變獲得的纖維堆囊菌的菌株，所述菌株在其它都相同的條件下比纖維堆囊菌Soce90生產(chǎn)出更多的愛潑斯龍。
再一方面還涉及愛潑斯龍B的新的晶形。
本文以上和以下所使用的常用術(shù)語優(yōu)選具有以下給出的含義當(dāng)本文以上和以下提到參考文獻(xiàn)時(shí)，當(dāng)有需要時(shí)這些文獻(xiàn)插入本文。
詞頭“低級(jí)”總是表示相應(yīng)命名的基團(tuán)含有優(yōu)選最大值為7個(gè)的碳原子，特別是至多4個(gè)的碳原子，并且是支鏈或直鏈的。低級(jí)烷基例如可以是直鏈或支鏈的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)，并且例如為甲基、乙基、如異丙基或正丙基這樣的丙基、如異丁基、仲丁基、叔丁基或正丁基這樣的丁基或者還有如戊基或正戊基這樣的戊基。
用于生物技術(shù)制備愛潑斯龍的含有生產(chǎn)這些化合物的微生物(作為天然物質(zhì)的生產(chǎn)者，尤其是粘細(xì)菌)的培養(yǎng)基主要為這樣的一種培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括相應(yīng)的(天然存在的或者也可以通過培養(yǎng)或特別是通過遺傳修飾獲得的)微生物〔尤其是在某種情況下產(chǎn)生這些化合物的粘細(xì)菌的菌株，特別是堆囊菌屬的粘細(xì)菌，優(yōu)選(特別是對(duì)愛潑斯龍的生產(chǎn)而言)纖維堆囊菌Soce90類型的微生物(參見WO93/10121)，或者由此(例如通過誘變或重組基因技術(shù))或由該粘細(xì)菌的部分衍生的生物材料，尤其是相應(yīng)衍生的菌株，特別是具有參考號(hào)為BCE33/10的菌株或其突變株〕和水以及此外優(yōu)選的培養(yǎng)基的其它的常規(guī)和合適的成分〔諸如生物聚合物，糖，氨基酸，鹽，核酸，維生素，抗生素，化學(xué)信息素，生長基質(zhì)，來自如酵母這樣的生物材料的提取物或其它的細(xì)胞提取物，豆粉，如馬鈴薯淀粉這樣的淀粉和/或痕量元素(例如呈配合鍵合形式的鐵離子)〕或這些成分和/或其類似添加物的全部或一些的適當(dāng)組合。相應(yīng)的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的，并且可以通過公知的方法生產(chǎn)(例如參見在本公開文本的實(shí)施例中或在WO 93/10121中的培養(yǎng)基)。
一種優(yōu)選的粘細(xì)菌為通過紫外光誘變的并選擇愛潑斯龍A和/或B的形成比纖維堆囊菌Soce90(Soce90菌株以編號(hào)6773保藏在DSM中)有所增加的菌株，尤其是突變株BCE33/10，該突變株于1998年2月9日以編號(hào)DSM11999保藏在德意志微生物與細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德國)中。
菌株BCE33/10的菌株培養(yǎng)和形態(tài)描述該菌株可以在例如位于ST21無機(jī)鹽瓊脂(0.1％KNO3；0.1％MgSO4×7H2O；0.1％CaCl2×2H2O；0.1％K2HPO4；0.01％MnSO4×7H2O；0.02％FeCl3；0.002％酵母提取物；標(biāo)準(zhǔn)的痕量元素溶液；1％瓊脂)之上的濾紙上以纖維素作為唯一的碳源和能源并以硝酸鉀作為唯一的氮源進(jìn)行生長。在該培養(yǎng)基上形成了暗紅褐色至黑褐色的子實(shí)體。它們由小孢子囊組成(直徑約為15-30μm)并且以不同大小的密集的堆積和填塞的形式存在。
營養(yǎng)型桿菌具有堆囊菌屬典型的形狀(相當(dāng)緊密，在相差顯微鏡下為具有寬闊圓形末端的暗色圓柱形桿菌，平均為3-6μm長、1μm厚)。
愛潑斯龍主要為愛潑斯龍A和/或B，但是還有其它的愛潑斯龍，例如在國際申請(qǐng)WO 97/19086和WO 98/22461中命名的愛潑斯龍C和D，在WO 98/22461中命名的愛潑斯龍E和F，以及可以從相應(yīng)的微生物中獲得的其它的愛潑斯龍。
水溶性復(fù)合物形成成分主要為水溶性的寡肽或多肽的衍生物或者特別為環(huán)狀或螺旋結(jié)構(gòu)的寡糖或多糖的衍生物，該成分形成分子內(nèi)空腔，由于其充分的疏水特性從而該成分在某一位置上結(jié)合愛潑斯龍(尤其是愛潑斯龍A和/或愛潑斯龍B)。尤其優(yōu)選的水溶性復(fù)合物形成成分為選自環(huán)糊精或(特別是)環(huán)糊精衍生物的物質(zhì)或其混合物。
環(huán)糊精為由α-D-吡喃型葡萄糖組成的環(huán)狀(α-1，4)連接的寡糖，它具有相當(dāng)疏水的中央空腔和親水的外表面積。
具體區(qū)分如下(圓括號(hào)中的數(shù)字給出了每分子中葡萄糖單元的數(shù)目)α-環(huán)糊精(6)，β-環(huán)糊精(7)，γ-環(huán)糊精(8)，δ-環(huán)糊精(9)，ε-環(huán)糊精(10)，ζ-環(huán)糊精(11)，η-環(huán)糊精(12)和θ-環(huán)糊精(13)。尤其優(yōu)選的是δ-環(huán)糊精，并且特別是α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精或γ-環(huán)糊精或其混合物。
環(huán)糊精衍生物主要為以上提到的環(huán)糊精的衍生物，尤其是α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精或γ-環(huán)糊精的衍生物，主要為那些其中的一個(gè)或多個(gè)多達(dá)所有的羥基(每個(gè)葡萄糖基團(tuán)有3個(gè))被醚化或酯化的物質(zhì)。醚主要為烷基醚，尤其是低級(jí)烷基醚，諸如甲基醚或乙基醚、還有丙基醚或丁基醚；芳基-羥基烷基醚，諸如苯基-羥基-低級(jí)烷基醚，尤其是苯基-羥乙基醚；羥基烷基醚，特別是羥基-低級(jí)烷基醚，尤其是2-羥乙基醚、如2-羥丙基醚之類的羥丙基醚或者如2-羥丁基醚之類的羥丁基醚；羧烷基醚，特別是羧基-低級(jí)烷基醚，尤其是羧甲基醚或羧乙基醚；衍生的羧烷基醚，特別是其中衍生的羧基為被醚化或酰胺化羧基(主要為氨基羰基、單-低級(jí)烷基-氨基羰基或二-低級(jí)烷基-氨基羰基、嗎啉代羰基、哌啶子基羰基、吡咯烷子基羰基或哌嗪子基羰基，或者烷氧羰基)的衍生的羧基-低級(jí)烷基醚，特別是低級(jí)烷氧羰基-低級(jí)烷基醚，例如甲氧羰基丙基醚或乙氧羰基丙基醚；磺烷基醚，特別是磺基-低級(jí)烷基醚，尤其是磺丁基醚；其中的一個(gè)或多個(gè)羥基被下列通式的基團(tuán)醚化的環(huán)糊精-O-[alk-O-]n-H其中alk為烷基，尤其是低級(jí)烷基，n為2-12，尤其是2-5，特別是2或3的整數(shù)；其中的一個(gè)或多個(gè)羥基被下列通式的基團(tuán)醚化的環(huán)糊精 其中R’為氫、羥基、-O-(alk-O-)z-H、-O-(alk(-R)-O-)n-H或-O-(alk(-R)-O-)q-alk-CO-Y；在所有的情況下，alk均為烷基，尤其是低級(jí)烷基；m，n，p，q和z為1-12，優(yōu)選1-5，特別是1-3的整數(shù)；并且Y為OR1或NR2R3，其中R1、R2和R3彼此獨(dú)立地為氫或低級(jí)烷基，或者R2和R3與相連的氮合起來表示嗎啉代、哌啶子基、吡咯烷子基或哌嗪子基；或?yàn)橹ф湱h(huán)糊精，其中存在與其它糖分子的醚化或形成的縮醛，尤其是葡糖基-(G2-β-環(huán)糊精)、二葡糖基-(G2-β-環(huán)糊精)、麥芽糖基-環(huán)糊精或二麥芽糖基-環(huán)糊精、或者為N-乙酰氨基葡糖基-環(huán)糊精或氨基葡糖基-環(huán)糊精、N-乙酰氨基半乳糖基-環(huán)糊精或氨基半乳糖基-環(huán)糊精。
酯主要為烷?；ィ貏e是低級(jí)烷?；?，如環(huán)糊精乙酰基酯。
具有其中同時(shí)存在兩個(gè)或多個(gè)不同的所說醚和酯基的環(huán)糊精也是可能的。
兩種或多種所說環(huán)糊精和/或環(huán)糊精衍生物的混合物也可以存在。
特別給出的優(yōu)選物為α-，β-或γ-環(huán)糊精或其低級(jí)烷基醚(諸如甲基-β-環(huán)糊精或者特別為2，6-二-O-甲基-β-環(huán)糊精)，或者特別為其羥基低級(jí)烷基醚(諸如2-羥丙基-α-環(huán)糊精，2-羥丙基-β-環(huán)糊精或2-羥丙基-γ-環(huán)糊精)。
優(yōu)選以0.02-10％的濃度向培養(yǎng)基中加入環(huán)糊精或環(huán)糊精的衍生物，優(yōu)選濃度為0.05-5％，尤其是0.1-4％，例如為0.1-2％，其中所述濃度為重量/體積(w/v)的百分濃度(w/v)。
環(huán)糊精或環(huán)糊精的衍生物是公知的并且可以通過公知的方法生產(chǎn)(例如參見US 3,459,731；US 4,383,992；US 4,535,152；US4,659,696；EP 0 094 157；EP 0 149 197；EP 0 197 571；EP 0 300526；EP 0 320 032；EP 0 499 322；EP 0 503 710；EP 0 818 469；WO 90/12035；WO 91/11200；WO 93/19061；WO 95/08993；WO 96/14090；GB 2,189,245；DE 3,118,218；DE 3,317,64以及其中提到的參考文獻(xiàn)，所述文獻(xiàn)也參閱了環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的合成，或者還參閱T.Loftsson與M.E.Brewster(1996)“環(huán)糊精的藥物應(yīng)用藥物的增溶作用和穩(wěn)定作用”《藥物科學(xué)雜志》85(10)1017-1025；R.A.Rajewski與V.J.Stella(1996)“環(huán)糊精的藥物應(yīng)用體內(nèi)藥物傳遞”《藥物科學(xué)雜志》85(11)1142-1169)。
在以下對(duì)處理和純化的描述中，將愛潑斯龍理解為可以從相應(yīng)的微生物獲得的愛潑斯龍，優(yōu)選愛潑斯龍C、D、E、F，或者尤其是愛潑斯龍A或特別是愛潑斯龍B。如果不作其它聲明的話，在提到“愛潑斯龍”的地方，該詞意指包括單獨(dú)的愛潑斯龍或混合物在內(nèi)的通用術(shù)語。
通過常規(guī)的方法進(jìn)行愛潑斯龍的處理首先，通過過濾或離心(管式離心機(jī)或分離器)將培養(yǎng)物分離為液相(離心液或?yàn)V液)和固相(細(xì)胞)。然后，將在離心液或?yàn)V液中發(fā)現(xiàn)的(大)部分的愛潑斯龍直接與合成樹脂混合，所述的樹脂例如為以聚苯乙烯為基體的樹脂(下文又簡(jiǎn)略地稱作聚苯乙烯樹脂)，諸如Amberlite XAD-16[Rohm & Hass德國公司，法蘭克福]或Diaion HP-20[Resindion S.R.L.，MitsubishiChemical Co.，Milan](優(yōu)選離心液與樹脂的體積之比約為10∶1-100∶1，優(yōu)選約為50∶1)。在接觸了優(yōu)選0.25-50個(gè)小時(shí)(尤其是0.8-22個(gè)小時(shí))后，例如通過過濾或離心分離出樹脂。如果需要的話，在吸附后，用強(qiáng)的極性溶劑(優(yōu)選用水)洗滌樹脂。然后用合適的溶劑(尤其是用醇、特別是用異丙醇)實(shí)現(xiàn)愛潑斯龍的解吸。然后特別是在循環(huán)蒸發(fā)器中，優(yōu)選通過事先、同時(shí)或隨后加入水，從溶劑中除去溶劑相(尤其是異丙醇相)，從而在必要時(shí)進(jìn)行濃縮，并且用適合于形成第二相的溶劑(諸如酯，例如低級(jí)鏈烷酸的低級(jí)烷醇酯，通常為醋酸乙酯或醋酸異丙酯)萃取得到的水相。因而愛潑斯龍被轉(zhuǎn)移到有機(jī)相中。然后例如使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，將有機(jī)相濃縮到所需的程度、優(yōu)選濃縮至干燥。
接下來，采用下列步驟進(jìn)行進(jìn)一步的處理，其中通過用腈洗脫的反相層析的純化步驟是一步有創(chuàng)造性的步驟、因而是必須的，而其它步驟是任選的—分子過濾(凝膠層析)，例如在諸如Sephadex LH-20(Pharmacia，Uppsala，瑞典)之類材料的柱中以諸如甲醇之類的醇作洗脫液；—在被合適的溶劑溶解后通過反相層析分離愛潑斯龍，并用腈/水的混合物洗脫(必須)，優(yōu)選特征在于在充滿烴鏈(如含有18個(gè)碳原子的烴鏈)的材料(尤其是RP-18材料)的柱中進(jìn)行層析，并采用包括腈(尤其是低級(jí)烷基腈、特別是乙腈)的洗脫液，特別是采用腈/水的混合物(尤其是乙腈/水的混合物)，優(yōu)選腈與水之比約為1∶99-99∶1，該比值主要介于1∶9和9∶1之間，例如介于2∶8和7∶3之間，例如為3∶7或4∶6。
—單次或多次提取兩相體系中的殘余物(尤其是在蒸發(fā)之后)，所述的兩相體系由水和與水不混溶的溶劑組成，所述與水不混溶的溶劑優(yōu)選酯、特別是低級(jí)鏈烷酸的低級(jí)烷酯，如醋酸乙酯或醋酸異丙酯；—吸附層析，特別是通過加入到硅膠柱中并用合適的溶劑或溶劑的混合物洗脫，所述的溶劑混合物尤其是酯/烴的混合物，例如鏈烷酸的低級(jí)烷基酯/C4-C10-烷烴，尤其是醋酸乙酯或醋酸異丙酯/正己烷，其中酯與烴之間的比值優(yōu)選在99∶1-1∶99的范圍內(nèi)，優(yōu)選10∶1-1∶10，例如為4∶1；—在諸如醇(例如甲醇)這樣合適的溶劑中溶解殘余物，所述殘余物可以是在濃縮后獲得的；—與活性炭混合并將其除去；—例如從合適的溶劑或溶劑混合物中重結(jié)晶，所述溶劑或溶劑混合物例如由酯、酯/烴混合物或醇組成，尤其是1∶10-10∶1的醋酸乙酯或醋酸異丙酯∶甲苯的混合物，優(yōu)選2∶3(愛潑斯龍A)或者甲醇或醋酸乙酯(愛潑斯龍B)；由此在所采用的每個(gè)步驟之間，必要時(shí)濃縮得到的溶液或懸浮液，和/或使液體組分和固體組分彼此分離，特別是通過過濾或離心溶液/懸浮液加以分離。下面提到的更為精確的定義可以優(yōu)選用于以上單個(gè)步驟中。
優(yōu)選如下進(jìn)行處理和純化在收獲后，通過離心(管式離心機(jī)或分離器)將培養(yǎng)物分離為液相(離心液)和固相(細(xì)胞)。在離心液中發(fā)現(xiàn)了大部分的愛潑斯龍，然后將其直接與聚苯乙烯樹脂〔諸如Amberlite XAD-16[Rohm & Hass德國公司，法蘭克福]或Diaion HP-20[Resindion S.R.L.，Mitsubishi Chemical Co.，Milan](優(yōu)選離心液與樹脂的體積之比約為10∶1-100∶1，優(yōu)選約為50∶1)〕混合并在攪拌器中攪拌。在該步驟中，愛潑斯龍從環(huán)糊精中被轉(zhuǎn)移到樹脂中。在接觸大約1小時(shí)后，通過離心或過濾分離出樹脂。通過把樹脂放在柱中并使離心液流過樹脂，也可以在層析柱中實(shí)現(xiàn)愛潑斯龍吸附到樹脂上。在吸附后，用水洗滌樹脂。用異丙醇實(shí)現(xiàn)愛潑斯龍從樹脂上的解吸。然后特別是在循環(huán)蒸發(fā)器中，優(yōu)選通過加入水來從異丙醇相中分離異丙醇，并用醋酸乙酯萃取得到的水相。愛潑斯龍從水相轉(zhuǎn)移到醋酸乙酯相中。然后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，將醋酸乙酯萃取液濃縮至干。隨后，通過分子過濾(例如Sephadex LH-20[Pharmacia，Uppsala，瑞典]并以甲醇作洗脫液)達(dá)到愛潑斯龍的初始濃度。來自分子過濾的峰級(jí)分含有愛潑斯龍A和B并且具有大于10％的總愛潑斯龍含量。把這些含有混合的愛潑斯龍A和B的峰級(jí)分分離成單個(gè)的組分，接下來在“反相”柱〔例如RP-18相(在每條鏈中由含18個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)改性的相)〕中用合適的洗脫液〔優(yōu)選一種含有腈(如乙腈)的洗脫液(比起例如用甲醇這樣的醇的洗脫，這會(huì)提供更好的分離)〕進(jìn)行層析。在愛潑斯龍B之前，愛潑斯龍A先洗脫下來。含有愛潑斯龍B的峰級(jí)分可能仍然含有小部分的愛潑斯龍A，這可以通過在RP-18上的進(jìn)一步分離來除去。最后，從醋酸乙酯∶甲苯＝2∶3中直接結(jié)晶出愛潑斯龍A的級(jí)分，并從甲醇或醋酸乙酯中結(jié)晶出愛潑斯龍B的級(jí)分。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案為了通過生物技術(shù)制備以下這種(這些)化合物，發(fā)明優(yōu)選涉及一種用于濃縮培養(yǎng)基中的愛潑斯龍(尤其是愛潑斯龍A和/或B，特別是愛潑斯龍B)的方法，所述的培養(yǎng)基含有適合于該制備的微生物(尤其是堆囊菌屬的菌株，尤其是纖維堆囊菌Soce90類型的菌株，或由其產(chǎn)生的突變株，特別是具有參考號(hào)為BCE 33/10的菌株)、水以及其它常用的培養(yǎng)基合適的成分，并從而將環(huán)糊精或環(huán)糊精的衍生物或者這些化合物的兩種或多種的混合物加入培養(yǎng)基中，尤其是一種或多種、優(yōu)選一種或兩種或多種選自下列的環(huán)糊精α-環(huán)糊精(6)，β-環(huán)糊精(7)，γ-環(huán)糊精(8)，δ-環(huán)糊精(9)，ε-環(huán)糊精(10)，ζ-環(huán)糊精(11)，η-環(huán)糊精(12)和θ-環(huán)糊精(13)，尤其是α-環(huán)糊精，β-環(huán)糊精或γ-環(huán)糊精；或者主要為選自下列環(huán)糊精衍生物的環(huán)糊精衍生物或環(huán)糊精衍生物的混合物，其中一個(gè)或多個(gè)多達(dá)所有的羥基被醚化為烷基醚，尤其是低級(jí)烷基醚，諸如甲基醚或乙基醚、還有丙基醚或丁基醚；芳基-羥基烷基醚，諸如苯基-羥基-低級(jí)烷基醚，尤其是苯基-羥乙基醚；羥基烷基醚，特別是羥基-低級(jí)烷基醚，尤其是2-羥乙基醚，如2-羥丙基醚之類的羥丙基醚或者如2-羥丁基醚之類的羥丁基醚；羧烷基醚，特別是羧基-低級(jí)烷基醚，尤其是羧甲基醚或羧乙基醚；衍生的羧烷基醚，特別是衍生的羧基-低級(jí)烷基醚，其中衍生的羧基為氨基羰基、單-低級(jí)烷基-氨基羰基或二-低級(jí)烷基-氨基羰基、嗎啉代羰基、哌啶子基羰基、吡咯烷子基羰基或哌嗪子基羰基，或烷氧羰基、特別是低級(jí)烷氧羰基，諸如優(yōu)選低級(jí)烷氧羰基-低級(jí)烷基醚，例如甲氧羰基丙基醚或乙氧羰基丙基醚；磺烷基醚，特別是磺基-低級(jí)烷基醚，尤其是磺丁基醚；其中的一個(gè)或多個(gè)羥基被下列通式的基團(tuán)醚化的環(huán)糊精-O-[alk-O-]n-H其中alk為烷基，尤其是低級(jí)烷基，n為2-12，尤其是2-5，特別是2或3的整數(shù)；其中的一個(gè)或多個(gè)羥基被下列通式的基團(tuán)醚化的環(huán)糊精
其中R’為氫、羥基、-O-(alk-O-)z-H、-O-(alk(-R)-O-)p-H或-O-(alk(-R)-O-)q-alk-CO-Y；在所有的情況下，alk均為烷基，尤其是低級(jí)烷基；m，n，p，q和z為1-12，優(yōu)選1-5，特別是1-3的整數(shù)；并且Y為OR1或NR2R3，其中R1、R2和R3彼此獨(dú)立地為氫或低級(jí)烷基，或者R2和R3與相連的氮合起來表示嗎啉代、哌啶子基、吡咯烷子基或哌嗪子基；或?yàn)橹ф湱h(huán)糊精，其中存在與其它糖分子的醚化或形成的縮醛，并且它們選自葡糖基-(G2-β-環(huán)糊精)、二葡糖基-(G2-β-環(huán)糊精)、麥芽糖基-環(huán)糊精或二麥芽糖基-環(huán)糊精、或者為N-乙酰氨基葡糖基-環(huán)糊精、氨基葡糖基-環(huán)糊精、N-乙酰氨基半乳糖基-環(huán)糊精和氨基半乳糖基-環(huán)糊精；或低級(jí)鏈烷?；?，如環(huán)糊精乙?；ァ?br> 給該方法提供了特別優(yōu)選的條件，其中以0.02-10％的濃度向培養(yǎng)基中加入環(huán)糊精和/或環(huán)糊精的衍生物，優(yōu)選濃度為0.005-10％、更優(yōu)選0.05-5％，最優(yōu)選0.1-4％，例如為0.1-2％，其中所述濃度為重量/體積(w/v)的百分濃度。
尤其優(yōu)選的是根據(jù)前述兩個(gè)段落之一的方法，其中環(huán)糊精衍生物選自環(huán)糊精(尤其是β-環(huán)糊精)以及羥基低級(jí)烷基-環(huán)糊精(尤其是2-羥丙基-α-環(huán)糊精、2-羥丙基-β-環(huán)糊精或2-羥丙基-γ-環(huán)糊精)；或其一種或多種的混合物；其中2-羥丙基-β-環(huán)糊精本身是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明還特別涉及一種培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基包括環(huán)糊精、環(huán)糊精衍生物或者兩種或多種復(fù)合物形成成分的混合物(所述的復(fù)合物形成成分選自環(huán)糊精和環(huán)糊精的衍生物，尤其是如上面第三段中定義的環(huán)糊精或環(huán)糊精的衍生物，特別是如上文第二段中定義的，或者這些化合物的一種或多種的混合物)以及適合于生產(chǎn)愛潑斯龍(尤其是愛潑斯龍A和/或B)的微生物(優(yōu)選來自堆囊菌屬的菌株，尤其是纖維堆囊菌的菌株，例如Soce90菌株或由其產(chǎn)生的突變株，特別是菌株BCE 33/10)。
本發(fā)明再一方面涉及一種用于生產(chǎn)愛潑斯龍A和/或B(尤其是兩種純的化合物，特別是愛潑斯龍B)的方法，其特征在于為了通過生物技術(shù)制備這些化合物，通過如上所述的方法處理培養(yǎng)基，其中已向培養(yǎng)基中加入在該培養(yǎng)基中可溶的復(fù)合物形成成分(特別是環(huán)糊精、環(huán)糊精的衍生物或者兩種或多種環(huán)糊精和/或環(huán)糊精衍生物的混合物)，例如通過離心將培養(yǎng)基分離成固相和液相(離心液)；將離心液與樹脂(尤其是聚苯乙烯樹脂)混合或者使其流過裝填有這類樹脂的柱子；必要時(shí)，用水洗滌樹脂；采用極性溶劑(尤其是醇，主要為如異丙醇這樣的低級(jí)鏈烷醇)從樹脂中解吸下愛潑斯龍；必要時(shí)，通過事先、同時(shí)或隨后加入水來進(jìn)行濃縮；加入與水不混溶的有機(jī)溶劑(例如酯，如醋酸乙酯)，例如通過攪拌使愛潑斯龍轉(zhuǎn)移到有機(jī)相中；必要時(shí)，濃縮有機(jī)相；通過針對(duì)低分子量化合物的分子篩由獲得的有機(jī)溶液濃縮愛潑斯龍；然后含有愛潑斯龍(尤其是愛潑斯龍A和/或B)的級(jí)分通過反相柱進(jìn)行分離，其中優(yōu)選用含有腈(如乙腈)的洗脫液洗脫(或者代之以含有醇(如甲醇)的洗脫液)；由此愛潑斯龍A和B分別被提取出來，并且如果需要的話可以通過重結(jié)晶進(jìn)一步濃縮。
本發(fā)明再一個(gè)優(yōu)選的方面涉及一種分離愛潑斯龍的方法，尤其是使愛潑斯龍A和B彼此分離的方法，其特征在于在反相柱中用含有低級(jí)烷基氰的洗脫液進(jìn)行的層析，其中在充滿烴鏈(如那些含有18個(gè)碳原子的烴鏈)的柱材料(尤其是RP-18材料)中進(jìn)行層析，并采用含有腈(尤其是低級(jí)烷基腈、特別是乙腈)的洗脫液，尤其是采用腈/水的混合物(特別是乙腈/水的混合物)，優(yōu)選腈與水之比約為1∶99-99∶1，該比值主要為1∶9-9∶1，例如介于2∶8和7∶3之間，例如為3∶7或4∶6。該分離過程接下來可以用分子篩進(jìn)行過濾，或者優(yōu)選在將來自含有復(fù)合物形成成分之培養(yǎng)基的愛潑斯龍吸附到樹脂上之后采用殘余物直接實(shí)現(xiàn)分離。比起采用如甲醇之類的醇洗脫而言，用含低級(jí)烷基氰的洗脫液分離的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)為更好地使愛潑斯龍A和B分離開來。
本發(fā)明優(yōu)選涉及一種用于制備愛潑斯龍的方法，該方法a)包括一種用于濃縮通過生物技術(shù)制備以下這種(這些)化合物的培養(yǎng)基中的愛潑斯龍(尤其是愛潑斯龍A和/或B，特別是愛潑斯龍B)的方法，所述的培養(yǎng)基含有適合于該制備的微生物(尤其是堆囊菌屬的菌株，尤其是纖維堆囊菌Soce90類型的菌株，或由其產(chǎn)生的突變株，特別是具有參考號(hào)為BCE 33/10的菌株)、水以及其它常用的培養(yǎng)基合適的成分，并從而將環(huán)糊精或環(huán)糊精的衍生物或者這些化合物的兩種或多種的混合物加入培養(yǎng)基中，尤其是一種或多種、優(yōu)選一種或兩種或多種選自下列的環(huán)糊精α-環(huán)糊精(6)，β-環(huán)糊精(7)，γ-環(huán)糊精(8)，δ-環(huán)糊精(9)，ε-環(huán)糊精(10)，ζ-環(huán)糊精(11)，η-環(huán)糊精(12)和θ-環(huán)糊精(13)，尤其是α-環(huán)糊精，β-環(huán)糊精或γ-環(huán)糊精；或者主要為選自下列環(huán)糊精衍生物的環(huán)糊精衍生物或環(huán)糊精衍生物的混合物，其中一個(gè)或多個(gè)多達(dá)所有的羥基被醚化為烷基醚，尤其是低級(jí)烷基醚，諸如甲基醚或乙基醚、還有丙基醚或丁基醚；芳基-羥基烷基醚，諸如苯基-羥基-低級(jí)烷基醚，尤其是苯基-羥乙基醚；羥基烷基醚，特別是羥基-低級(jí)烷基醚，尤其是2-羥乙基醚、如2-羥丙基醚之類的羥丙基醚或者如2-羥丁基醚之類的羥丁基醚；羧烷基醚，特別是羧基-低級(jí)烷基醚，尤其是羧甲基醚或羧乙基醚；衍生的羧烷基醚，特別是衍生的羧基-低級(jí)烷基醚，其中衍生的羧基為氨基羰基、單-低級(jí)烷基-氨基羰基或二-低級(jí)烷基-氨基羰基、嗎啉代羰基、哌啶子基羰基、吡咯烷子基羰基或哌嗪子基羰基或烷氧羰基、特別是低級(jí)烷氧羰基，諸如優(yōu)選低級(jí)烷氧羰基-低級(jí)烷基醚，例如甲氧羰基丙基醚或乙氧羰基丙基醚；磺烷基醚，特別是磺基-低級(jí)烷基醚，尤其是磺丁基醚；其中的一個(gè)或多個(gè)羥基被下列通式的基團(tuán)醚化的環(huán)糊精-O-[alk-O-]n-H其中alk為烷基，尤其是低級(jí)烷基，n為2-12，尤其是2-5，特別是2或3的整數(shù)；其中的一個(gè)或多個(gè)羥基被下列通式的基團(tuán)醚化的環(huán)糊精
其中R’為氫、羥基、-O-(alk-O-)z-H、-O-(alk(-R)-O-)n-H或-O-(alk(-R)-O-)q-alk-CO-Y；在所有的情況下，alk均為烷基，尤其是低級(jí)烷基；m，n，p，q和z為1-12，優(yōu)選1-5，特別是1-3的整數(shù)；并且Y為OR1或NR2R3，其中R1、R2和R3彼此獨(dú)立地為氫或低級(jí)烷基，或者R2和R3與相連的氮合起來表示嗎啉代、哌啶子基、吡咯烷子基或哌嗪子基；或?yàn)橹ф湱h(huán)糊精，其中存在與其它糖分子的醚化或形成的縮醛，并且它們選自葡糖基-(G2-β-環(huán)糊精)、二葡糖基-(G2-β-環(huán)糊精)、麥芽糖基-環(huán)糊精或二麥芽糖基-環(huán)糊精、或者為N-乙酰氨基葡糖基-環(huán)糊精、氨基葡糖基-環(huán)糊精、N-乙酰氨基半乳糖基-環(huán)糊精和氨基半乳糖基-環(huán)糊精；或低級(jí)鏈烷?；ィ绛h(huán)糊精乙?；?；以及b)包括用于分離愛潑斯龍，尤其是愛潑斯龍A和B，彼此分離的步驟，其特征在于在反相柱中用含有低級(jí)烷基氰的洗脫液進(jìn)行的層析，其中在充滿烴鏈(如那些含有18個(gè)碳原子的烴鏈)的柱材料(尤其是RP-18材料)中進(jìn)行層析，并采用含有低級(jí)烷基腈(尤其是乙腈)的洗脫液，特別是采用低級(jí)烷基腈/水的混合物(優(yōu)選乙腈/水的混合物)，優(yōu)選低級(jí)烷基腈與水之比約為1∶99-99∶1，該比值主要為1∶9-9∶1，例如介于2∶8和7∶3之間，例如為3∶7或4∶6，由此如果需要的話，可能采用進(jìn)一步的處理和純化步驟。
本發(fā)明還特別涉及來源于菌株纖維堆囊菌Soce90的突變株，尤其是可以通過誘變得到的纖維堆囊菌的菌株，其中的誘變優(yōu)選通過一個(gè)或多個(gè)紫外光誘導(dǎo)的誘變步驟(特別是通過在200-400nm(尤其是250-300nm)范圍內(nèi)的紫外光照射)，隨后在每個(gè)步驟中搜索愛潑斯龍的產(chǎn)生有所增加(特別是培養(yǎng)基中愛潑斯龍的濃度有所增加)的突變株，該菌株在其它都相同的條件下比纖維堆囊菌Soce90生產(chǎn)出更多的愛潑斯龍，特別是生產(chǎn)出更多的愛潑斯龍A和/或B，尤其是生產(chǎn)出更多的愛潑斯龍B，尤其是纖維堆囊菌菌株BCE 33/10。
本發(fā)明特別涉及在實(shí)施例中命名的獨(dú)立的方法步驟或其任意的組合、其中命名的培養(yǎng)基、其中描述的晶形和菌株。
本發(fā)明還涉及愛潑斯龍B的新的晶形，尤其是如變體(modification)B所述的愛潑斯龍B的晶形，特別是如變體A所述的愛潑斯龍B的晶形。
通過X射線圖可以具體地區(qū)分晶形。將借助衍射計(jì)并采用Cu-Kα1-照射制成的X射線圖優(yōu)選用于表征固態(tài)的有機(jī)化合物。X射線衍射圖特別成功地用于測(cè)定物質(zhì)的結(jié)晶變體。為了表征現(xiàn)有的愛潑斯龍B的結(jié)晶變體A和結(jié)晶變體B，在2°-35°的角度范圍內(nèi)(2θ)對(duì)在室溫下保持的物質(zhì)的樣品進(jìn)行測(cè)量。
下表表征了由愛潑斯龍B的結(jié)晶變體A(變體A)如此測(cè)得的X射線衍射圖(反射線和最重要的譜線的強(qiáng)度)。
本發(fā)明還特別涉及一種愛潑斯龍B的新的晶形，其特征在于熔點(diǎn)高于120℃，尤其是介于120℃和128℃之間，特別是124-125℃。令人吃驚的是，該數(shù)值比以前在文獻(xiàn)中描述的數(shù)值高出許多。本發(fā)明尤其涉及愛潑斯龍B的一種晶形，其特征在于具有晶形A的X射線衍射圖以及高于120℃的熔點(diǎn)，所述熔點(diǎn)尤其介于120℃和128℃之間，例如介于124℃和125℃之間。
下表表征了由愛潑斯龍B的結(jié)晶變體B(變體B)如此測(cè)得的X射線衍射圖(反射線和最重要的譜線的強(qiáng)度)。
所述新的晶形尤其穩(wěn)定，特別是晶形A被認(rèn)為是一種在熱力學(xué)上更為穩(wěn)定的晶形，因而它們作為活性成分適合于固體給藥形式、適合于以固體形式儲(chǔ)存或作為固體或液體給藥形式制備中的中間體(具有特別好的可儲(chǔ)存性能)。
本發(fā)明還涉及所述新的晶形(尤其是晶形B，但主要是晶形A(它們?cè)谙挛闹卸急环Q作活性成分))在生產(chǎn)藥物制劑中的用途，含有這些新晶形的新的藥物制劑，和/或它們?cè)谥委熑缒[瘤之類的增殖性疾病中的用途。在下文中，當(dāng)提到包括或含有所述活性成分的藥物制劑或組合物時(shí)，在液態(tài)組合物或者不再含有所述晶形的組合物的情況下，總是將這種情況理解為還是指可以采用所述晶形得到的藥物制劑(例如采用愛潑斯龍B的晶形A或B得到的輸注液)，即使它們不再含有各自的晶形(例如因?yàn)樗鼈兇嬖谟谌芤褐?。
本發(fā)明還特別涉及愛潑斯龍B的新晶形(尤其是晶形B或者特別是晶形A)在生產(chǎn)藥物制劑中的用途，其特征在于將愛潑斯龍B的新晶形與一種或多種載體混合。
本發(fā)明還涉及一種治療患有增殖性疾病的溫血?jiǎng)游锏姆椒?，其特征在于將?duì)治療所說疾病而言有效劑量的呈一種或所述新的晶形的愛潑斯龍B向需要所述治療的溫血?jiǎng)游锝o藥，還特別包括以那些采用所述新晶形之一生產(chǎn)的制劑治療；和/或愛潑斯龍B的新晶形在所述治療中的用途。
為了生產(chǎn)出藥物制劑，例如可以以這樣的一種方式使用所述的活性成分，即該藥物制劑含有有效量的活性成分以及或混合有顯著量的一種或多種有機(jī)或無機(jī)的、液體或固體的藥物可接受的載體。
本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，所述的組合物在治療如腫瘤之類的增殖性疾病中適合于向溫血?jiǎng)游?尤其是人)給藥，該組合物含有適合于治療所說疾病的量的活性成分以及藥物可接受的載體。
本發(fā)明的藥物組合物為那些打算經(jīng)腸內(nèi)(尤其是經(jīng)鼻子、直腸或口腔)或者優(yōu)選經(jīng)腸胃外(尤其是經(jīng)肌內(nèi)或經(jīng)靜脈內(nèi))向溫血?jiǎng)游?尤其是人)給藥的組合物，并且它們獨(dú)自含有有效劑量的活性成分或者同時(shí)含有顯著量的藥物可接受的載體。活性成分的劑量取決于溫血?jiǎng)游锏念愋?、體重、年齡和個(gè)體的條件、個(gè)體的藥物動(dòng)力學(xué)狀況、所治療的疾病以及給藥的類型。
藥物組合物含有約0.0001％-約95％的活性成分，其中優(yōu)選0.001％-10％或者20％-約90％。本發(fā)明的藥物組合物例如可以以單位劑量的形式存在，比如呈針劑、小瓶、栓劑、糖錠劑、片劑或膠囊的形式、本發(fā)明的藥物組合物是通過公知的方法生產(chǎn)的，例如通過常規(guī)的溶解、冷凍干燥、混合、造?；蛑圃旆椒ㄉa(chǎn)的。
優(yōu)選使用活性成分的溶液還有懸浮液、特別是水溶液或含水懸浮液，從而對(duì)在給藥前制備溶液或懸浮液來說也是有可能的，例如在獨(dú)自含有活性成分或者同時(shí)含有藥物可接受的載體(例如甘露糖醇)的凍干組合物的情況下。藥物組合物可以被滅菌和/或可以含有賦形劑(例如防腐劑、穩(wěn)定劑、保濕劑和/或乳劑形成劑、溶解助劑、用于調(diào)節(jié)滲透壓的鹽和/或緩沖液)，并且它們是通過公知的方法生產(chǎn)的，例如通過常規(guī)的溶解或冷凍干燥的方法生產(chǎn)。所提到的溶液或懸浮液可以包括增加粘度的物質(zhì)，諸如羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮或明膠。
在油中形成的懸浮液含有作為油組分的通常用于注射目的的植物油、合成油或半合成油。明顯的例子特別是液態(tài)脂肪酸酯，它含有作為酸部分的具有8-22個(gè)(尤其是12-22個(gè))碳原子的長鏈脂肪酸(例如月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕櫚酸、十七酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸)或相應(yīng)的不飽和酸(例如油酸、反油酸、芥酸、巴西烯酸或亞油酸)，如果需要的話還添加抗氧化劑(例如維生素E、β-胡蘿卜素或3，5-二-叔丁基-4-羥甲苯)。這些脂肪酸酯的醇部分優(yōu)選最多有6個(gè)碳原子并且為單羥基醇或多羥基醇(例如單羥基醇、二羥基醇或三羥基醇)，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或戊醇或其異構(gòu)體，但尤其是乙二醇和甘油。特別可以提到下列脂肪酸酯的例子肉豆蔻酸丙酯、棕櫚酸異丙酯、“Labrafil M 2375”(三烯酸聚氧乙烯甘油酯，Gattefosse，巴黎)、“Miglyol 812”(具有鏈長為8-12個(gè)碳原子的飽和脂肪酸甘油三酯，Huls AG，德國)，但特別是植物油(如棉子油、杏仁油、橄欖油、蓖麻油、芝麻油、豆油、特別是花生油)。
根據(jù)常規(guī)的方法，在無菌條件下生產(chǎn)注射或輸注制劑；同樣還適用于將所述的組合物裝填到安瓿瓶或小瓶和密封容器中。
優(yōu)先選擇含有活性成分和藥物可接受的有機(jī)溶劑的輸注液。
可用于本發(fā)明制劑的藥物可接受的有機(jī)溶劑可以選自所有為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟悉的這類溶劑。所述溶劑優(yōu)先選自醇，例如無水乙醇、乙醇/水混合物(優(yōu)選70％的乙醇)、聚乙二醇300、聚乙二醇400、聚丙二醇和N-甲基吡咯烷酮，尤其是聚丙二醇或70％的乙醇。
活性成分在制劑中以0.001-100mg/ml的濃度存在，優(yōu)選為約0.05-5mg/ml或?yàn)?-50mg/ml。
這種類型的制劑易于以小瓶或安瓿瓶的形式儲(chǔ)存。小瓶或安瓿瓶通常由玻璃(例如硼硅酸鹽)制成。對(duì)于從現(xiàn)有技術(shù)獲知的任何體積來說，小瓶或安瓿瓶都可能是合適的。它們優(yōu)選具有足夠的尺寸以便能夠容納0.5-5ml的制劑。
在給藥前，在可以將活性成分給藥至病人之前，必須在適合于靜脈內(nèi)給藥的含水介質(zhì)中稀釋制劑。
對(duì)輸注液而言，優(yōu)選其具有與體液相同或基本相同的滲透壓。所以，含水介質(zhì)含有等滲劑，等滲劑具有使輸注液的滲透壓與體液的滲透壓相同或基本相同的作用。
等滲劑可以選自所有為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟悉的試劑，例如甘露糖醇、右旋糖、葡萄糖和氯化鈉。等滲劑優(yōu)選葡萄糖或氯化鈉。等滲劑可以以使得輸注液與體液具有相同或基本相同的滲透壓的量來使用。所需的確切數(shù)量可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來測(cè)定并且取決于輸注液的組成和等滲劑的類型。
在含水介質(zhì)中等滲劑的濃度取決于所使用的各種試劑的類型。如果使用葡萄糖的話，那么優(yōu)選使用的濃度為1-5％w/v，其中優(yōu)選5％w/v。如果等滲劑為氯化鈉的話，優(yōu)選使用的量為1％以下，其中優(yōu)選約0.9％w/v。
可以用含水介質(zhì)稀釋輸注液。根據(jù)輸注液中所需的活性成分的濃度來選擇所用的含水介質(zhì)的量。優(yōu)選通過把含有輸注濃縮物的小瓶或安瓿瓶(參見上文)與含水介質(zhì)混合來生產(chǎn)輸注液，從而通過含水介質(zhì)獲得了介于200ml和1000ml之間的體積。輸注液可以含有其它常用于靜脈內(nèi)給藥的制劑中的添加劑。這些添加劑也包括抗氧化劑。
可以采用抗氧化劑來防止活性成分不通過氧化而降解?？寡趸瘎┛梢赃x自那些為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟悉的并適合于靜脈內(nèi)制劑的物質(zhì)?？寡趸瘎┑牧靠梢酝ㄟ^常規(guī)實(shí)驗(yàn)測(cè)定。作為一種代替加入抗氧化劑的方法或者另外附加的方法，可以通過限制氧(空氣)與輸注液接觸來實(shí)現(xiàn)抗氧化的作用。這可以以一種簡(jiǎn)單的方式通過用惰性氣體(例如氮?dú)饣驓鍤?處理含有輸注液的容器來實(shí)現(xiàn)。
可以通過在合適的容器(例如輸注袋或輸注瓶)中將安瓿瓶或小瓶與含水介質(zhì)(例如溶于WFI的5％葡萄糖溶液)混合來生產(chǎn)輸注液。
用于輸注液的容器可以選自與輸注液不發(fā)生反應(yīng)的常規(guī)容器。其中合適的是玻璃容器(尤其是硼硅酸鹽玻璃)，但諸如塑料輸注袋這樣的塑料容器也是優(yōu)選的。
塑料容器也可以由熱塑性聚合物制成。塑料材料也可以含有添加劑，例如軟化劑、填料、抗氧化劑、抗靜電劑或其它常用的添加劑。
適用于本發(fā)明的塑料應(yīng)當(dāng)是對(duì)滅菌所采用的高溫具有抵抗能力的。優(yōu)選的塑料輸注袋為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的PVC材料。
可以考慮很寬尺寸范圍的容器。當(dāng)選擇容器的尺寸時(shí)，所考慮的因素尤其是愛潑斯龍?jiān)诤橘|(zhì)中的溶解度、便于處理，并且如果合適的話還有容器的儲(chǔ)存。優(yōu)選使用能容納約200-1000ml輸注液的容器。
由于其良好的配制特性，本發(fā)明愛潑斯龍B的新晶形尤其適合于所說輸注液的簡(jiǎn)單和可重復(fù)的生產(chǎn)。但是，所述新的晶形尤其適合于生產(chǎn)含有固態(tài)活性成分的藥物制劑，例如口服制劑。
通過將活性成分與固體載體結(jié)合(如果需要的話，將所得的混合物造粒)并進(jìn)一步將該混合物加工成片劑、糖錠劑或膠囊(如果需要的話或者必要時(shí)，在加入合適的輔劑之后再加工成所述劑型)，可以獲得用于口服的藥物制劑。將它們包埋在塑料基質(zhì)中也是有可能的，這可以使以測(cè)量的量擴(kuò)散或釋放出活性成分。
合適的藥物可采用的載體尤其是填料〔如乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨醇、纖維素制劑、和/或磷酸鈣(例如磷酸三鈣或磷酸氫鈣)〕和粘合劑〔如淀粉(例如玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉或馬鈴薯淀粉)、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、和/或聚乙烯吡咯烷酮〕和/或如果需要的話，還有崩解劑〔如以上提到的淀粉、交聯(lián)的乙烯吡咯烷酮、瓊脂、海藻酸或其鹽(如海藻酸鈉)〕。輔劑特別為流動(dòng)促進(jìn)劑和潤滑劑，例如硅酸鹽、滑石、硬脂酸或其鹽(如硬脂酸鎂或硬脂酸鈣)和/或聚乙二醇。如果需要的話，給糖衣片提供合適的對(duì)胃液具有抗性的包衣(其中特別使用了濃縮的糖溶液、阿拉伯樹膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化鈦)或溶于合適有機(jī)溶劑的包衣溶液，或者為了生產(chǎn)出對(duì)胃液具有抗性的包衣，還有合適的纖維素制劑的溶液(如乙基纖維素鄰苯二甲酸酯或羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯)。膠囊是由明膠或果膠組成的干膠囊，并且如果需要的話，還加入諸如甘油或山梨醇之類的軟化劑。干膠囊可以含有呈顆粒狀的活性成分，例如還有填料(比如乳糖)、粘合劑(如淀粉)和/或潤滑劑(如滑石或硬脂酸鎂)，并且適當(dāng)時(shí)還有穩(wěn)定劑。在軟膠囊中，活性成分可以以溶解或優(yōu)選以懸浮的形式存在，由此加入油性輔劑(如脂油、石蠟油或液態(tài)丙二醇)；還可以添加穩(wěn)定劑和/或抗菌添加劑?？梢詫⑷玖匣蛏丶尤胨幤蛱且峦璧陌轮?，例如用以改善識(shí)別能力或用以區(qū)分活性成分的不同劑量。
優(yōu)選使用晶形B、特別是晶形A之一來治療增殖性疾病，其中把所述的晶形(優(yōu)選如上所述在制備輸注液中使用的)以一定的劑量向溫血?jiǎng)游?尤其是人)給藥，其中所述的劑量可以通過標(biāo)準(zhǔn)的方法(例如采用改進(jìn)的Fibronacci系列法)確定在最大耐受劑量(MTD)的20％-133％之間(優(yōu)選在25-100％之間)，其中對(duì)所有接下來的劑量而言，連續(xù)量的劑量的增加為100％、67％、50％和40％、隨后為33％；并且在必要時(shí)，對(duì)第一次劑量而言，在以上給出的劑量范圍內(nèi)一次或多劑量給藥，在使得接受治療的個(gè)體在前次給藥后得以充分恢復(fù)的一段時(shí)間后(特別是在第一次給藥后的一周或若干周，優(yōu)選2-10周，尤其是在每次前次給藥后的3-6周)進(jìn)行每一劑量的給藥。一般說來，該治療計(jì)劃(其中在進(jìn)行個(gè)體給藥以便恢復(fù)之間以足夠長的間隔以高劑量給藥1次、2次或若干次)優(yōu)于以較低的劑量更為頻繁地治療，這是因?yàn)樽≡翰惶l繁并且時(shí)間也更短，而且可以期望抗腫瘤效果的改善。對(duì)人來說，愛潑斯龍B的劑量?jī)?yōu)選為0.1-50mg/m2，其中優(yōu)選0.2-10mg/m2。
下面的實(shí)施例起到了解釋本發(fā)明、但卻沒有限制其范圍的作用。
注意當(dāng)處理愛潑斯龍時(shí)，考慮到它們的高毒性，必要時(shí)，必須采取適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)措施。
以下使用的750升發(fā)酵罐為購自Alpha AG公司(Nidau，瑞士)的精制鋼發(fā)酵罐。
實(shí)施例1通過突變和選擇制備菌株BCE33/10所用的菌株為突變株BCE33/10(于1998年2月9日以編號(hào)DSM11999保藏在德意志微生物與細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心中)，該菌株是通過如下所述的突變和選擇由菌株纖維堆囊菌Soce90得到的。在液體培養(yǎng)基中，突變株BCE33/10生成了Sorangia典型的桿菌形式，它具有圓形末端，長3-6μm，寬約1μm。纖維堆囊菌Soce90是從德意志微生物保藏中心以編號(hào)DSM 6773得到的。
突變株BCE33/10的制備包括三步用紫外光誘變的步驟和單個(gè)菌落的選擇。根據(jù)以下操作步驟實(shí)現(xiàn)詳細(xì)的過程來自安瓿瓶的培養(yǎng)把安瓿瓶中的DSM6773的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到位于50ml錐形瓶中的10ml G52培養(yǎng)基中，并在振蕩器(agitator)中于30℃、180rpm下培養(yǎng)6天。將5ml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50ml G52培養(yǎng)基中(位于200ml的錐形瓶中)，并在振蕩器中于30℃、180rpm下培養(yǎng)3天。
第一次紫外突變步驟與選擇將部分0.1ml的上述培養(yǎng)物平鋪在幾個(gè)含有瓊脂培養(yǎng)基S42的培養(yǎng)皿中。然后在500μwatt/cm2下，將平板各在紫外光(最大照射范圍為250-300nm)下暴露90或120秒。然后在30℃下培養(yǎng)平板7-9天，直到獲得1-2mm的單個(gè)菌落。然后，通過塑料環(huán)將來自單個(gè)菌落的100-150個(gè)菌落的細(xì)胞呈扇形各自平鋪在含有S42瓊脂的培養(yǎng)皿中(每個(gè)平板有4個(gè)扇區(qū))，并在30℃下培養(yǎng)7天。通過塑料環(huán)把已經(jīng)在面積約為1cm2的瓊脂上生長的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到位于50ml錐形瓶中的10ml G52培養(yǎng)基中，并在振蕩器中在180rpm、30℃下培養(yǎng)7天。把5ml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50ml G52培養(yǎng)基中(位于200ml的錐形瓶中)，并且在振蕩器中在180rpm、30℃下培養(yǎng)3天。把10ml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50ml 23B3培養(yǎng)基中，并在振蕩器中在180rpm、30℃下培養(yǎng)7天。
為了測(cè)定在該培養(yǎng)物中生成的愛潑斯龍A和愛潑斯龍B的量，接下來進(jìn)行如下的步驟。將50ml的培養(yǎng)液通過尼龍篩網(wǎng)(孔徑大小為150μm)過濾，將留存在篩網(wǎng)上的聚苯乙烯樹脂Amberlite XADl6用少量的水漂洗，接下來與過濾網(wǎng)一同加入到50ml的離心管(FalconLabware，Becton Dickinson AG Immengasse 7，4056 Basle)中。把10ml異丙醇(＞99％)加入到帶有過濾網(wǎng)的試管中。之后，為了使與樹脂結(jié)合的愛潑斯龍A和B溶解在異丙醇中，將密封好的試管在180rpm下振蕩1小時(shí)。隨后離心1.5ml的液體，并采用移液管將大約0.8ml的上清液加入HPLC試管中。如下所述，在產(chǎn)物分析部分中的HPLC分析中實(shí)現(xiàn)這些樣品的HPLC分析。HPLC分析測(cè)出哪一種培養(yǎng)物含有最高含量的愛潑斯龍B。從相應(yīng)菌落的上述扇形平板中(在此期間，該平板已于4℃下儲(chǔ)存)，通過塑料環(huán)將來自面積約為1cm2的瓊脂的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到位于50ml錐形瓶中的10ml G52培養(yǎng)基中，并在振蕩器中在180rpm、30℃下培養(yǎng)7天。將5ml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50ml G52培養(yǎng)基中(位于200ml的錐形瓶中)，并在振蕩器中在180rpm、30℃下培養(yǎng)3天。
第二次和第三次紫外突變步驟與選擇該步驟與上述第一次紫外突變步驟完全相同，只是將來自第一次紫外突變的最佳菌落所選出的培養(yǎng)物用于第二次誘變。對(duì)第三次誘變來說，相應(yīng)地使用來自第二次誘變的最佳菌落的培養(yǎng)物。在經(jīng)過第三次循環(huán)的紫外突變步驟、隨后針對(duì)愛潑斯龍B生產(chǎn)的改善選出得到的菌株后得到的最佳菌落對(duì)應(yīng)著突變株BCE33/10。
菌株的保存將G52培養(yǎng)基中3天齡的10ml培養(yǎng)物(位于200ml錐形瓶中的50ml培養(yǎng)基，30℃，180rpm)轉(zhuǎn)移到50ml的23B3培養(yǎng)基中(位于200ml錐形瓶中)，并在振蕩器中在180rpm、30℃下培養(yǎng)3天。以盡可能均勻的形式取出1ml該培養(yǎng)物(在每次取出之前，用手振蕩錐形瓶中的培養(yǎng)物)、同時(shí)還取出聚苯乙烯樹脂Amberlite XAD16(聚苯乙烯吸附樹脂，Rohm & Haas，法蘭克福，德國)，然后把它們裝入1.8ml的Nunc低溫試管(A/S Nunc，DK 4000 Roslide，丹麥)中，并且或在-70℃下或在液氮中儲(chǔ)存。
通過在空氣中將來自這些安瓿瓶的菌株加熱到室溫、接下來將低溫試管的整個(gè)內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到位于50ml錐形瓶中的10ml G52培養(yǎng)基中并在振蕩器中在180rpm、30℃下培養(yǎng)5-7天來實(shí)現(xiàn)所述菌株的培養(yǎng)。
培養(yǎng)基G52培養(yǎng)基酵母提取物，低鹽(Springer，Maison Alfort，法國) 2g/lMgSO4(7H2O)1g/lCaCl2(2H2O)1g/l脫脂豆粉(Mucedola S.r.l.，Settimo Milan，意大利) 2g/l馬鈴薯淀粉Noredux(Blattmann，Wadenswil，瑞士) 8g/l無水葡萄糖2g/lFe-EDTA 8g/l(產(chǎn)品編號(hào)03625，F(xiàn)luka Chemie AG，瑞士)1ml/l用KOH校正到pH7.4滅菌20分鐘120℃
S42瓊脂培養(yǎng)基如S.Jaoua等人在《質(zhì)?！?8，157-165(1992)中所述23B3培養(yǎng)基葡萄糖2g/l馬鈴薯淀粉Noredux(Blattmann，Wadenswil，瑞士) 20g/l脫脂豆粉(Mucedola S.r.1.，Settimo Milan，意大利) 16g/lFe-EDTA(產(chǎn)品編號(hào)03625，F(xiàn)luka，Buchs，瑞士)8g/lHEPES Fluka，Buchs，瑞士 5g/l聚苯乙烯樹脂XAD16(Rohm & Haas)2％v/v去離子水用NaOH校正pH值到7.8在120℃下滅菌20分鐘(HEPES＝4-(2-羥乙基)-哌嗪-1-乙磺酸)實(shí)施例2為了生產(chǎn)愛潑斯龍進(jìn)行培養(yǎng)菌株纖維堆囊菌Soce-90 BCE 33/10 (實(shí)施例1)菌株的保存如實(shí)施例1所述在液氮中保存培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)和中間培養(yǎng) G52主要培養(yǎng) 1B12G52培養(yǎng)基酵母提取物，低鹽(BioSpringer，Maison Alfort，法國)2g/lMgSO4(7H2O)1g/lCaCl2(2H2O)1g/l脫脂豆粉Soyamine 50T(Lucas Meyer，漢堡，德國) 2g/l馬鈴薯淀粉Noredux A-150(Blattmann，Waedenswil，瑞士) 8g/l無水葡萄糖2g/l
EDTA-Fe(III)-Na鹽(8g/l) 1ml/l用KOH校正到pH7.4滅菌20分鐘120℃1B12培養(yǎng)基馬鈴薯淀粉Noredux A-150(Blattmann，Waedenswil，瑞士) 20g/l脫脂豆粉Soyamine 50T(Lucas Meyer，漢堡，德國) 11g/lEDTA-Fe(III)-Na鹽 8mg/l用KOH校正到pH7.8滅菌20分鐘120℃添加環(huán)糊精以及環(huán)糊精的衍生物將不同濃度的環(huán)糊精(Fluka，Bunchs，瑞士或Wacker Chemie，慕尼黑，德國)單獨(dú)滅菌，并在接種前加入到1B12培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)把來自儲(chǔ)存于液氮中安瓿瓶中的纖維堆囊菌Soce-90 BCE 33/10的1ml懸浮液轉(zhuǎn)移到10ml G52培養(yǎng)基中(位于50ml錐形瓶中)，并在振蕩器中在180rpm、30℃、位移25mm下培養(yǎng)3天。將5ml該培養(yǎng)物加入到45ml的G52培養(yǎng)基中(位于200ml錐形瓶中)，并在振蕩器中在180rpm、30℃、位移25mm下培養(yǎng)3天。然后，將50ml該培養(yǎng)物加入到450ml的G52培養(yǎng)基中(位于2升錐形瓶中)，并在振蕩器中在180rpm、30℃、位移50mm下培養(yǎng)3天。
維持培養(yǎng)通過把50ml的培養(yǎng)物添加到450ml的G52培養(yǎng)基中(位于2升錐形瓶中)，每隔3-4天便過量接種培養(yǎng)物。通過從該維持培養(yǎng)物開始進(jìn)行所有的實(shí)驗(yàn)和發(fā)酵。
燒瓶中的實(shí)驗(yàn)(i)搖瓶中的預(yù)培養(yǎng)從500ml的維持培養(yǎng)物開始，用50ml的維持培養(yǎng)物接種1×450ml的G52培養(yǎng)基，并在振蕩器中在180rpm、30℃、位移50mm下培養(yǎng)4天。
(ii)搖瓶中的主要培養(yǎng)將添加了5g/l 4-嗎啉-丙磺酸(＝MOPS)粉末的40ml 1B12培養(yǎng)基(位于200ml錐形瓶中)與5ml濃縮了10倍的環(huán)糊精溶液混合，用10ml的預(yù)培養(yǎng)物接種，并在振蕩器中在180rpm、30℃、位移50mm下培養(yǎng)5天。
發(fā)酵以10升、100升和500升的規(guī)模進(jìn)行發(fā)酵。20升和100升發(fā)酵起到了中間培養(yǎng)步驟的作用。盡管預(yù)培養(yǎng)和中間培養(yǎng)都是以維持培養(yǎng)物10％(v/v)的量接種的，但主要培養(yǎng)則是以中間培養(yǎng)物20％(v/v)的量接種的。重要的是與振蕩培養(yǎng)相比，發(fā)酵培養(yǎng)基的成分是以包括接種物在內(nèi)的最終培養(yǎng)物的體積為基礎(chǔ)計(jì)算的。例如如果結(jié)合了18升培養(yǎng)基+2升接種物的話，那么針對(duì)20升稱出物質(zhì)的分量、但卻應(yīng)當(dāng)僅僅與18升混合在一起！搖瓶中的預(yù)培養(yǎng)從500ml的維持培養(yǎng)物開始，用50ml的維持培養(yǎng)物各自接種4×450ml的G52培養(yǎng)基(位于2升錐形瓶中)，并在振蕩器中在180rpm、30℃、位移50mm下培養(yǎng)4天。
中間培養(yǎng)，20升或100升20升用2升的預(yù)培養(yǎng)物接種位于總體積為30升的發(fā)酵罐中的18升G52培養(yǎng)基。培養(yǎng)持續(xù)3-4天，并且條件為30℃、250rpm、每分鐘每升液體通入0.5升空氣、0.5巴(超壓)、不控制pH。
100升用20升中間培養(yǎng)物中的10升接種位于總體積為150升的發(fā)酵罐中的90升G52培養(yǎng)基。培養(yǎng)持續(xù)3-4天，并且條件為30℃、150rpm、每分鐘每升液體通入0.5升空氣、0.5巴(超壓)、不控制pH。
主要培養(yǎng)，10升，100升或500升10升在7升水中對(duì)用于10升1B12培養(yǎng)基的培養(yǎng)基物質(zhì)進(jìn)行滅菌，然后加入1升無菌的10％2-(羥丙基)-β-環(huán)糊精溶液，并用20升中間培養(yǎng)物中的2升接種。主要培養(yǎng)持續(xù)的時(shí)間為6-7天，并且條件為30℃、250rpm、每分鐘每升液體通入0.5升空氣、0.5巴(超壓)、用H2SO4/KOH控制pH為pH7.6±0.5(即在pH7.1-8.1之間不進(jìn)行控制)。
100升在70升水中對(duì)用于100升1B12培養(yǎng)基的培養(yǎng)基物質(zhì)進(jìn)行滅菌，然后加入10升無菌的10％2-(羥丙基)-β-環(huán)糊精溶液，并用20升中間培養(yǎng)物中的20升接種。主要培養(yǎng)持續(xù)的時(shí)間為6-7天，并且條件為30℃、200rpm、每分鐘每升液體通入0.5升空氣、0.5巴(超壓)、用H2SO4/KOH控制pH為pH7.6+0.5。對(duì)100升發(fā)酵而言的接種鏈?zhǔn)疽馊缦戮S持培養(yǎng)物(500ml) 500升在350升水中對(duì)用于500升1B12培養(yǎng)基的培養(yǎng)基物質(zhì)進(jìn)行滅菌，然后加入50升無菌的10％2-(羥丙基)-β-環(huán)糊精溶液，并用100升中間培養(yǎng)物中的100升接種。主要培養(yǎng)持續(xù)的時(shí)間為6-7天，并且條件為30℃、120rpm、每分鐘每升液體通入0.5升空氣、0.5巴(超壓)、用H2SO4/KOH控制pH為pH 7.6±0.5。
產(chǎn)物分析制備樣品將50ml的樣品與2ml聚苯乙烯樹脂Amberlite XAD16(Rohm+Haas，法蘭克福，德國)混合，并在180rpm、30℃下振蕩1小時(shí)。隨后采用150μm的尼龍篩網(wǎng)過濾出樹脂，用少量的水洗滌，然后與過濾網(wǎng)一并加入到15ml的Nunc試管中。
從樹脂中洗脫產(chǎn)物將10ml異丙醇(＞99％)加入含有過濾網(wǎng)和樹脂的試管中。之后，在室溫下在Rota-混合器(Labinco BV，荷蘭)中振蕩密封的試管30分鐘。然后，離心2ml的液體并使用移液管將上清液加入到HPLC試管中。
HPLC分析柱Waters-Symetry C18，100×4mm，3.5μmWAT066220+初級(jí)柱3.9×20mmWAT054225溶劑A0.02％的磷酸B乙腈(HPLC級(jí))梯度41％B0-7分鐘100％B 7.2-7.8分鐘41％B8-12分鐘烘箱溫度30℃檢測(cè)250nm，UV-DAD檢測(cè)儀注射體積10μl保留時(shí)間Epo A4.30分鐘 Epo B5.38分鐘實(shí)施例2A添加環(huán)糊精和環(huán)糊精衍生物對(duì)所得的愛潑斯龍的濃度的作用此處測(cè)試的所有的環(huán)糊精衍生物都來自Fluka公司(Buchs，瑞士)。試驗(yàn)是在盛有50ml培養(yǎng)物的200ml搖瓶中進(jìn)行的。作為對(duì)照，使用了裝有吸附樹脂Amberlite XAD-16(Rohm & Haas，法蘭克福，德國)和沒有添加任何吸附劑的燒瓶。在培養(yǎng)5天后，可以通過HPLC測(cè)定下列愛潑斯龍的滴度
表1
1)除了Amberlite(％v/v)之外，所有的百分?jǐn)?shù)均為重量/體積百分?jǐn)?shù)(％w/v)在所采用的濃度下，少數(shù)測(cè)試的環(huán)糊精(2，6-二-O-甲基-β-環(huán)糊精，甲基-β-環(huán)糊精)顯示出對(duì)愛潑斯龍的生產(chǎn)沒有影響或者具有負(fù)面的影響。與不采用環(huán)糊精進(jìn)行的生產(chǎn)相比，1-2％的2-羥丙基-β-環(huán)糊精以及β-環(huán)糊精在實(shí)施例中使愛潑斯龍的生產(chǎn)量提高了6-8倍。
實(shí)施例2B通過1％的2-(羥丙基)-β-環(huán)糊精進(jìn)行10升發(fā)酵在15升的玻璃發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。培養(yǎng)基含有10g/l購自WackerChemie(慕尼黑，德國)的2-(羥丙基)-β-環(huán)糊精。在表2中描述了發(fā)酵的過程。6天后結(jié)束發(fā)酵并進(jìn)行處理。
表210升發(fā)酵的過程
實(shí)施例2C通過1％的2-(羥丙基)-β-環(huán)糊精進(jìn)行100升發(fā)酵在150升的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。培養(yǎng)基含有10g/l的2-(羥丙基)-β-環(huán)糊精。在表3中描述了發(fā)酵的過程。7天后收獲發(fā)酵產(chǎn)物并進(jìn)行處理。
表3100升發(fā)酵的過程
實(shí)施例2D通過1％的2-(羥丙基)-β-環(huán)糊精進(jìn)行500升發(fā)酵在750升的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。培養(yǎng)基含有10g/l的2-(羥丙基)-β-環(huán)糊精。在表4中描述了發(fā)酵的過程。7天后收獲發(fā)酵產(chǎn)物并進(jìn)行處理。
表4500升發(fā)酵的過程
實(shí)施例2E在不添加吸附劑的情況下進(jìn)行10升發(fā)酵的比較實(shí)施例在15升玻璃發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。培養(yǎng)基不含任何的環(huán)糊精或其它的吸附劑。在表5中描述了發(fā)酵的過程。沒有收獲和處理發(fā)酵產(chǎn)物。
表5沒有吸附劑時(shí)10升發(fā)酵的過程
實(shí)施例3愛潑斯龍的處理從500升主要培養(yǎng)物中分離從實(shí)施例2D的500升主要培養(yǎng)物中收獲的體積為450升，并采用Westfalia SA-20-06型澄清分離器(rpm＝6500)將其分離為液相(離心液+漂洗水＝650升)和固相(細(xì)胞＝約15kg)。在離心液中發(fā)現(xiàn)了大部分愛潑斯龍。離心過的細(xì)胞漿含有不到15％的所測(cè)愛潑斯龍的部分，并且不進(jìn)行進(jìn)一步的處理。然后，將650升離心液放入4000升的攪拌容器中，使其與10升Amberlite XAD-16(離心液與樹脂的體積比為65∶1)混合并進(jìn)行攪拌。在接觸大約2小時(shí)后，在Heine溢流離心機(jī)(籃子容量為40升；rpm＝2800)中離心除掉樹脂。將樹脂從離心液中取出并用10-15升的去離子水洗滌。通過攪拌樹脂兩次來實(shí)現(xiàn)解吸，其中每次都是在30升玻璃攪拌容器中用30升異丙醇處理30分鐘。采用吸濾器使異丙醇相與樹脂分離。然后在真空操作的循環(huán)蒸發(fā)器(Schmid-Verdampfer)中，通過加入15-20升水從合并的異丙醇相中除去異丙醇，并且每次都用10升醋酸乙酯萃取所得的大約10升的水相、如此共萃取3次。在30升玻璃攪拌容器中進(jìn)行萃取。在真空操作的循環(huán)蒸發(fā)器(schmid-Verdampfer)中將醋酸乙酯萃取物濃縮到3-5升，之后在真空下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(Buchi型)中濃縮至干。結(jié)果得到了50.2g的醋酸乙酯萃取物。將醋酸乙酯萃取物溶解在500ml甲醇中，采用折紙漏斗過濾掉不溶的部分，并將溶液加入到10kg的Sephadex LH 20柱(Pharmacia，Uppsala，瑞典)(柱直徑為20cm，裝填水平約為1.2m)中。用甲醇作洗脫液進(jìn)行洗脫。愛潑斯龍A和B主要存在于級(jí)分21-23中(級(jí)分的大小為1升)。在真空下，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將這些級(jí)分濃縮至干(總重為9.0g)。之后將這些Sephadex峰的級(jí)分(9.0g)溶解到92ml的乙腈∶水∶二氯甲烷＝50∶40∶2中，將該溶液經(jīng)過折紙漏斗過濾并加到RP柱(設(shè)備Prepbar 200，Merck；2.0kg LiChrospher RP-18Merck，顆粒大小為12μm，柱直徑為10cm，裝填水平為42cm；Merck，Darmstadt，德國)中。用乙腈∶水＝3∶7進(jìn)行洗脫(流速＝500ml/min；愛潑斯龍A的保留時(shí)間約為51-59分鐘；愛潑斯龍B的保留時(shí)間約為60-69分鐘)。在250nm下通過紫外檢測(cè)器監(jiān)測(cè)分級(jí)分離。在真空下，在Buchi-Rotavapor旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將所述級(jí)分濃縮至干。愛潑斯龍A峰級(jí)分的重量為700mg，根據(jù)HPLC(外標(biāo)法)，其含量為75.1％。愛潑斯龍B峰級(jí)分的重量為1980mg，根據(jù)HPLC(外標(biāo)法)，其含量為86.6％。最后，從5ml的醋酸乙酯∶甲苯＝2∶3中結(jié)晶出愛潑斯龍A的級(jí)分(700mg)，并產(chǎn)生了170mg的愛潑斯龍A的純結(jié)晶[根據(jù)HPLC的含量(％面積)＝94.3％]。從18ml甲醇中進(jìn)行愛潑斯龍B級(jí)分(1980mg)的結(jié)晶，并產(chǎn)生了1440mg的愛潑斯龍B的純結(jié)晶[根據(jù)HPLC的含量(％面積)＝99.2％]。熔點(diǎn)(愛潑斯龍B)例如124-125℃；愛潑斯龍B的1H-NMR數(shù)據(jù)如下500MHz-NMR，溶劑DMSO-d6。相對(duì)于TMS的化學(xué)位移δ(ppm)。s＝單峰；d＝雙峰；m＝多峰δ(多重性)積分(H的數(shù)目)7.34 (s) 16.50 (s) 15.28 (d) 15.08 (d) 1
4.46 (d) 14.08 (m) 13.47 (m) 13.11 (m) 12.83 (dd) 12.64 (s) 32.36 (m) 22.09 (s) 32.04 (m) 11.83 (m) 11.61 (m) 11.47-1.24(m) 41.18 (s) 61.13 (m) 21.06 (d) 30.89(d+s，重疊)6∑＝41在本實(shí)施例(實(shí)施例3)中，愛潑斯龍B是以結(jié)晶變體A的形式得到的，其特征在于具有變體A的X射線衍射圖(參見本發(fā)明公開內(nèi)容的一般性描述部分)。
實(shí)施例4愛潑斯龍B的結(jié)晶變體B將50mg的愛潑斯龍B(例如如上所述獲得的)懸浮在1ml異丙醇中并在25℃下振蕩24小時(shí)。過濾并干燥產(chǎn)物。在高真空下干燥后，獲得了呈白色結(jié)晶狀的愛潑斯龍B。該產(chǎn)物的結(jié)晶變體的特征在于具有變體B的X射線衍射圖(參見本發(fā)明公開內(nèi)容的一般性描述部分)。
權(quán)利要求
1.一種使愛潑斯龍彼此分離的方法，尤其是使愛潑斯龍A和B彼此分離的方法，其特征在于在反相柱中用含有低級(jí)烷基氰的洗脫液進(jìn)行的層析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中使用充滿了含18個(gè)碳原子的烴鏈的柱材料，并且所使用的洗脫液為水和乙腈的混合物。
3.通過誘變獲得的纖維堆囊菌的菌株，其中在其它都相同的條件下，該菌株比纖維堆囊菌Soce90生產(chǎn)出更多的愛潑斯龍。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的菌株，該菌株具有參考號(hào)BCE33/10。
5.具有參考號(hào)變體A的愛潑斯龍B的晶形，其特征在于具有以表格形式再現(xiàn)的X射線衍射圖，其是采用衍射計(jì)通過Cu-Kα1照射獲得的
6.具有參考號(hào)變體B的愛潑斯龍B的晶形，其特征在于具有以表格形式再現(xiàn)的X射線衍射圖，其是采用衍射計(jì)通過Cu-Kα1照射獲得的
7.一種藥物組合物，該藥物組合物含有權(quán)利要求5和6之一的活性成分以及藥物可接受的載體。
8.治療患有增殖性疾病的溫血?jiǎng)游锏姆椒?，該方法是通過將對(duì)治療所說疾病而言有效劑量的權(quán)利要求18和19之一的愛潑斯龍B向需要所述治療的溫血?jiǎng)游锝o藥。
9.權(quán)利要求5和6之一的晶形在治療增殖性疾病中的用途。
10.權(quán)利要求5和6之一的愛潑斯龍B的新晶形在生產(chǎn)藥物制劑中的用途，其中將這種類型的晶形與一種或多種載體混合。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于濃縮培養(yǎng)基中的愛潑斯龍的方法，一種用于生產(chǎn)愛潑斯龍的方法，一種用于分離愛潑斯龍A和B的方法與通過針對(duì)愛潑斯龍的生產(chǎn)通過誘變獲得的菌株，以及與其有關(guān)的方面。還描述了愛潑斯龍B的晶形。
文檔編號(hào)C12PGK1535971SQ200410034240
公開日2004年10月13日 申請(qǐng)日期1999年2月17日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月19日
發(fā)明者H·霍夫曼, M·馬恩克, K·麥莫特, F·彼特森, T·舒普, E·庫斯特斯, M·穆茲, H 霍夫曼, 厴, 固廝, 骺 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司