專利名稱：草酸氧化酶法檢測河豚毒素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
河豚毒素的檢測方法(快速檢測方法)背景技術(shù) 據(jù)本發(fā)明人通過查閱資料、文獻檢索所知，河豚毒素現(xiàn)有的快速簡便的檢測技術(shù)主要為小鼠生物法(MU法)及熒光檢測法。
小鼠生物法簡便快速，為日本的官方檢測河豚毒素的方法。但該類方法存在一些問題。首先，與河豚毒素共存的無機鹽(如氯化鈉，羧酸的單鈉鹽或雙鈉鹽)和疏水(或大分子)氨基酸可明顯地降低河豚毒素的相對毒力。其次，小鼠生物法檢測的結(jié)果為提取液的總毒性，而非其中河豚毒素的準(zhǔn)確含量。再次，由于小鼠個體之間的生物差異，造成該種檢測方法重復(fù)性差。最后，用該種方法進行檢測，需要進行小鼠儲備，及標(biāo)準(zhǔn)化的飼養(yǎng)管理，一般的養(yǎng)殖業(yè)主及消費部門難以實現(xiàn)。由于諸種原因，使得該種方法難于大范圍推廣普及。
熒光檢測法通過將河豚毒素用堿處理得到2-氨基-6-羥甲基-8-羥基喹啉，用熒光檢測器以激發(fā)波長370nm，發(fā)射波長495nm檢測。該方法快速，但需要昂貴的熒光檢測器，難于普及推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種河豚毒素的簡便快速的檢測方法。
本發(fā)明用強堿處理河豚毒素，得到與河豚毒素等摩爾量的2-氨基-6-羥甲基-8-羥基喹啉與草酸鹽。利用草酸氧化酶催化草酸鹽，得到與草酸鹽，也即與河豚毒素等摩爾量的過氧化氫。之后將顯色劑加入過氧化氫中，得到紫紅色物質(zhì)醌亞胺，通過在520nm比色即可定量河豚毒素的含量。顯色劑為自行配制制得。
本發(fā)明通過利用草酸氧化酶的高度特異性來檢測河豚毒素，許多干擾傳統(tǒng)檢測方法的因素均不會對檢測產(chǎn)生干擾。本發(fā)明對河豚毒素的提取純化要求簡單，只需脫脂濃縮即可，避免了傳統(tǒng)檢測方法中繁瑣的前處理如柱層析、固相萃取甚至親和層析等純化處理。本發(fā)明對檢測儀器的要求低，檢測過程易控制，不需要高級昂貴的檢測設(shè)備及復(fù)雜的操作技術(shù)。本發(fā)明檢測用時短，從河豚毒素的提取到檢測完成僅需4-5小時。


無下面通過實施例說明本發(fā)明具體實施方式
取三種蟲紋東方豚肝臟各5g，用0.1％乙酸溶液進行勻漿提取。將提取液用與提取液等體積的石油醚重復(fù)脫脂二次，減壓濃縮，然后用0.1％乙酸將提取液稀釋定容到5mL，此提取液1mL相當(dāng)于1.0g樣品。
取1mL的提取液，加入3mol/L氫氧化鈉溶液1mL，80-100℃加熱衍生化反應(yīng)45-60min，之后用酸調(diào)節(jié)pH值至3.80左右。取草酸氧化酶加入處理液中催化反應(yīng)7min。加入顯色劑，室溫成色15min。用可見分光光度計比色定量河豚毒素的含量，也可目測定量河豚毒素的大體含量。
三種河豚魚肝臟中河豚毒素的含量分別為1.60μg·g-1，1.82μg·g-1，4.16μg·g-1。
注河豚毒素分子式C11H17N3O8顯色劑的配制取1.0mg的辣根過氧化物酶，50mg4-氨基安替比林及0.1g的苯酚，溶于磷酸緩沖液(4mol/L，pH7.00)并定容到100mL備用。該顯色劑應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，一周之后會產(chǎn)生紅色干擾物質(zhì)。
草酸氧化酶、辣根過氧化物酶的介紹本方法中使用的草酸氧化酶提取自大麥苗，其最適作用溫度為38℃，最適pH值為3.80，分子量為130，000道，Km值為3.5×10-3M。
本方法中使用的辣根過氧化物酶提取自辣根，R.Z值≥3.0即可。
權(quán)利要求
1.保護將河豚毒素衍生化，然后通過檢測其衍生物草酸進行河豚毒素檢測的方法。
2.保護利用草酸氧化酶與辣根過氧化物酶進行河豚毒素檢測。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種河豚毒素的簡便快速的檢測方法。本發(fā)明用強堿處理河豚毒素，得到與河豚毒素等摩爾量的2－氨基－6－羥甲基－8－羥基喹啉與草酸鹽。利用草酸氧化酶將草酸鹽催化氧化成過氧化氫。之后通過顯色劑與過氧化氫反應(yīng)顯色，通過在520nm比色即可定量河豚毒素的含量。顯色劑為自行配制制得。本發(fā)明通過利用草酸氧化酶的高度特異性來檢測河豚毒素，抗干擾能力強；該方法對河豚毒素的提取純化要求簡單，只需脫脂濃縮即可；本發(fā)明對檢測儀器的要求低，不需要高級昂貴的檢測設(shè)備及復(fù)雜的操作技術(shù)，檢測過程易控制；本發(fā)明檢測用時短，僅需4－5小時即可完成檢測。
文檔編號C12Q1/28GK1778940SQ200410036380
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月22日
發(fā)明者林洪, 李德昆 申請人:中國海洋大學(xué)