專利名稱：可溶性il－4受體原核基因工程菌及以該受體為靶位的拮抗劑篩選模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組表達(dá)可溶性IL-4受體(sIL-4R)的原核基因工程菌，其特征在于所述菌株中具有含有sIL-4R的基因片段的重組表達(dá)載體。
本發(fā)明還涉及一種IL-4受體拮抗劑篩選模型，其特征在于利用本發(fā)明構(gòu)建的重組菌株表達(dá)的重組sIL-4R蛋白作為靶位，建立新藥篩選模型，利用ELISA方法篩選IL-4R拮抗劑，用于從化合物庫和天然產(chǎn)物中篩選獲得治療哮喘等過敏性疾病的藥物。
本發(fā)明進(jìn)一步的涉及所述篩選模型篩選IL-4受體拮抗劑的用途以及利用所述篩選模型獲得的IL-4受體拮抗劑。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞介素-4(IL-4)作為一種多功能的細(xì)胞因子在哮喘等變態(tài)性炎癥反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用。IL-4通過結(jié)合細(xì)胞表面的白介素-4受體(IL-4R)發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。可溶性白細(xì)胞介素4受體(sIL-4R)缺少跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，結(jié)合IL-4后不能產(chǎn)生信號傳遞介導(dǎo)IL-4的生物學(xué)活性，但sIL-4R與IL-4結(jié)合的高度特異性和極高的親和力使它非常適合作為理想的IL-4拮抗劑，應(yīng)用于哮喘等疾病的治療。
近年來各國研究人員對sIL-4R進(jìn)行了大量的研究。國外已經(jīng)應(yīng)用重組sIL-4R蛋白進(jìn)行治療哮喘的臨床研究，美國Immunex公司制備的sIL-4R重組蛋白(商品名為NuvaneeTM)已進(jìn)入到了臨床II期研究，結(jié)果顯示了良好的治療效果[14]，無副作用，sIL-4R抗體的出現(xiàn)率小于3％。sIL-4R在人體內(nèi)的半衰期較長，因此可減少服藥次數(shù)，大大方便了病人。最近有研究表明sIL-4R還具有預(yù)防晚期過敏炎癥所引起的咽鼓管機能障礙的作用[15]。
為滿足日益增長的臨床治療和藥物篩選需求，本發(fā)明人利用原核基因工程菌所特有的表達(dá)量高、生產(chǎn)成本低、易于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的特性，創(chuàng)造性地采用自行構(gòu)建的表達(dá)載體，分別制備兩株原核基因工程菌，成功實現(xiàn)了目標(biāo)蛋白sIL-4R的高效表達(dá)。
此外，本發(fā)明人還將通過基因工程方法獲得的重組sIL-4R蛋白作為靶位，建立新藥篩選模型，利用ELISA方法篩選IL-4R拮抗劑，用于從化合物庫和天然產(chǎn)物中篩選獲得治療哮喘等過敏性疾病的藥物。重組受體與傳統(tǒng)的受體技術(shù)相比，優(yōu)點很多(1)受體是人源的，所以利用重組受體所得到的試驗結(jié)果與在人體試驗得到的結(jié)果直接相關(guān)；(2)可大量制備受體，并能得到只在特定組織中存在、用傳統(tǒng)制備方法難以獲得的受體；(3)用克隆方法可得到純的受體，(4)重組受體可以定位在細(xì)胞膜上，更接近人體的自然狀態(tài)；(5)重組受體更經(jīng)濟(jì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個方面涉及重組表達(dá)可溶性IL-4受體的原核基因工程菌，其特征在于所述菌株中具有含有sIL-4R的基因片段的重組表達(dá)載體。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述原核基因工程菌為重組基因工程大腸桿菌pBV220/sIL-4R，含有包含編碼sIL-4R的基因片段的重組質(zhì)粒pBV220/sIL-4R，具有保藏號GCGCC 1134。
在本發(fā)明的又一具體實施方案中，所述原核基因工程菌為基因工程菌株淺青紫鏈霉菌TK24 pSGLgpp/sIL4R，含有包含編碼sIL-4R的基因片段的重組質(zhì)粒pSGLgpp/sIL-4R，具有保藏號GCGCC 1135。
本發(fā)明還涉及一種IL-4受體拮抗劑篩選模型，其特征在于利用本發(fā)明所述重組菌株表達(dá)的重組sIL-4R蛋白作為靶位，建立新藥篩選模型，通過例如ELISA方法篩選IL-4R拮抗劑，用于從化合物庫和天然產(chǎn)物中篩選獲得治療哮喘等過敏性疾病的藥物。
本發(fā)明又一方面涉及所述篩選模型篩選IL-4受體拮抗劑的用途。具體的，利用本發(fā)明所述基因工程重組菌株，獲得的重組sIL-4R蛋白，以所示蛋白為靶位，建立IL-4受體拮抗劑篩選模型，其中，利用例如ELISA方法篩選IL-4R拮抗劑，能夠從化合物庫和天然產(chǎn)物中獲得治療哮喘等過敏性疾病的藥物。


圖1RT-PCR產(chǎn)物分析結(jié)果。
圖2重組質(zhì)粒pBV220/sIL-4R的示意圖。
圖3重組質(zhì)粒pBV220/sIL-4R的限制性酶切分析。
圖4基因工程重組大腸桿菌pBV220/sIL-4RsIL-4R發(fā)酵上清液中基因表達(dá)的SDS-PAGE分析。
圖5基因工程重組大腸桿菌pBV220/sIL-4R表達(dá)產(chǎn)物的不同純化步驟中收集的級分之SDS-PAGE分析。
圖6由基因工程重組大腸桿菌pBV220/sIL-4R表達(dá)產(chǎn)物純化的重組sIL-4R的HPLC分析。
圖7由基因工程重組大腸桿菌pBV220/sIL-4R表達(dá)產(chǎn)物純化的重組sIL-4R蛋白質(zhì)的Western印跡分析。
圖8由基因工程重組大腸桿菌pBV220/sIL-4R表達(dá)產(chǎn)物純化的重組sIL-4R蛋白質(zhì)的配體結(jié)合印跡分析。
圖9重組質(zhì)粒pSGLgpp/sIL-4R酶切分析。
圖10基因工程重組淺青紫鏈霉菌TK24 pSGLgpp/sIL-4R發(fā)酵上清液SDS-PAGE分析。
圖11基因工程重組淺青紫鏈霉菌TK24 pSGLgpp/sIL-4R發(fā)酵上清液的Western印跡分析。
圖12由基因工程重組淺青紫鏈霉菌TK24 pSGLgpp/sIL-4R]產(chǎn)生的重組sIL-4R蛋白質(zhì)的配體結(jié)合印跡分析。
實施例1基因工程重組大腸桿菌pBV220/sIL-4R的構(gòu)建
1.材料和方法1.1 菌種、質(zhì)粒和培養(yǎng)基大腸桿菌DH5α用于目的基因的克隆和外源蛋白表達(dá)。溫度調(diào)控型高效表達(dá)質(zhì)粒pBV220用于在大腸桿菌DH5α中表達(dá)外源蛋白。pGEM-T(Promega)用于目的基因克隆。LB-Amp培養(yǎng)基(1％胰化蛋白胨，0.5％ 酵母提取物，1％NaCl，pH7.0，50μg/ml氨芐青霉素)用于E.coli的培養(yǎng)和外源蛋白的表達(dá)。
1.2 寡核苷酸引物根據(jù)已知的IL-4R cDNA序列(GenBank Accession No.NM 000418)設(shè)計編碼IL-4R基因胞外區(qū)片段的5’和3’端寡核苷酸引物，并在各自5’末端分別引入EcoRI和Bam HI限制性酶切位點同時在3’引物末端加入終止密碼子 5’和3’端引物序列如下5’端引物5’-GCGAATTCCATGAAGGTCTTGCAGGAGC-3’3’端引物5’-TAGGATCC GTGCTGCTCGAAGGGCTC-3’1.3 RT-PCR擴(kuò)增和序列測定使用Promega的SV總RNA提取試劑盒從人的單核細(xì)胞(約1×106個細(xì)胞)中提取總RNA。提取方法按試劑盒推薦步驟進(jìn)行。將RNA溶于100μl不含核酸酶的水中，取5μl作為模板，使用AdvantageOne-step RT-PCR試劑盒(CLONTECH)以美國MJ Research公司的MiniCycleTM PTC-150型PCR儀進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。RT-PCR條件如下50℃，1h；94℃，5min；94℃，30s，52℃，1min；3個循環(huán)后，94℃，30s，63℃，30s，65℃，1min；30個循環(huán)后，72℃延伸10min。
RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。電泳結(jié)果顯示有與預(yù)期大小一致的DNA條帶(約620bp)測序結(jié)果與文獻(xiàn)報道基本一致，但第148位堿基發(fā)生A→G的突變，造成第50位氨基酸Ile突變成為Val，根據(jù)文獻(xiàn)報道，IL-4R基因序列具有多種單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中在α鏈的胞外區(qū)表現(xiàn)為IIe50Val，本實驗測序結(jié)果同文獻(xiàn)報道的sIL-4R基因序列中的單核苷酸多態(tài)性一致[12]。
獲得的RT-PCR產(chǎn)物純化后采用Promega的TA克隆試劑盒將其克隆至pGEM-T載體，構(gòu)建克隆質(zhì)粒pGEM-T/sIL-4R，用ABIPRISM377 DNA測序儀測序。
1.4 pBV220/sIL-4R重組質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化以限制性內(nèi)切酶EcoRI和Bam HI將sIL-4R基因從pGEM-T/sIL-4R質(zhì)粒切出，與同以EcoRI和Bam HI酶切的質(zhì)粒pBV220連接，獲得重組質(zhì)粒pBV220/sIL-4R，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽性克隆。
將sIL-4R基因插入載體pBV220，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pBV220/sIL-4R(圖2)。質(zhì)粒pBV220/sIL-4R以EcoR I和Bam HI酶切產(chǎn)生與sIL-4R基因大小一致的片段，見圖3，表明sIL-4R基因已插入到載體pBV220。
將重組質(zhì)粒pBV220/sIL-4R和質(zhì)粒pBV220分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(DH5α)。以含Amp 50μg/ml的LB瓊脂平板挑選轉(zhuǎn)化子，命名為大腸桿菌pBV220/sIL-4R和DH5α/pBV220。
依照布達(dá)佩斯條約，本發(fā)明人將如上述構(gòu)建的重組菌株大腸桿菌pBV220/sIL-4R于2004年4月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，北京海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，100080)，保藏號為CGMCC 1134。
實施例2 重組sIL-4R在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)選取如上述制備的大腸桿菌pBV220/sIL-4R接種于LB液體培養(yǎng)基中(含50μg/ml氨芐青霉素)，30℃振蕩過夜。次日以140接種至LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)在30℃條件下振蕩培養(yǎng)，至OD600值0.4～0.5，迅速提高溫度至42℃，繼續(xù)培養(yǎng)4～5hr。4℃3000g離心10分鐘，用預(yù)冷的PBS洗菌體一次，離心收集菌體，準(zhǔn)備超聲破碎。
SDS-PAGE收集經(jīng)過42℃溫度誘導(dǎo)的重組菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示重組菌株樣品出現(xiàn)一分子量約為24kD的蛋白條帶(圖4)，與sIL-4R分子量計算值23.7kD基本相符。凝膠掃描分析顯示重組蛋白約占總蛋白量15％左右。
實驗過程中，采用高濃度肉湯培養(yǎng)基替換常規(guī)使用的LB培養(yǎng)基，誘導(dǎo)條件沒有發(fā)生變化，SDS-PAGE結(jié)果(如圖11)顯示，在高濃度肉湯培養(yǎng)基中，目標(biāo)蛋白含量明顯提高，經(jīng)過凝膠掃描分析顯示重組蛋白約占總蛋白量35％左右。
實施例3重組sIL-4R的純化將離心收集的沉淀菌體用緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，pH8.5，5mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，1％Triton X-100)懸浮，置于冰浴進(jìn)行超聲波破碎菌體，每次150W超聲波處理30s，間歇1min，共循環(huán)10次。破碎后的菌體懸液以10，000g離心10min棄上清，沉淀用緩沖液懸浮，重復(fù)上述步驟3～4次，直至離心后包涵體上清液清亮為止。以50mmol/L Tris-HCl，pH8.5，5mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，1％Triton X-100，5mol/L尿素的緩沖液懸浮包涵體，置于室溫30min，離心收集包涵體，重復(fù)兩次。洗滌后的包涵體按照濕重1g/50ml比例加至變性液中(50mmol/L Tris-HCl，pH8.5，5mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，3mol/L鹽酸胍，200mmol/L β-巰基乙醇)。室溫放置過夜，變性后包涵體應(yīng)澄清透明。
以12,000g離心15min，棄沉淀。上清液上樣至2倍柱體積緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，pH8.5，5mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，2mol/L鹽酸胍 200mmol/L β-巰基乙醇)平衡的FPLC SuperdexTMHR 75 10/30(Amersham Pharmacia Biotech)凝膠過濾柱。280nm檢測收集目的蛋白峰。
將含目的蛋白的洗脫液合并后4℃攪拌條件下緩慢加入復(fù)性緩沖液(20mmol/L Tris-HCl，pH8.5，1mol/L鹽酸胍，0.5mmol/L GSH，0.5mmol/L GSSG，0.5mol/L精氨酸，2mmol/L EDTA，80mmol/LNaCl)。緩沖液中蛋白濃度控制在0.01～0.015mg/ml。4℃復(fù)性48hr后，用20mmol/L Tris-HCl pH8.5緩沖液充分透析，樣品經(jīng)過截留分子量為3000Da的OMEGA超濾系統(tǒng)(Filtron Technology)進(jìn)行濃縮，再以DEAE SepharoseTMFast Flow(Amersham Pharmacia Biotech)柱進(jìn)行分離純化。先以5倍柱體積A液(20mM Tris-HCl，3mM DTT，PH 8.5)平衡層析柱，上樣后以2倍柱體積A液洗滌。再采用連續(xù)梯度洗脫分離純化蛋白。0→100％B液(20mM Tris-HCl，1M NaCl，3mMDTT，pH 8.5)共洗脫10倍柱體積，流速為0.5ml/min，檢測波長為280nm。收集目的蛋白峰，以PBS緩沖液進(jìn)行透析。凍干后-20℃保存。以上分離純化操作均使用的是KTA purifier system(AmershamPharmacia Biotech)。
高壓液相方法測定純化重組蛋白的含量。儀器為島津(SHIMADZU)-10A，采用C8反相柱SUPELCSIL LC-308(Waters)，流動相A20％乙腈，流動相B0.05％三氟乙酸(TFA)，連續(xù)梯度洗脫在0→15分鐘內(nèi)乙腈濃度由20％→80％，流速為0.5ml/min。
如上述方法，將重組sIL-4R蛋白在42℃誘導(dǎo)條件下形成了包涵體，先破碎細(xì)胞并充分洗滌包涵體以除去可溶性蛋白以及膜蛋白。將包涵體溶于裂解液中進(jìn)行分子篩柱層析分離純化，進(jìn)一步除去雜蛋白。4℃和緩慢攪拌條件下對純化的樣品進(jìn)行復(fù)性，復(fù)性的蛋白進(jìn)行離子交換層析。純化各步驟的SDS-PAGE分析見圖5。
實施例4表達(dá)產(chǎn)物的N端氨基酸序列測定如上述所制備的重組表達(dá)產(chǎn)物sIL-4R N端氨基酸序列采用Applied Biosystems Procise 491(Applied Biosystems)進(jìn)行測定。對N端15個氨基酸的序列測定結(jié)果如下Met-Lys-Val-Leu-Gln-Glu-Pro-Thr-Cys-Val-Ser-Asp-Tyr-Met-Ser。與天然sIL-4R的N端氨基酸序列完全相同。
實施例5表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western印跡分析以1×蛋白質(zhì)上樣緩沖液溶解蛋白樣品，用12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分析，電泳儀為BIO-RAD Mini-PROTEANII Cell。Western印跡分析使用BIO-RAD TRANS-BLOTSD SEMI-DRY TRANSFERCELL，按照公司提供的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行實驗。以小鼠抗人IL-4R的單克隆抗體(R&D公司)作為第一抗體，堿性磷酸酶標(biāo)記的馬抗小鼠IgG(H+L)(中山公司)作為第二抗體，以NBT/BCIP(AMRESCO)作為底物進(jìn)行顯色。
Western印跡分析在24kD處有一雜交帶出現(xiàn)(圖7)與SDS-PAGE結(jié)果相一致，表明該特異條帶為重組sIL-4R蛋白，具有特異免疫活性。
實施例6 配基結(jié)合印跡分析蛋白樣品加入1×非還原蛋白上樣緩沖液，按文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行非還原的12％SDS-PAGE。電泳后經(jīng)電轉(zhuǎn)移將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)移緩沖液為不含甲醇的Towbin緩沖液(25mmol/L Tris-HCL，192mmol/L glycine，pH8.3)，方法參照Western印跡分析。然后加入100μg/ml配基IL-4，以小鼠抗人IL-4單克隆抗體(R&D)作為第一抗體，堿性磷酸酶標(biāo)記的馬抗小鼠IgG(H+L)(中山公司)作為第二抗體，用NBT/BCIP(AMRESCO)作為底物進(jìn)行顯色。
配體-受體結(jié)合試驗為了確定表達(dá)的sIL-4R是否具有與配基IL-4結(jié)合的活性，進(jìn)行了受體—配基結(jié)合印跡分析(圖8)。樣品在相應(yīng)分子量24kD處有一明顯雜交帶。說明表達(dá)產(chǎn)物sIL-4R具有結(jié)合IL-4的活性。
實施例7重組sIL-4R的HPLC分析對經(jīng)過離子交換后透析凍干得到的蛋白樣品進(jìn)行高壓液相檢測(圖6)，從得到的數(shù)據(jù)分析，純化后的蛋白樣品中重組sIL-4R的含量約占90％。
實施例8重組sIL-4R的純化收率采用500ml三角搖瓶進(jìn)行發(fā)酵研究，每升菌液收獲表達(dá)菌體平均1.5g，重組sIL-4R占菌體蛋白總量的15％，經(jīng)Superdex HR 75 10/30分子篩層析后，蛋白總量為258mg，重組sIL-4R占總量70％，復(fù)性后進(jìn)行Sepharose FF層析，最終獲得蛋白產(chǎn)物為13mg，重組sIL-4R占總量90％。按此計算，每升發(fā)酵產(chǎn)物可獲得11mg具有生物活性的sIL-4R(表1)。
表1 純化步驟從1升發(fā)酵液中對蛋白質(zhì)的回收

本發(fā)明以大腸桿菌作為宿主，采用溫敏型高效表達(dá)載體pBV220成功表達(dá)了重組人sIL-4R蛋白，經(jīng)N端氨基酸測序與天然蛋白完全一致，Western印跡和配體結(jié)合實驗表明，經(jīng)本發(fā)明所述重組菌株表達(dá)的重組人sIL-4R蛋白具有生物學(xué)活性。國外對重組sL-4R的研究一般都以真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞，Sf9，Hela等作為宿主進(jìn)行表達(dá)。相對于真核細(xì)胞而言，利用原核生物作為外源蛋白表達(dá)載體具有生長迅速，可進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，成本低廉，外源基因表達(dá)量高等特點。
實施例9 基因工程重組淺青紫鏈霉菌pSGLgpp/sIL-4R的構(gòu)建實驗材料菌株，質(zhì)粒與酶淺青紫鏈霉菌(S.lividans)TK24 str-6為本實驗室保存，用于外源蛋白表達(dá)。大腸桿菌DH5α[supE44，ΔlacU169，(φ80lacZΔM15)，hsdR17，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，relA1]，本實驗室保存。pSGLgpp，鏈霉菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒，含pUC18及S.globisporus分泌信號肽gpp的最小復(fù)制區(qū)，為本室自行構(gòu)建，用于外源蛋白表達(dá)。pUC18，ApR，lacZα，MCS，本室保存，用于克隆測序。限制性內(nèi)切酶，T4連接酶，Taq酶，購于Promega或TaKaRa公司。
實驗方法1.引物設(shè)計根據(jù)已知的IL-4R cDNA序列(GenBank Accession No.NM_000418)設(shè)計編碼IL-4R基因胞外區(qū)片段的5’和3’端寡核苷酸引物，5’上游引物P1引入EcoRI限制酶切位點(黑體)和三個保護(hù)堿基，為保證正確的閱讀框架，在酶切位點和基因序列之間加入一個堿基T(方框表示)；3′下游引物中引入終止密碼子TCA(斜體)及HindIII限制酶切位點(下劃線)和兩個保護(hù)堿基。
P15’-CCCGAATTC ATGAAGGTCTTGCAGGAGC；P25’-ATAAGCTTTCAGTGCTGCTCGAAGGGCTCRT-PCR擴(kuò)增和序列測定使用Promega的SV總RNA提取試劑盒從人的單核細(xì)胞(約1×106個細(xì)胞)中提取總RNA。提取方法按試劑盒推薦步驟進(jìn)行。將RNA溶于100μl不含核酸酶的水中，取5μl作為模板，使用AdvantageOne-step RT-PCR試劑盒(CLONTECH)以美國MJ Research公司的MiniCycleTM PTC-150型PCR儀進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。RT-PCR條件如下50℃，1h；94℃，5min；94℃，30s，52℃，1min；3個循環(huán)后，94℃，30s，63℃，30s，65℃，1min；30個循環(huán)后，72℃延伸10min。
獲得的RT-PCR產(chǎn)物純化后采用Promega的TA克隆試劑盒將其克隆至pGEM-T載體，構(gòu)建克隆質(zhì)粒pGEM-T/sIL-4R，用ABIPRISM377 DNA測序儀測序。
重組質(zhì)粒pSGLgpp-F的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
pSGLgpp質(zhì)粒為本室張華博士構(gòu)建，從新型抗腫瘤抗生素C1027產(chǎn)生菌S.globisporous擴(kuò)增得到C1027輔基蛋白的分泌信號肽gpp的編碼基因及其調(diào)控序列289bp，將其插入洪斌博士構(gòu)建的以硫鏈絲菌素抗性基因(tsr)和新霉素抗性基因(aph)為篩選標(biāo)記的質(zhì)粒pSGLN，獲得E.coli-S.lividans穿梭質(zhì)粒pSGLgpp，在該質(zhì)粒有可用于插入外源片段的EcoRI、Hind III位點。同時預(yù)留了分離外源片段的MCS2區(qū)的KpnI、SacI、EcoRI和MCS3區(qū)的HindIII、SpnI等位點。
將sIL-4R cDNA片段從質(zhì)粒pGEM-T/sIL-4R中經(jīng)EcoRI、HindIII雙酶切后回收；pSGLgpp經(jīng)EcoRI、HindIII同樣雙酶切后，回收5.6Kb的大片段，兩片段以3∶1(摩爾比)進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化S.lividans TK24原生質(zhì)體。利用含有新霉素的R2平板(Bacto-酵母提取物0.4％，蛋白胨0.4％，蔗糖10.3％，Casamino acids 0.01％，葡萄糖1.0％，TES 0.3％，K2SO4 0.0025％，CaCl2·2H2O 0.735％，MgCl2·6H2O 1.012％，KH2PO4 0.0025％，微量元素溶液0.2％(v/v)，瓊脂1.5％，pH7.5)篩選得到陽性重組菌株提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定(圖9)。如圖9所示，重組質(zhì)粒pSGLgpp/sIL-4R經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切后，得到640bp的片段，與sIL-4R基因片段大小一致，表明sIL-4R基因插入了pSGLgpp質(zhì)粒，以P1、P2為引物，重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，得到sIL-4R的片段，也進(jìn)一步證明sIL-4R基因插入了pSGLgpp質(zhì)粒。將獲得的重組質(zhì)粒命名為pSGLgpp/sIL-4R，獲得的重組菌株命名淺青紫鏈霉菌TK24 pSGLgpp/sIL-4R]。
依照布達(dá)佩斯條約，本發(fā)明人將如上述構(gòu)建的重組菌株淺青紫鏈霉菌TK24 pSGLgpp/sIL-4R于2004年4月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，北京海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，100080)，保藏號為CGMCC 1135。
實施例10 基因工程菌株淺青紫鏈霉菌TK24 pSGLgpp/sIL-4R]的培養(yǎng)從新鮮種子斜面取如實施例9中制備的基因工程菌株，接種于50ml CM培養(yǎng)基(葡萄糖1％，酪蛋白水解物2％，Bacto-酵母提取物1％，微量元素溶液1％，pH7.2)中，28℃，300rpm，搖瓶培養(yǎng)48小時，然后按照10％的比例轉(zhuǎn)種于50ml新鮮CM培養(yǎng)基中，28℃，搖瓶培養(yǎng)72小時，合并發(fā)酵液，10，000rpm離心30min，收集上清，4℃70％(NH4)2SO4沉淀，沉淀加水溶解后，4℃對水透析除鹽。真空冷凍干燥備用。以相同的條件培養(yǎng)含有空載體pSGLgPP S.Lividans，得到的樣品作為對照。
實施例11重組菌株淺青紫鏈霉菌TK24 pSGLgpp/sIL-4R中sIL-4R的表達(dá)SDS-PAGE和Western印跡分析以1×蛋白質(zhì)上樣緩沖液溶解蛋白樣品，用12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分析，電泳儀為BIO-RAD Mini-PROTEANII Cell。結(jié)果顯示，與對照菌株比較，重組菌株淺青紫鏈霉菌TK24 pSGLgpp/sIL-4R]的發(fā)酵上清液在24kDa處有明顯加粗條帶，與根據(jù)sIL-4R cDNA預(yù)測分子量相符(圖10)。
Western印跡分析使用BIO-RAD TRANS-BLOTSD SEMI-DRYTRANSFER CELL，按照公司提供的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行實驗。以小鼠抗人IL-4R的單克隆抗體(R&D公司)作為第一抗體，堿性磷酸酶標(biāo)記的馬抗小鼠IgG(H+L)(中山公司)作為第二抗體，以NBT/BCIP(AMRESCO)作為底物進(jìn)行顯色。western印跡分析在24kD處有一雜交帶出現(xiàn)(圖11)與SDS-PAGE結(jié)果相一致，表明該特異條帶為重組sIL-4R蛋白，具有特異免疫活性。
配基結(jié)合印跡分析蛋白樣品加入1×非還原蛋白上樣緩沖液，按文獻(xiàn)方法進(jìn)行非還原的12％SDS-PAGE。電泳后經(jīng)電轉(zhuǎn)移將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)移緩沖液為不含甲醇的Towbin緩沖液(25mmol/L Tris-HCL，192mmol/L glycine，pH8.3)，方法參照Western印跡分析。然后加入100μg/ml配基IL-4，以小鼠抗人IL-4單克隆抗體(R&D)作為第一抗體，堿性磷酸酶標(biāo)記的馬抗小鼠IgG(H+L)(中山公司)作為第二抗體，用NBT/BCIP(AMRESCO)作為底物進(jìn)行顯色。樣品在相應(yīng)分子量24kD處有一明顯雜交帶。說明表達(dá)產(chǎn)物sIL-4R具有結(jié)合IL-4的活性(圖12)。
實施例12白介素4受體(IL-4R)拮抗劑高通量篩選模型的建立IL-4R拮抗劑篩選模型的建立是基于受體—配體競爭結(jié)合的原理。若待測樣品中含有IL-4R拮抗劑，該拮抗劑可以抑制IL-4與IL-4R的結(jié)合，使包被于酶標(biāo)板的IL-4與sIL-4R結(jié)合減少，通過酶聯(lián)免疫反應(yīng)，樣品在450nm光吸收值與對照相比下降，根據(jù)光吸收值的變化，可以初步確定待篩樣品中是否含有IL-4R的拮抗劑。
具體的，以重組白介素4(IL-4)固定酶標(biāo)板，加入如前述實施例所制備并純化的可溶性白介素4受體(sIL-4R)和待測樣品，再加入受體的抗體，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體，顯色。采用酶聯(lián)免疫測定儀測定450nm的吸光值。
當(dāng)加入的待篩選樣品中含有IL-4R拮抗劑時，該拮抗劑可以和固定在酶標(biāo)板上的IL-4競爭結(jié)合sIL-4R，這樣與酶標(biāo)板上的IL-4結(jié)合的受體減少，最終導(dǎo)致結(jié)合在酶標(biāo)板上的辣根過氧化物酶減少，因此底物顯色變淺，吸光值下降。根據(jù)吸光值的變化可以確定待篩選樣品中是否含有IL-4R的拮抗劑。
待測樣品對吸光值改變率的計算用如下方程計算待測樣品對吸光值的改變率改變率(％)＝(B-A)/B×100其中，A為加入待測樣品后測定的吸光值，B為加入陰性對照樣品(空白)后測定的吸光值。
對于改變率在+20％以上的待測樣品可初步認(rèn)定為具有IL-4R拮抗活性。
具體步驟1.包被酶標(biāo)板(NUNC公司)每孔加入100μl重組人IL-4溶液(1μg/ml)(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，4℃孵育8～12小時。
2.封閉棄包被液，每孔加入200μl含3％牛血清白蛋白(BSA)(ROCHE公司)的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)進(jìn)行封閉，4℃孵育8～12小時。
3.去封閉液用PBS洗板3次。
4.受體-配給結(jié)合每孔加入100μl含重組sIL-4R的基因工程菌發(fā)酵液硫酸銨沉淀凍干品(5mg/ml)，4℃孵育8～12小時。
5.洗板用含有0.1％Tween20(AMRESCO)的PBS洗5次，再以PBS洗5次。
6.每孔加入100μl 1∶1000稀釋的小鼠抗人IL-4R單克隆抗體(1μg/ml)(R&D公司)，4℃放置1小時。
7.洗板用含有0.1％Tween20的PBS洗5次，再以PBS洗5次。
8.每孔加入100μl 1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(0.01μg/ml)(中山公司)，4℃放置1小時。
9.洗板用含有0.1％Tween20的PBS洗5次，再以PBS洗5次。
10.顯色每孔加入3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺二鹽酸(3，3’，5，5’-Tetramethyl Benzidine Dihydrochloride)和雙氧水各50μl(友誼公司)，室溫放置1小時顯色，每孔加入100μl 1M硫酸終止反應(yīng)，采用酶標(biāo)比色計(Bio-Rad公司)，在450nm檢測樣品光密度值(OD)。
11.以只加TMB，雙氧水和硫酸的空白孔調(diào)零，同時設(shè)立對照1只加100μl含有重組sIL-4R的基因工程菌發(fā)酵液硫酸銨沉淀凍干品(5mg/ml)(未加入檢測樣品)。對照2只加入100μl含空載體對照菌株發(fā)酵液硫酸銨沉淀凍干品(5mg/ml)。
應(yīng)用上述篩選模型，我們初篩了269個化合物和453株微生物的發(fā)酵產(chǎn)物，部分陽性結(jié)果結(jié)果見表2和表3。
表2 本發(fā)明篩選模型對不同微生物發(fā)酵產(chǎn)物的初篩結(jié)果

表3 本發(fā)明篩選模型對不同化合物的初篩結(jié)果

本發(fā)明所述篩選模型以鏈霉菌表達(dá)的重組sIL-4R為靶位，基于拮抗劑和配體競爭性結(jié)合受體為基礎(chǔ)的ELISA方法，能夠用于樣品的高通量篩選。利用受體進(jìn)行藥物篩選，可使篩選到的藥物更加接近生理物質(zhì)的作用途徑，有效克服現(xiàn)有方法中利用動物組織提取受體篩選藥物中存在的諸多問題，如IL-4R在組織細(xì)胞上含量較少；直接利用動物組織或勻漿進(jìn)行IL-4R拮抗劑的篩選會有專一性不好的問題。
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權(quán)利要求
1.一種重組表達(dá)可溶性IL-4受體的原核基因工程菌，其特征在于所述菌株中具有含有sIL-4R的基因片段的重組表達(dá)載體。
2.權(quán)利要求1所述的原核基因工程菌，其為基因工程重組大腸桿菌pBV220/sIL-4R，含有包含編碼sIL-4R的基因片段的重組質(zhì)粒pBV220/sIL-4R，具有保藏號GCGCC 1134。
3.權(quán)利要求1所述的原核基因工程菌，其為基因工程重組淺青紫鏈霉菌TK24 pSGLgpp/sIL4R，含有包含編碼sIL-4R的基因片段的重組質(zhì)粒pSGLgpp/sIL-4R，具有保藏號GCGCC 1135。
4.一種IL-4受體拮抗劑篩選模型，其特征在于采用權(quán)利要求1所述原核基因工程菌表達(dá)的重組sIL-4R蛋白作為靶位，利用ELISA方法從化合物庫和天然產(chǎn)物中篩選IL-4R拮抗劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述IL-4受體拮抗劑篩選模型篩選得到的IL-4受體拮抗劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組表達(dá)可溶性IL－4受體的原核基因工程菌，其特征在于所述菌株中具有含有sIL－4R的基因片段的重組表達(dá)載體。本發(fā)明還涉及一種IL－4受體拮抗劑篩選模型，其特征在于利用本發(fā)明重組菌株表達(dá)的重組sIL－4R蛋白作為靶位，采用ELISA方法從化合物庫和天然產(chǎn)物中篩選IL－4R拮抗劑。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述篩選模型篩選IL－4受體拮抗劑的用途。
文檔編號C12N1/21GK1690192SQ20041003663
公開日2005年11月2日 申請日期2004年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月29日
發(fā)明者李元, 張勇, 張洋, 郭連宏, 石蓮英 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所