專利名稱:重組改良安卡拉痘苗病毒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及從改良安卡拉痘苗病毒(MVA)衍生的重組痘苗病毒及其包含且能夠表達(dá)插入到MVA染色體上天然缺失位點上的外源基因;涉及使用這類重組MVA病毒產(chǎn)生多肽,例如抗原或治療劑,或產(chǎn)生用于基因治療的病毒載體,以及使用這類編碼抗原的重組MVA病毒作為疫苗。
本發(fā)明的目的之一是提供一種重組MVA病毒,它可作為有效且特別安全的表達(dá)載體。
本發(fā)明的另一種目的是提供一種簡單、有效、安全的方法產(chǎn)生多肽,例如抗原或治療劑,產(chǎn)生重組病毒用作疫苗以及產(chǎn)生病毒載體用于基因治療。
本發(fā)明的再一種目的是提供一種基于表達(dá)T7RNA聚合酶的重組MVA病毒的表達(dá)系統(tǒng),以及基于此表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生多肽,例如抗原或治療藥劑,或產(chǎn)生病毒載體用于基因治療或用作疫苗。
背景技術(shù):
痘苗病毒是痘病毒科正痘病毒屬的一員,曾用作活疫苗免疫人天花病。世界范圍用痘苗病毒成功的接種最終導(dǎo)致天花病因-天花病毒的絕跡[天花的全球絕跡。全球天花絕跡鑒定委員會的最后報告。公共衛(wèi)生歷史,第4號(History of Public Health,No.4),日內(nèi)瓦世界衛(wèi)生組織,1980]。因而世界衛(wèi)生組織(WHO)宣告,除了有高度危險痘病毒感染的人群(例如實驗室人員)外,已全世界性地停止接種。
最近,痘苗病毒也已用于設(shè)計病毒載體,以進(jìn)行重組基因表達(dá)和可能用作重組活疫苗[Mackett,M.,Smith,G.L.和Moss,B.[1982美國國家科學(xué)院院報(P.N.A.S.USA)79,7415-7419;Smith,G.L.,Mackett,M.和Moss,B. 生物技術(shù)和遺傳工程評論2(Biotechnology and Genetic Engineering Reviews2),383-407]。這必然伴有在DNA重組技術(shù)幫助下把編碼外源抗原的DNA序列(基因)引入痘苗病毒基因組。如果基因整合到病毒DNA中對病毒生活周期非必需的位點,可能新產(chǎn)生的重組痘苗病毒是感染性的,即能夠感染外源細(xì)胞并從而表達(dá)整合的DNA序列[歐洲專利申請83,286號和110,385號(EP Patent Applications No.83,286 and No.110,385)]。用這種方法制備的重組痘苗病毒一方面可用作活疫苗預(yù)防傳染性疾病,另一方面可用于在真核細(xì)胞中制備異源蛋白質(zhì)。
表達(dá)噬菌體T7 RNA聚合酶基因的重組痘苗病毒可以建立廣泛應(yīng)用的表達(dá)系統(tǒng)以用于在哺乳動物細(xì)胞中合成重組蛋白(Moss,B.,Elroy-Stein,O.,Mizukami,T.,Alexander,W.A.,和Fuerst T.R. 自然(Nature)348,91-92.)。在所有方案中,重組基因表達(dá)依賴于真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中T7 RNA聚合酶的合成。最普遍的一種方案是用于瞬時表達(dá)(Fuerst,T.R.,Niles,E.G.,Studier,F(xiàn).W.和Moss,B. 美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.)Sci.USA 83,8122-8126和美國專利申請(US patent application)7.648.971)。首先,一種感興趣的外源基因插入質(zhì)粒并在T7 RNA聚合聚啟動子控制之下。隨后,質(zhì)粒引入到細(xì)胞的原生質(zhì)體中,該細(xì)胞通過標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染方法由產(chǎn)生T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒預(yù)先感染。
此轉(zhuǎn)染方案非常簡單因為不需構(gòu)建新的重組病毒并且特別有效,有超過80%的細(xì)胞表達(dá)感興趣的基因[Elroy-Stein,O.和Moss,B. 美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87,6743-6747]。痘苗病毒/T7RNA聚合酶雜合系統(tǒng)比其它瞬時表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢很可能在于它不依賴于質(zhì)粒到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運。在過去,該系統(tǒng)在病毒學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)中對檢測目的是極其有用的(Bunocore,L.和Rose,J.K. 自然(Nature)345,625-628,Pattnaik,A.K.和Wertz,GW. 美國國家科學(xué)院院報(Proc Natl.Acad.Sci.USA)88,1379-1383,Karschin,A.,Aiyar,J.,Gouin,A.,Davidson,N.和Lester,H.A. 歐洲生化學(xué)會聯(lián)合會快報(FEBS Lett.)278,229-233,Ho,B.Y.,Karschin,A.,Raymond,J.,Branchek,T.,Lester,H.A.和Davidson,N. 歐洲生化學(xué)會聯(lián)合會快報(FEBS Lett.)301,303-306,Buchholz,C.J.,Retzler C.,Homann,H.E.,和Neubert,W.J. 病毒學(xué)(Virology)204,770-776)。然而,痘苗病毒/T7 RNA聚合聚雜合系統(tǒng)的重要前景應(yīng)用,例如產(chǎn)生重組蛋白或重組病毒顆粒用于人體的新的治療或預(yù)防方法,可能由于重組痘苗載體的大量復(fù)制而受到阻礙。
痘苗病毒對人是感染性的并且在根除天花運動中的接種時偶而會觀察到嚴(yán)重的并發(fā)癥。關(guān)于并發(fā)癥發(fā)病率的最好綜述由一項美國國家調(diào)查提供,該調(diào)查檢測了大約一千二百萬接種疫苗的人,接種疫苗基于紐約城市衛(wèi)生委員會痘苗病毒菌株(Lane,J.,Ruben,F(xiàn).,Neff,J.和Millar,J. 新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(New Engl.J.Med.)281,1201-1208)。因而安全性考慮和規(guī)范影響了使用痘苗病毒作為載體發(fā)展重組活疫苗的最令人鼓舞的可能性。此外,文獻(xiàn)中描述的大多數(shù)重組痘苗病毒基于西方保藏的痘苗病毒菌株(WesternReserve strain of vaccinia virus)。另一方面,眾所周知此菌株有較高的神經(jīng)毒性因而不適用于人類和動物(Morita等,疫苗(Vaccine)5,65-70 )。對于載體應(yīng)用,通過使用高度減毒的痘苗病毒菌株可以減小健康危險。特別發(fā)展了許多這類痘苗病毒以避免天花接種中的不希望的副作用。因而,通過痘苗病毒安卡拉菌株(CVA)在雞胚成纖維細(xì)胞中長期的連續(xù)傳代產(chǎn)生了改良安卡拉痘苗病毒(MVA)(綜述參看Mayr,A.,Hochstein-Mintzel,V和Stickl,H. 感染(Infection)3,6-14;瑞士專利號(Swiss Patent No.)568,392)。MVA病毒按照布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)于1987年11月15日保藏于CNCM(巴斯德研究所,微生物菌種國家收藏館(Institut Pasteur,CollectionNationale de Cultures de Microorganisms,)25,rue du Docteur Roux,75724 ParisCedex 15),保藏號1-721。MVA的特點是強(qiáng)減毒性,也就是說通過減少的毒性或感染性同時保持良好的免疫原性。檢測了MVA病毒以確定它相對于野生型CVA菌株基因組的變化。檢測到六個主要的共31,000堿基對的基因組DNA缺失(缺失I,II,III,IV,V和VI)(Meyer,H.,Sutter,G.和Mayr A. 普通病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol.)72,1031-1038)。產(chǎn)生的MVA病毒其宿主細(xì)胞嚴(yán)格限于禽源細(xì)胞。另外,MVA具有高度減毒的特征。在多種動物模型中的檢驗證明MVA甚至在免疫抑制的動物中都是無毒性的。更重要的是,MVA菌株的優(yōu)秀特性已在廣泛的臨床試驗中得到證實(Mayr等,Zbl.Bakt.Hyg.l,Abt.Org.B 167,375-390 ,Stickl等,Dtsch.med.Wschr.99,2386-2392 )。在這些超過120,000人的研究中,包括高危病人,沒發(fā)現(xiàn)有與MVA疫苗相關(guān)的副作用。
已發(fā)現(xiàn)MVA在人細(xì)胞中的復(fù)制在感染后期受到阻礙,防止了成熟感染性病毒粒子的組裝。盡管如此,MVA甚至在非允許細(xì)胞中也能高水平表達(dá)病毒的和重組的基因,并建議作為有效的和特別安全的基因表達(dá)載體(Sutter,G.和Moss,B. 美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89,10847-10851)。最近,在MVA基礎(chǔ)上構(gòu)建了新的痘病毒載體系統(tǒng),外源DNA序列插入MVA基因組的缺失III或TK基因(Sutter,G.和Moss,B. 發(fā)育生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)(Dev.Biol.Stand.)Basel,Karger 84,195-200和美國專利(USpatent)5,185,146)。
為了進(jìn)一步開發(fā)MVA的應(yīng)用,發(fā)現(xiàn)了一種通過DNA重組把外源基因引入痘苗病毒MVA菌株的新的可能方法。由于發(fā)明不是要改變MVA病毒的基因組,因此必需使用符合此需要的方法。依據(jù)本發(fā)明,一種外源DNA序列準(zhǔn)確地在MVA基因組自然發(fā)生發(fā)生缺失位點重組到病毒DNA。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從而特別地包括單獨的下述內(nèi)容或它們的組合一種重組MVA病毒,包含并能夠表達(dá)至少一種插入MVA基因組天然缺失位點的外源基因;上述重組MVA病毒,包含并能夠表達(dá)至少一種插入MVA基因組缺失II位點的外源基因;上述重組MVA病毒,其中的外源基因編碼一種標(biāo)記,一種治療基因或一種抗原決定簇;上述重組MVA病毒,其中的外源基因編碼一種來自于病原性病毒、細(xì)菌、或其它微生物,或來自于寄生蟲,或腫瘤細(xì)胞的抗原決定簇;上述重組MVA病毒,其中的外源基因編碼一種來自于惡性瘧蟲(Plasmodium Falciparum),分枝桿菌(Mycobacteria),皰疹病毒,流感病毒(influenza virus),肝炎或人免疫缺陷病毒的抗原決定簇;上述重組MVA病毒,其中的抗原決定簇是人免疫缺陷病毒(HIV)的nef或人酪氨酸酶;上述重組MVA病毒,其為MVA-LAI nef或MVA-hTYR;上述重組MVA病毒,其中的外源基因編碼T7 RNA聚合酶;上述重組MVA病毒,其為MVA-T7 pol;上述重組MVA病毒,其中的外源基因處于痘苗病毒早期/晚期啟動子P7.5的轉(zhuǎn)錄控制之下;上述重組MVA病毒,基本上不含能夠在人細(xì)胞中復(fù)制的病毒;上述重組MVA病毒的應(yīng)用,用于在T7 RNA聚合酶啟動子轉(zhuǎn)錄控制之下轉(zhuǎn)錄DNA序列;由上述任一重組MVA病毒感染的真核細(xì)胞;由上述重組MVA病毒感染的細(xì)胞,其中的外源基因編碼T7 RNA聚合酶;由上述重組MVA病毒感染的細(xì)胞,其中的外源基因編碼T7 RNA聚合酶,此外還包含載有一種或幾種處于T7 RNA聚合酶啟動子轉(zhuǎn)錄控制之下的外源基因的一種或幾種表達(dá)載體;上述細(xì)胞的應(yīng)用,用于產(chǎn)生由上述外源基因編碼的多肽,包括a)在適宜條件下培養(yǎng)上述的細(xì)胞,以及b)分離由上述的外源基因編碼的多肽。
由上述重組MVA病毒感染的細(xì)胞,其中的外源基因編碼T7 RNA聚合酶,此外還包含表達(dá)載體,該表達(dá)載體載有處于T7 RNA聚合酶啟動子控制之下的病毒基因和/或編碼一病毒載體基因組的一種病毒載體構(gòu)建體;上述細(xì)胞的應(yīng)用,用于產(chǎn)生病毒顆粒,包括a)在適宜條件下培養(yǎng)上述的細(xì)胞,以及b)分離病毒顆粒;由上述MVA病毒感染的細(xì)胞,其中的外源基因編碼T7 RNA聚合酶,此外還含有a)載有一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體的表達(dá)載體,它能夠感染和指導(dǎo)由上述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體攜帶的一種或幾種外源基因在靶細(xì)胞中的表達(dá),以及b)一種或幾種表達(dá)載體,其載有的基因處于T7 RNA聚合酶啟動子轉(zhuǎn)錄控制之下并編碼上述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體的基因組包裝所必需的多肽;上述細(xì)胞的應(yīng)用,用于產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子,包括a)在適宜條件下培養(yǎng)上述細(xì)胞,以及b)分離逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒;含有上述重組MVA病毒的疫苗,其中的外源基因在生理可接受載體中編碼一抗原決定簇;上述重組MVA病毒的應(yīng)用,其中的外源基因編碼一種疫苗制劑中的抗原決定簇;上述疫苗的應(yīng)用,用于免疫活的動物體,包括人;
上述含有MVA-LAInef的疫苗的應(yīng)用,用于預(yù)防或治療人免疫缺陷病毒(HIV)感染或愛滋病(AIDS);上述含有MVA-hTYR的疫苗的應(yīng)用,用于預(yù)防或治療黑素瘤;一種疫苗,其第一種組分包括一種上述重組MVA病毒,其中包括的外源基因在生理可接受載體中編碼T7 RNA聚合酶;第二種組分包括一種載有在生理可接受載體中處于T7 RNA聚合酶啟動子轉(zhuǎn)錄控制之下的抗原決定簇的DNA序列,兩種組分可同時包含或分別包含;上述疫苗的應(yīng)用,用于免疫活的動物體,包括人,包含用疫苗的第一種和第二種組分對上述活的動物體,包括人,進(jìn)行同時接種或在同一接種部位延時接種;以及術(shù)語“基因”表示編碼一種蛋白或肽的任何DNA序列。
術(shù)語“外源基因”表示插入一DNA序列的基因,該序列中通常未發(fā)現(xiàn)該基因。
外源基因可以是例如標(biāo)記基因、治療基因、編碼抗原決定簇的基因或病毒基因。這類基因在本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知。
本發(fā)明更具體地涉及1.重組MVA病毒,它含有并能表達(dá)HIVnef抗原或抗原決定簇。
2.項1的重組MVA病毒,其中的HIVnef基因受痘苗病毒早期/晚期啟動子P7.5的控制。
3.項1或2的重組MVA病毒,基本上不含有能在人的細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的病毒。
4.一種真核細(xì)胞,被項1-3之一的重組MVA病毒感染。
5.一種疫苗,在生理可接受的載體中含有項1-3之一所述重組MVA病毒。
6.項1-3之一的重組MVA病毒在疫苗制備中的用途。
7.用于免疫活動物體(包括人)的項1-3之一所述重組MVA病毒和/或項5所述疫苗。
8.用于預(yù)防或治療HIV感染或AIDS的項7所述重組MVA病毒和/或疫苗。
9.項1-3之一的重組MVA病毒在制備重組HIVnef蛋白中的用途。
本發(fā)明還涉及
1.重組MVA病毒,含有并能表達(dá)人酪氨酸酶(hTyr)抗原或抗原決定簇。
2.項1的重組MVA病毒,其中的hTyr基因受痘苗病毒早期/晚期啟動子P7.5的控制。
3.項1或2的重組MVA病毒,基本上不含有能在人的細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的病毒。
4.一種真核細(xì)胞,被項1-3之一的重組MVA病毒感染。
5.項1-3之一的重組MVA病毒在制備重組hTyr蛋白中的用途。
6.一種疫苗,在生理可接受的載體中含有項1-3之一的重組MVA病毒和/或項5的重組hTyr蛋白。
7.項1-3之一的重組MVA病毒和/或項5的重組hTyr蛋白在疫苗制備中的用途。
8.用于免疫活動物體(包括人)的項1-3之一所述重組MVA病毒和/或項5所述重組hTyr蛋白和/或項6所述疫苗。
9.用于預(yù)防或治療黑色素瘤的項8所述重組MVA病毒,重組hTyr蛋白和/或疫苗。
10.項1-3之一的重組MVA病毒在回體(ex vivo)基因治療中的用途。
本發(fā)明的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)是一種宿主范圍局限的和高度減毒的痘苗病毒菌株,它在測試的人和大多數(shù)其它哺乳動物細(xì)胞系中不能增殖。但由于在非允許細(xì)胞中病毒基因表達(dá)未受損傷,依據(jù)本發(fā)明的重組MVA病毒可能用作特別安全和有效的表達(dá)載體。
編碼抗原決定簇的重組MVA病毒在一種實施方案中,本發(fā)明涉及重組痘苗病毒,其含有編碼外源抗原,優(yōu)選地屬于致病病原體的基因,以及以生理可接受形式包含此類病毒的疫苗。本發(fā)明也涉及制備此類重組MVA痘苗病毒或疫苗的方法;涉及應(yīng)用這些疫苗預(yù)防那些致病病原體引起的感染。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中,插入MVA病毒的外源基因是一種編碼HIVnef的基因。
我們已構(gòu)建了重組MVA病毒,允許HIV-Inef基因在痘苗病毒早/晚期啟動子P7.5的控制下進(jìn)行表達(dá)。靈長類慢病毒的調(diào)節(jié)性Nef蛋白合成于病毒復(fù)制周期的早期并已表明對高滴度病毒復(fù)制和體內(nèi)疾病誘導(dǎo)起重要作用。這提示HIVNef可能在愛滋病病理中有關(guān)鍵作用。Nef促進(jìn)病毒感染性增加和HIV致病性的分子機(jī)制需要進(jìn)一步闡明。但是,Nef是免疫原性的并且Nef特異抗原可用作疫苗防治HIV感染和愛滋病。
在本文中,表達(dá)HIVnef基因的重組MVA病毒可用于人體免疫,一方面作為預(yù)防疫苗防止人HIV病毒,另一方面用于HIV感染或愛滋病人的免疫治療。另外,表達(dá)HIVnef基因的MVA病毒也可用于重組HIV Nef蛋白的產(chǎn)生。
本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方案中,插入MVA病毒的外源基因是一編碼人酪氨酸酶的基因。
我們已構(gòu)建了重組MVA病毒,允許人酪氨酸酶基因在痘苗病毒早/晚期啟動子P7.5的控制下進(jìn)行表達(dá)。近來。人酪氨酸酶被鑒定為黑素瘤特異性腫瘤抗原,它可造成抗腫瘤的溶細(xì)胞T-淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生(Brichard,V.等 實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)178,489-495)。由于正常細(xì)胞中看來只有黑素細(xì)胞表達(dá)酪氨酸酶基因,因而酪氨酸酶成為黑素瘤免疫治療的有效目標(biāo)抗原。所以,表達(dá)人酪氨酸酶基因的重組MVA病毒可用于黑素瘤病人以誘導(dǎo)激發(fā)腫瘤排斥或防止轉(zhuǎn)移的免疫反應(yīng)。表達(dá)人酪氨酸酶基因的重組MVA病毒可直接用作抗黑素瘤疫苗,或用病毒制備抗黑素瘤疫苗。在一種例子中,表達(dá)人酪氨酸酶基因的重組MVA病毒可用于產(chǎn)生重組酪氨酸酶蛋白,它作為抗原用于疫苗制劑。在另一種例子中,用表達(dá)人酪氨酸酶基因的重組MVA病毒作為表達(dá)載體,來自腫瘤病人的細(xì)胞體外修飾以表達(dá)酪氨酸酶并繼而轉(zhuǎn)移回病人來誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。基于表達(dá)人酪氨酸酶基因的重組MVA病毒的制備疫苗可用于腸胃外或腫瘤部位。可以防止腫瘤轉(zhuǎn)移或腫瘤的諸如大小、形狀、稠度、血管形成或其它表型變化。以表達(dá)人酪氨酸酶基因的重組MVA為基礎(chǔ)制備的疫苗可用于手術(shù)切除腫瘤前、期間或切除后。
為了制備疫苗,依據(jù)本發(fā)明的MVA痘苗病毒要轉(zhuǎn)換成生理可接受形式。這可基于制備MVA疫苗以免疫天花的經(jīng)驗進(jìn)行(如Stickl,H.等 Dtsch.Med.Wschr.99,2386-2392所述)。典型地,大約106-108重組MVA顆粒在含2%胨和1%人白蛋白的100毫升磷酸鹽緩沖液(PBS)中凍干并置于一種安瓿管中,優(yōu)選地是一玻璃安瓿管。凍干品可含有補(bǔ)充劑(例如甘露糖醇、葡聚糖、蔗糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮)或其它助劑(例如抗氧化劑,穩(wěn)定劑等,以適用于腸胃外給藥。玻璃安瓿管繼而密封并可優(yōu)選地在-20℃以下貯存幾個月。
用于接種或治療的凍干品可溶于0.1到0.5毫升水溶液,優(yōu)選地是生理鹽水中,并經(jīng)腸胃外給藥例如肌肉內(nèi)接種或局部給藥例如接種到腫瘤或在腫瘤部位局部給藥。根據(jù)本發(fā)明的疫苗或治療優(yōu)選地采用肌肉內(nèi)注射(Mayr,A.等 Zbl,Bakt.Hyg.,I.Abt.Orig.B 167,375-390)。給藥方式,劑量和給藥次數(shù)可由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員對所知方式進(jìn)行優(yōu)化。合適的話,在長時間內(nèi)接種多次以獲得對外源抗原合適的免疫反應(yīng)是適宜的。
重組MVA病毒用于產(chǎn)生異源多肽的用途依據(jù)本發(fā)明的重組MVA痘苗病毒也可用于在真核細(xì)胞中制備異源多肽。這導(dǎo)致產(chǎn)生被重組痘苗病毒感染的細(xì)胞。編碼異源多肽的基因在細(xì)胞中表達(dá),并分離所表達(dá)的異源多肽。產(chǎn)生此類異源多肽的方法通常為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知(EP-A-206和EP-A-205,939)。由于MVA病毒的特殊屬性,在重組MVA病毒幫助下產(chǎn)生的多肽非常適于用作人和動物藥物。
編碼T7 RNA聚合酶的重組MVA病毒及其用于在T7 RNA聚合酶啟動子轉(zhuǎn)錄控制下表達(dá)DNA序列的用途在本發(fā)明的進(jìn)一種實施方案中,我們構(gòu)建了重組MVA病毒,允許在痘苗病毒早期/晚期啟動子P7.5的控制下表達(dá)噬菌體T7 RNA聚合酶。MVA-T7pol重組病毒作為表達(dá)系統(tǒng)的用途已經(jīng)過誘導(dǎo)處于T7 RNA聚合酶啟動子控制之下的重組基因表達(dá)的瞬間轉(zhuǎn)染分析得到證實。使用大腸桿菌(E.coli)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因作為報告基因,我們發(fā)現(xiàn)MVA-T7聚合酶誘導(dǎo)的CAT基因表達(dá)就象衍生于痘苗病毒復(fù)制型WR菌株的痘苗病毒/T7pol重組體一樣有效。
依據(jù)本發(fā)明的MVA/T7聚合酶雜合系統(tǒng)從而可用作簡單、有效和安全的哺乳動物表達(dá)系統(tǒng),以在缺乏大量痘苗病毒復(fù)制的情況下產(chǎn)生多肽。
此表達(dá)系統(tǒng)也可用于在T7 RNA聚合酶啟動子轉(zhuǎn)錄控制下產(chǎn)生重組病毒粒子以用于免疫接種或基因治療,上述病毒粒子通過被表達(dá)T7 RNA聚合酶的重組MVA或包含所有或部分基因的DNA構(gòu)建體以及為產(chǎn)生諸如MVA粒子或逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子等的病毒粒子所必需的基因組或重組基因組感染的細(xì)胞系的轉(zhuǎn)化來產(chǎn)生。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)由兩種組分組成1)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體本身是一種修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒(載體質(zhì)粒),其中編碼病毒蛋白的基因被將要傳遞給靶細(xì)胞的治療基因和標(biāo)記基因代替。由于編碼病毒蛋白的基因替代損壞了病毒,必須在系統(tǒng)中存在第二種組分提供給修飾逆轉(zhuǎn)錄病毒丟失的病毒蛋白以拯救該病毒。
第二種組分是2)產(chǎn)生大量病毒蛋白但又缺乏產(chǎn)生可復(fù)制型病毒能力的細(xì)胞系。此細(xì)胞系稱為包裝細(xì)胞系并含有被一種或多個攜帶能夠包裝修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的基因(編碼gag,pol和env多肽的基因)的質(zhì)粒所轉(zhuǎn)染的一細(xì)胞系。
為了產(chǎn)生包裝的載體,載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入包裝細(xì)胞系。在這種情況下,含有插入的治療和標(biāo)記基因的改良逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組從載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄并包裝入改良逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子(重組病毒粒子)。然后用此重組病毒感染靶細(xì)胞,其載體基因組和任何攜帶的標(biāo)記或治療基因整合到靶細(xì)胞DNA。受此重組病毒粒子感染的細(xì)胞不能產(chǎn)生新的載體病毒,因為這些細(xì)胞中沒有病毒蛋白質(zhì)。但攜帶治療和標(biāo)記基因的載體DNA整合到了細(xì)胞DNA并能在感染細(xì)胞中表達(dá)。
依據(jù)本發(fā)明表達(dá)T7 RNA聚合酶的重組MVA病毒可用于產(chǎn)生包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒載體所需的蛋白。為此目標(biāo),把一種逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如鼠白血病病毒(MLV))的gag,pol和env基因置于一種或多個表達(dá)載體(例如質(zhì)粒)中T7RNA聚合酶啟動子轉(zhuǎn)錄控制之下。表達(dá)載體隨后引入用重組MVA病毒感染的表達(dá)T7 RNA聚合酶的細(xì)胞中,同時轉(zhuǎn)入載有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體的一種表達(dá)載體,通常處于T7 RNA聚合酶啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
WO94/29437,WO89/11539和WO96/07748描述了不同類型的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體,它們可用上述包裝系統(tǒng)進(jìn)行包裝。
表達(dá)T7 RNA聚合酶的重組MVA病毒的再一種應(yīng)用是產(chǎn)生重組蛋白,非感染性病毒粒子,或感染性突變病毒粒子,以用于生產(chǎn)疫苗或治療劑(Buchholz等,病毒學(xué)(Virology),204,770-776(1994)和EP-B1-356695)。為此目的,把病毒基因(例如HIV-1的gag-pol和env基因)置于一種表達(dá)載體(例如質(zhì)?;蚱渌亟MMVA病毒)中T7啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下。此構(gòu)建體隨后引入用重組MVA病毒感染的表達(dá)T7 RNA聚合酶的細(xì)胞中。重組病毒基因高效轉(zhuǎn)錄,重組蛋白大量制造并可純化。此外,表達(dá)的重組病毒蛋白(例如HIV-1的env,gag)可能組裝成假病毒粒子從細(xì)胞出芽并可從組織培養(yǎng)物中分離。在另一種實施方案中,由MVA-T7pol系統(tǒng)表達(dá)的病毒蛋白(來源于例如人免疫缺陷病毒(HIV),猴免疫缺陷病毒(SIV),麻疹病毒(Measles virus))通過克服病毒增殖中吸附和感染,脫殼,核酸復(fù)制,病毒基因表達(dá),裝配,出芽或其它步驟中的缺陷來拯救引入的突變病毒,從而可產(chǎn)生并純化所述的突變病毒。
MVA-T7pol也可與攜帶感興趣抗原基因(例如,HIV的nef,tat,gag,pol或env或其它基因)的DNA序列同時使用進(jìn)行免疫。首先,給定抗原(例如人免疫缺陷病毒(HIV),丙型肝炎病毒(HCV),人乳頭瘤病毒(HPV),單純皰疹病毒(HSV),麻疹病毒,流感病毒或其它)的編碼序列克隆到處于T7 RNA聚合酶啟動子控制之下優(yōu)選地是質(zhì)粒的載體中并使用常規(guī)實驗室方法擴(kuò)增和純化產(chǎn)生的DNA構(gòu)建體。其次,載體DNA同時或在適當(dāng)時間延遲后與MVA-T7pol一起免疫接種。在接種部位,感興趣的重組基因在含有載體DNA和MVA-T7pol的細(xì)胞中瞬時表達(dá)并且相應(yīng)抗原存在于宿主免疫系統(tǒng)刺激了抗原特異性免疫反應(yīng)。這種使用非復(fù)制痘苗載體MVA-T7pol的方案代表了一種提供給定抗原有效瞬時表達(dá)而又避免了組成型基因表達(dá)潛在危險的核酸免疫接種的有前途的新方法。
重組MVA痘苗病毒可按下文陳述進(jìn)行制備。
一種包含側(cè)翼為MVA基因組中鄰近自然發(fā)生缺失例如缺失II的MVADNA序列的編碼一種外源多肽DNA序列的DNA構(gòu)建體,引入到用MVA感染的細(xì)胞中,以發(fā)生同源重組。一旦把DNA構(gòu)建體引入真核細(xì)胞并且外源DNA與病毒DNA重組,就可能通過對所需重組痘苗病毒用已知的方式,優(yōu)選地在標(biāo)記幫助下,分離到所需重組痘苗病毒(對比Nakano等,美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)79,1593-1596 ,F(xiàn)ranke等,分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)1918-1924 ,Chakrabarti等,分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)3403-3409 ,F(xiàn)athi等,病毒學(xué)(Virology)97-105 )。要插入的DNA-構(gòu)建體可以是線狀的或環(huán)狀的。環(huán)狀DNA是優(yōu)選的,特別是質(zhì)粒。DNA-構(gòu)建體包含位于MVA基因組自然發(fā)生缺失例如缺失II左方和右方側(cè)翼的序列(Altenburger,W.,Suter,C.P.和Altenburger J.(1989)病毒學(xué)集刊(Arch.Virol.)105,15-27)。外源DNA序列插入位于自然發(fā)生缺失側(cè)翼的序列之間。外源DNA序列可以是編碼治療多肽,例如組織血纖維溶酶原激活劑(t-PA)或干擾素,或來自致病病原體的抗原決定簇的基因。致病病原體可以是導(dǎo)致疾病的病毒、細(xì)菌和寄生蟲,也可能是在有機(jī)體中無限制增殖從而可能導(dǎo)致病理生長的腫瘤細(xì)胞。這些致病病原體的例子由Davis,B.D.等做過描述(微生物學(xué)(Microbiology)第三版,Harper International Edition)。優(yōu)選的致病病原體抗原來自人免疫缺陷病毒(例如HIV-1和HIV-2),導(dǎo)致肺結(jié)核的分枝桿菌,寄生蟲惡性瘧蟲,以及黑素瘤細(xì)胞。
為了表達(dá)一種DNA序列或基因,DNA中必須存在基因轉(zhuǎn)錄必需的調(diào)節(jié)序列。這些調(diào)節(jié)序列(稱為啟動子)為本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知并包含例如EP-A-198,328中所述的痘苗病毒11kDa基因和那些7.5kDa基因(EP-A-110,385)。DNA構(gòu)建體可通過轉(zhuǎn)染,例如通過磷酸鈣沉淀方法(Graham等,病毒學(xué)(Virol.)52,456-467 ;Wigler等,細(xì)胞(Cell)777-785 )通過電穿孔方法(Neumann等,歐洲分子生物學(xué)組織雜志(EMBO J.I,)841-845 ),通過微注射方法(Graessmann等,酶學(xué)方法(Meth.Enzymology)101,482-492(1983)),通過脂質(zhì)體方法(Straubinger等,酶學(xué)方法(Methods in Enzymology 101,512-527(1983),通過原生質(zhì)球方法(Schaffner,美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77,2163-2167(1980))或其它本技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法引入到MVA感染的細(xì)胞。通過磷酸鈣沉淀進(jìn)行轉(zhuǎn)染是優(yōu)選的方法。
下面的詳細(xì)實施例是為了有助于對本發(fā)明的更好理解。但不是說本發(fā)明僅局限于實施例內(nèi)容。
圖1圖示MVA基因組圖譜和用于通過同源重組插入外源DNA的質(zhì)粒圖譜MVA基因組中的HindIII限制性位點標(biāo)在上面。顯示了重疊MVA基因組中缺失II接界的900bp HindIII-HindIII N片段。鄰近缺失II的MVADNA序列通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增并用于構(gòu)建插入質(zhì)粒pUCIILZ。
圖2pUCIILZP7.5用于插入缺失II的MVA載體質(zhì)粒,包含P11-Lac Z表達(dá)盒和痘苗病毒早期/晚期啟動子P7.5以表達(dá)可克隆到質(zhì)粒SmaI位點的感興趣基因。
圖3pUCIILZdel P7.5用于在MVA基因組缺失II位點插入外源基因的MVA載體質(zhì)粒,含有自缺失P11-Lac Z表達(dá)盒和痘苗病毒早期/晚期啟動子P7.5以表達(dá)可克隆到質(zhì)粒SmaI/NotI克隆位點的感興趣基因。圖4重組病毒MVA-T7pol的構(gòu)建圖示MVA基因組(HindIII限制性內(nèi)切核酸酶位點)圖譜以及使T7 RNA聚合酶基因插入MVA基因組HingIIIN片段中缺失II位點的載體質(zhì)粒pUCIILZT7pol的圖譜。
圖5MVA-T7pol病毒DNA的Sourthern印跡檢測圖6用[35S]甲硫氨酸對蛋白進(jìn)行代謝標(biāo)記。SDS聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳檢測。泳道1MVAT7pol,泳道2MVA,泳道3CV-1細(xì)胞。
圖7氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(CAT)檢測用含有處于T7 RNA聚合酶啟動子控制下的CAT基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的以及用MVA-T/pol或WR-T7pol感染的CV-1細(xì)胞。裂解物用于檢測CAT活性。C是指氯霉素,1-AcC和3-AcC是指單和三乙?;问降穆让顾?。Cat活性用60分鐘內(nèi)形成的乙?;a(chǎn)物百分?jǐn)?shù)表示。
圖8MVA-LAInef的構(gòu)建圖示MVA基因組(HindIII限制性內(nèi)切核酸酶位點)圖譜以及使HIV-1LAI的nef基因插入MVA基因組HindIIIN片段中缺失II位點上的載體質(zhì)粒pUCIILZdel P7.5-LAInef的圖譜。圖9MVA-hTYR的構(gòu)建圖示MVA基因組(HindIII限制性內(nèi)切核酸酶位點)圖譜以及使人酪氨酸酶基因插入MVA基因組HindIIIN片段中缺失II位點上的載體質(zhì)粒pUCIILZdel P7.5-TYR的圖譜。
實施例1.病毒的生長和純化1.1MVA病毒的生長MVA病毒是一種高度減毒的痘苗病毒,它由安卡拉痘苗病毒(CVA)通過在原代雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)培養(yǎng)物中長期連續(xù)傳代衍生而來。關(guān)于產(chǎn)物的歷史、特性及MVA菌株的應(yīng)用的概括性綜述參考Mayr等在感染(Infection)3,6-14 中發(fā)表的總結(jié)。由于在CEF中的減毒,MVA病毒在這種禽宿主細(xì)胞中復(fù)制到很高的滴度。然而在哺乳動物細(xì)胞中MVA是嚴(yán)格生長局限的,并且檢測不到病毒引起的典型噬斑形成。所以,MVA病毒要生長于CEF細(xì)胞。為了制備CEF細(xì)胞,從孵化11天的雞蛋中分離胚,去除末端,并把胚絞碎后在含有0.25%胰蛋白酶的溶液中37℃解離20分鐘。過濾產(chǎn)生的細(xì)胞懸液并用SorvaURC-3B離心機(jī)在室溫下2000rpm離心5分鐘沉淀細(xì)胞,重懸于10體積培養(yǎng)基A(Eagle基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEM Eagle),例如可獲取于Life Technologies GmbH,Eggenstein,Germany),并再用SorvallRC-3B離心機(jī)在室溫下2000rpm離心5分鐘進(jìn)行沉淀。細(xì)胞沉淀重懸于含10%胎牛血清(FCS),青霉素(100單位/毫升),鏈霉素(100毫克/毫升)和2mM谷氨酰氨的培養(yǎng)基A中以獲得含500000細(xì)胞/毫升的細(xì)胞懸液。用這種方法獲得的CEF細(xì)胞鋪于細(xì)胞培養(yǎng)皿中。把它們放到培養(yǎng)基A中,按照所需細(xì)胞濃度在二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃生長1-2天,并直接或再進(jìn)行一次細(xì)胞傳代后用于感染。制備原代培養(yǎng)物的詳細(xì)描述可在R.I.Freshney,“動物細(xì)胞培養(yǎng)”(“Culture of animal cell”),Alan R.Liss Verlag,New York 一書中第11章99頁及其下列等等中找到。
MVA病毒按下面方法用于感染。CEF細(xì)胞培養(yǎng)在175厘米2細(xì)胞培養(yǎng)瓶。在90%-100%鋪滿時,去除培養(yǎng)基并且細(xì)胞在培養(yǎng)基A中與MVA病毒懸液(每個細(xì)胞0.01感染單位(IU),0.02毫升/厘米2)共培養(yǎng)1小時。然后添加更多的培養(yǎng)基A(0.2毫升/厘米2)并且把培養(yǎng)瓶在37℃培養(yǎng)2-3天(直到大約90%的細(xì)胞表現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng))。通過刮細(xì)胞單層到培養(yǎng)基并在Sorvall RC-3B離心機(jī)中4℃ 3000rpm離心5分鐘沉淀細(xì)胞物質(zhì)制備粗病毒貯存物。粗病毒制劑在進(jìn)一步處理(例如病毒純化)前貯存于-20℃。
1.2病毒的純化為獲得盡可能純的并且不含對宿主細(xì)胞特異組分的病毒所采用的純化步驟類似于Joklik所述(病毒學(xué)(Virology)18,9-18 )。融解貯存于-20℃的粗病毒保存物并在PBS中懸浮一次(10-20倍沉淀體積),懸浮液如上述方式離心。新沉淀懸浮于10倍體積Tris緩沖液1(10mM Tris-HCl pH9.0),懸浮液用超聲波簡短處理(Labsonic L,B.Braun Biotech International,Melsungen Germany;2×10秒,60瓦,室溫)以進(jìn)一步離解細(xì)胞碎片并從細(xì)胞物質(zhì)中釋放病毒粒子。細(xì)胞核和較大細(xì)胞碎片繼而通過懸浮液的簡短離心去除(獲取于杜邦公司(Du Pont Co.)的Sorvall GSA轉(zhuǎn)頭,D-6353 BadNauheim,F(xiàn)RG;3000rpm 10℃離心3分鐘)。沉淀再一次懸浮于Tris緩沖液1,用超聲波處理并離心,如上所述。收集的含游離病毒粒子的上清液聯(lián)合并鋪層于10mM Tris-HCl,pH9.0的10毫升36%蔗糖墊層上,在Beckman SW27/SW 28離心機(jī)轉(zhuǎn)頭中4℃13,500rpm離心80分鐘。去掉上清液,含有病毒粒子的沉淀溶解于10毫升pH9.0的1mM Tris-HCl,用超聲波簡短處理(室溫下2×10秒,儀器如上所述)均勻,加樣到20%-40%蔗糖梯度(蔗糖溶于1mM Tris-HCl,pH9.0)以進(jìn)一步純化。梯度液在Beckmann SW 41離心機(jī)轉(zhuǎn)頭中4℃13,000rpm離心50分鐘。離心后,含有病毒粒子的分離帶在抽吸去帶上面體積后用移液管收集。獲得的蔗糖溶液用三倍體積PBS稀釋然后病毒粒子再通過離心沉淀(Beckmann SW 27/28,60分鐘,13,500rpm,4℃)?,F(xiàn)在,沉淀絕大部分由純病毒粒子構(gòu)成,它重懸于PBS并平衡至病毒濃度平均相當(dāng)于1-5×109IU/ml。純化的病毒貯存液貯存于-80℃并直接或用PBS稀釋后用于隨后的實驗。
1.3MVA病毒的克隆為了產(chǎn)生均勻貯存病毒制劑,獲取于Anton Mayr教授的MVA病毒通過在96孔組織培養(yǎng)板上CEF培養(yǎng)物中連續(xù)三次傳代過程中的有限稀釋進(jìn)行克隆化。篩選到MVA克隆F6并在CEF中擴(kuò)增以獲得病毒的工作貯存物,作為產(chǎn)生本發(fā)明申請中描述的重組MVA病毒以及用于產(chǎn)生以前描述的重組MVA病毒的起始材料(Sutter,G.and Moss,B. 美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89,10847-10851;Sutter,G.,Wyatt,L.,F(xiàn)oley,P.,Bennink,J.和Moss,B. 疫苗(Vaccine)12,1032-1040;Hirsch,V.,F(xiàn)uerst,T.,Sutter,G.,Carroll,M.,Yang,L.,Goldstein,S.,Piatak,M.,Elkins,W.,Alvord,G.,Montefiori,D.,Moss,B.and Lifson,J. 病毒學(xué)雜志(J.Virol.)70,3741-3752)。
2.重組MVA病毒的構(gòu)建及其特征2.1.載體質(zhì)粒構(gòu)建為了實現(xiàn)重組MVA病毒的產(chǎn)生,構(gòu)建了新的載體質(zhì)粒。插入到MVA基因組的外源基因準(zhǔn)確定位于MVA基因組自然發(fā)生缺失II位點。位于MVA基因組HindIIIN片段中2500bp缺失位點側(cè)翼的MVA DNA序列(Altenburger,W.,Suter,C.P.和Altenburger,J. ,病毒學(xué)集刊(J.Arch.Virol.)105,15-27)用PCR法擴(kuò)增并克隆到質(zhì)粒pUC18的多克隆位點。用于左方600bp DNA側(cè)翼的引物是5′-CAGCAGGGTACCCTCATCGTACAGGACGTTCTC-3′和5′-CAGCAGCCCGGGTATTCGATGATTATTTTTAACAAAATAACA-3′(限制性酶KpnI和SmaI位點下面劃線)。用于右方550bp DNA側(cè)翼的引物是5′-CAGCAGCTGCAGGAATCATCCATTCCACTGAATAGC-3′和5′CAGCAGGCATGCCGACGAACAAGGAACTGTAGCAGA-3′(限制性酶PstI和SphI位點下面劃線)。在插入到pUC18的MVADNA這兩段側(cè)翼之間,利用BamHI位點插入處于痘苗病毒晚期啟動子P11控制之下的大腸桿菌(Escherichia coli)Lac Z基因(通過pIIILZ限制性消化制備,Sutter,G.和Moss,B. 美國國家科學(xué)院院報(PNAS USA)89,10847-10851),從而產(chǎn)生MVA插入載體pUCIILZ[圖1]。接下來一段含有痘苗病毒早期一晚期啟動子P7.5以及用于克隆的SmaI位點的289bp片段(通過EcoRI和XbaI限制性消化質(zhì)粒載體pSCII制備[Chakra barti等,1985,分子和細(xì)胞生物學(xué)(Molecularand Cellular Biology)5,3403-3409])插入到pUCIILZ的SmaI位點產(chǎn)生了MVA載體pUCIILZ P7.5[圖2]。為了構(gòu)建一種載體質(zhì)粒以通過報告酶β-半乳糖苷酶的瞬時合成實現(xiàn)重組MVA病毒的分離,一種來自大腸桿菌(E.coli)Lac Z開放閱讀框3′末端的330bp DNA片段用PCR擴(kuò)增(引物是5′-CAGCAGGTCGACCCCGACCGCCTTACTGCCGCC-3′和5′-GGGGGGCTGCAGATGGTAGCGACCGGCGCTCAG-3′)并克隆到pUCIILZP7.5的SalI和PstI位點,獲得MVA載體pUCIILZdel P7.5[圖3]。利用SmaI位點,此載體質(zhì)??捎糜诎烟幱诙幻绮《締幼覲7.5轉(zhuǎn)錄控制之下的編碼外源基因的DNA序列插入到MVA染色體。在通過篩選β-半乳糖苷酶活性分離到所需重組病毒后,重組病毒的進(jìn)一步增殖導(dǎo)致通過同源重組產(chǎn)生再改造P11-LacZ表達(dá)盒的自缺失。
2.2.重組病毒MVA T7pol的構(gòu)建和特征一種含有處于痘苗病毒早期/晚期啟動子P7.5控制之下的噬菌體T7RNA聚合酶完整基因的3.1Kbp DNA片段用EcoR1從質(zhì)粒pTFF3上切下(Fuerst,T.R.,Niles,E.G.,Studier,F(xiàn).W.和Moss,B.,1986,美國國家科學(xué)院院報(P.N.A.S.USA)83,8122-8126),與Klenow DNA聚和酶一起溫育修飾產(chǎn)生平頭末端,并克隆到pUCIILZ的單獨SmaI限制性位點。產(chǎn)生質(zhì)粒轉(zhuǎn)移載體pUCIILZ T7pol[圖4]。選擇痘苗病毒早期/晚期啟動子P7.5作為T7 RNA聚合酶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子。與較強(qiáng)的痘苗病毒晚期啟動子(例如P11)相反,此啟動子系統(tǒng)使重組基因在靶細(xì)胞感染后立即表達(dá)。指導(dǎo)外源基因插入MVA基因組缺失II位點的質(zhì)粒pUCIILZ T7pol用于產(chǎn)生重組病毒MVAT7pol。
用MVA在每細(xì)胞感染復(fù)數(shù)為0.05 TCID50情況下感染的CEF細(xì)胞,按照前面所述使用質(zhì)粒pUCIILZ T7pol DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染(Sutter,G.,Wyatt,L.,F(xiàn)oley,P.,Bennink,J.和Moss,B.(1994)疫苗(Vaccine)12,1032-1040)。表達(dá)T7RNA聚合酶并共表達(dá)β-D-半乳糖苷酶的重組MVA病毒(MVA P7.5-T7pol)通過在CEF細(xì)胞中用5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷(300μg/ml)進(jìn)行連續(xù)五輪噬斑純化選擇出來。隨后,通過感染CEF單層擴(kuò)增重組病毒,并用PCR檢測DNA以證實病毒貯存物的遺傳均一性。MVA-T7pol病毒DNA的Southern印跡檢測證明了重組基因在MVA基因組中缺失II位點的穩(wěn)定整合[圖5]。
為檢測重組MVA T7pol的T7 RNA聚合酶表達(dá),測定了來自病毒感染的組織培養(yǎng)物中的[35S]甲硫氨酸標(biāo)記多肽。生長于12孔板上的單層猴腎細(xì)胞系CV-1用病毒以每細(xì)胞感染復(fù)數(shù)20TCID50進(jìn)行感染。感染3到5小時后,去除培養(yǎng)基,并用1毫升無甲硫氨酸培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)物一次。每孔加入補(bǔ)充有50微居里(μCi)[35S]甲硫氨酸的0.2毫升無甲硫氨酸培養(yǎng)基并在37℃溫育30分鐘。感染細(xì)胞的胞質(zhì)抽提物通過每孔在0.2毫升0.5%Nonidet P-40裂解緩沖液中37℃溫育10分鐘制備,樣品用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。CV-1細(xì)胞與MVA T7pol的代謝標(biāo)記顯示了兩種額外多肽的合成(i)一種大約116,000道爾頓的蛋白代表共表達(dá)的大腸桿菌β-半乳糖苷酶以篩選重組病毒以及(ii)一種98,000道爾頓的蛋白,同噬菌體T7 RNA聚合酶預(yù)期大小一致[圖6]。由MVAT7pol產(chǎn)生的大量β-半乳糖苷酶是令人注目的。體內(nèi)實驗的結(jié)果表明,當(dāng)插入到MVA基因組缺失II位點時有P11-Lac Z基因構(gòu)建體的強(qiáng)表達(dá),揭示MVA載體病毒中的重組基因當(dāng)插入到MVA基因組的該位置時可能會更有效地表達(dá)。
MVA-T7pol重組病毒作為表達(dá)系統(tǒng)的用途與WR-T7pol重組病毒vTF 7-3(Fuerst等1986)的比較通過一種質(zhì)粒載體DNA的共轉(zhuǎn)染進(jìn)行了測定,該質(zhì)粒載體衍生于pTM1(Moss,B.,Elroy-Stein,O.,Mizukami,T.,Alexander,W.A.,和Fuerst T.R.(1990)自然(Nature)348,91-92)并含有(克隆到pTM1多克隆位點的NcoI和BamHI位點)處于T7 RNA聚合酶啟動子(PT7)控制之下的大腸桿菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因。轉(zhuǎn)染和感染的CV-1細(xì)胞懸浮于0.2毫升0.25M Tris-HCl(pH7.5)。三輪凍融循環(huán)后,通過離心澄清裂解液,測定了上清液中蛋白含量,并且含0.5,0.25,0.1微克總蛋白的樣品按Mackett,M.,Smith,G.L.和Moss,B.(1984)病毒學(xué)雜志(J.Virol.)49,857-864所述檢測了酶活性。放射自顯影后,用Fuji成像檢測系統(tǒng)定量標(biāo)記斑點。結(jié)果表明通過使用高減毒痘苗載體MVA,可能利用痘苗病毒-T7RNA聚合酶系統(tǒng)時就象使用完全的可復(fù)制型痘苗病毒重組體一樣有效[圖7]。
2.3.重組病毒MVA-LAInef的構(gòu)建及鑒定一種含有HIV-1 LAI完整nef基因的648bp DNA片段通過PCR從質(zhì)粒DNA制備(pTG 1166由M.-P.Kieny,Transgene S.A.,Strasbourg惠贈;PCR引物為5′-CAGCAGGGATCCATGGGTGGCAAGTGGTCAAAAAGTAGT-3′和5′-CAGCAGGGATCCATGTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCCGG-3′),用限制性內(nèi)切核酸酶BamHI消化,與Klenow DNA聚合酶一起溫育修飾以產(chǎn)生平頭末端,并克隆到pUCIIL Zdel P7.5的SmaI位點以產(chǎn)生載體pUCIILZdel P7.5-LAInef[圖8]。此質(zhì)??捎糜诟脑霱VA重組病毒以在痘苗病毒早期/晚期啟動子P7.5控制下表達(dá)HIV-1 LAI的nef基因。
用MVA在每細(xì)胞感染復(fù)數(shù)0.05 TCID50感染的CEF細(xì)胞再按前述方法用質(zhì)粒pUCIIL Zdel P7.5-LAInef的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染(Sutter,G.,Wyatt,L.,F(xiàn)oley,P.,Bennink,J.和Moss,B. 疫苗(Vaccine)12,1032-1040)。含有nef基因和瞬時共表達(dá)大腸桿菌Lac Z標(biāo)記基因的重組MVA通過在CEF細(xì)胞中用5-溴-4-氯-3-吲哚β-D半乳糖苷(300μg/ml)染色的連續(xù)幾輪噬斑純化選擇出來。此后含有nef基因和缺失Lac Z標(biāo)記基因的重組MVA病毒在5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷(300μg/ml)存在下通過三輪附加的連續(xù)噬斑純化篩選以尋找CEF細(xì)胞中的非染色病毒病灶而得以分離。隨后,重組病毒感染CEF單層進(jìn)行擴(kuò)增,并且用PCR檢測MVA-LAInef病毒DNA以證實病毒貯存物的遺傳均一性。病毒DNA的Southern印跡檢測證實了MVA-LAInef的遺傳穩(wěn)定性并精確表明nef基因和大腸桿菌Lac Z標(biāo)記基因缺失整合到了病毒基因組缺失II位點。
重組Nef蛋白的有效表達(dá)通過對來自MVA-LAInef感染的CEF細(xì)胞的蛋白裂解液使用引導(dǎo)抗HIV-1 Nef的鼠單克隆抗體(由K.Krohn惠贈并按照Ovod,V.,Lagerstedt,A.,Ranki,A.,Gombert,F(xiàn).,Spohn,R.,Tahtinen,M.,Jung,G.,和Krohn,K. 愛滋病(AIDS)6,25-34所述使用)進(jìn)行Western印跡檢測得以證實。
2.4.重組病毒MVA-hTYR的構(gòu)建及鑒定一種含有編碼人酪氨酸酶完整基因的1.9kb DNA片段[酪氨酸酶C-DNA克隆123,B2分離自病人SK 29(AV)的黑素細(xì)胞系SK 29-MEL,GenBank Acc.no.UO 1873;Brichard,V.,Van Pel,A.,Wolfel,T.,Wolfel,C.,DePlaen,E.,Lethe,B.,Coulie,P.和Boon,B.(1993)實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)178,489-495]通過EcoR1消化從質(zhì)粒pc DNAI/Amp-Tyr[Wolfel,T.,Van Pel,A.,Brichard,V.,Schneider,J.,Seliger,B.,Meyer zum Buschenfelde,K.和Boon,T.(1994)歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol)24,759-764]制備,與Klenow DNA聚合酶一起溫育修飾產(chǎn)生平頭末端,并克隆到pUCIIL ZdelP7.5的SmaI位點以產(chǎn)生載體pUCIIL Zdel P7.5-TYR[圖9]。此質(zhì)??捎糜诟脑霱VA重組病毒以在痘苗病毒早期/晚期啟動子P7.5控制下表達(dá)人酪氨酸酶基因。
MVA以每細(xì)胞感染復(fù)數(shù)0.05 TCI D50感染的CEF細(xì)胞用前述的質(zhì)粒pUCIIL Zdel P7.5-TYR的DNR轉(zhuǎn)染(Sutter,G,Wyatt,L.,F(xiàn)oley,P.,Bennink,J.和Moss,B.(1994)疫苗(Vaccine)12,1032-1040)。穩(wěn)定表達(dá)人酪氨酸酶基因并瞬時共表達(dá)大腸桿菌Lac Z基因的重組MVA病毒通過在CEF細(xì)胞中用5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷(300μg/ml)染色的連續(xù)幾輪噬斑純化選擇出來。此后,表達(dá)編碼人酪氨酸酶基因并有缺失的Lac Z標(biāo)記基因的重組MVA病毒在5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷(300μg/ml)存在下通過三輪附加的連續(xù)噬斑純化以篩選CEF細(xì)胞中的非染色病毒病灶而得以分離。隨后,重組病毒感染CEF單層進(jìn)行擴(kuò)增,并且用PCR檢測MVA-hTYR病毒DNA以證實病毒貯存物的遺傳均一性。病毒DNA的Southern印跡檢測證實了MVA-hTYR的遺傳穩(wěn)定性并精確表明重組酪氨酸酶基因和大腸桿菌Lac Z標(biāo)記基因缺失整合到了病毒基因組中缺失II位點重組人酪氨酸酶的有效表達(dá)通過對來自MVA-hTYR感染的CEF細(xì)胞的蛋白裂解液使用兔多克隆抗體(由V.Hearing惠贈并按照J(rèn)imenez,M.,Kameyama,K.,Maloy,L.,Tomita,Y.和Hearing,V. 美國國家科學(xué)院院報(P.N.A.S.USA)85,3830-3834所述使用)或引導(dǎo)抗酪氨酸酶的鼠單克隆抗體(由L.Old惠贈并按照Chen,Y.,Stockert,E.,Tsang,S.,Coplan,K.和Old,L. 美國國家科學(xué)院院報(P.N.A.S.USA)92,8125-8129所述使用)進(jìn)行Western印跡檢測得以證實。
序列表(1)一般資料(i)申請人(A)名稱GSF-Forschungszentrumfuer Umwelt und GesundheitGmbH(B)街道Ingolstaedter Landstr.1,Neuherberg(C)城市Oberschleissheim(E)國家德國(F)郵編(ZIP)85764(ii)發(fā)明名稱重組MVA病毒及其應(yīng)用(iii)系列數(shù)目8(iv)計算機(jī)可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機(jī)IBM兼容PC(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,#1.30版本(EPO)(vi)在先申請資料(A)申請?zhí)朌K 0782/95(B)申請日1995,7,4(2)序列資料1(i)序列特征(A)長度33堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“DNA-引物”(xi)序列描述序列1CAGCAGGGTA CCCTCATCGT ACAGGACGTT CTC 33(2)序列資料2(i)序列特征
(A)長度42堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“DNA-引物”(xi)序列描述序列2CAGCAGCCCG GGTATTCGAT GATTATTTTT AACAAAATAA CA42(2)序列資料3(i)序列特征(A)長度36堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“DNA-引物”(xi)序列描述序列3CAGCAGCTGC AGGAATCATC CATTCCACTG AATAGC 36(2)序列資料4(i)序列特征(A)長度36堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“DNA-引物”(xi)序列描述序列4CAGCAGGCAT GCCGACGAAC AAGGAACTGT AGCAGA 36(2)序列資料5(i)序列特征(A)長度33堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“DNA-引物”(xi)序列描述序列5CAGCAGGTCG ACCCCGACCG CCTTACTGCC GCC 33(2)序列資料6(i)序列特征(A)長度33堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“DNA-引物”(xi)序列描述序列6GGGGGGCTGC AGATGGTAGC GACCGGCGCT CAG 33(2)序列資料7(i)序列特征(A)長度39堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“DNA-引物”(xi)序列描述序列7CAGCAGGGAT CCATGGGTGG CAAGTGGTCA AAAAGTAGT39(2)序列資料8(i)序列特征(A)長度39堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“DNA-引物”(xi)序列描述序列8CAGCAGGGAT CCATGTCAGC AGTTCTTGAA GTACTCCGG39
權(quán)利要求
1.重組MVA病毒,它含有并能表達(dá)HIV nef抗原或抗原決定簇,或者它含有并能表達(dá)人酪氨酸酶(hTyr)抗原或抗原決定簇。
2.權(quán)利要求1的重組MVA病毒,其中的HIV nef基因或hTyr基因受痘苗病毒早期/晚期啟動子P7.5的控制。
3.權(quán)利要求1或2的重組MVA病毒,基本上不含有能在人的細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的病毒。
4.一種真核細(xì)胞,被權(quán)利要求1-3之一的重組MVA病毒感染。
5.一種疫苗,在生理可接受的載體中含有權(quán)利要求1-3之一的重組MVA病毒。
6.權(quán)利要求1-3之一的重組MVA病毒在疫苗制備中的用途。
7.用于免疫活動物體,包括人,的權(quán)利要求1-3之一的重組MVA病毒和/或權(quán)利要求5的疫苗。
8.用于預(yù)防或治療HIV感染或AIDS,或者用于預(yù)防或治療黑色素瘤的權(quán)利要求5所述重組MVA病毒和/或疫苗。
9.權(quán)利要求1-3之一的重組MVA病毒在制備重組HIV nef蛋白或重組hTyr蛋白中的用途。
10.權(quán)利要求1-3之一的重組MVA病毒在回體(ex vivo)基因治療中的用途。
全文摘要
包含并能表達(dá)插入改良安卡拉痘苗病毒(MVA)基因組天然缺失位點的外源基因的重組MVA病毒,以及應(yīng)用這類重組MVA病毒生產(chǎn)多肽,例如抗原或治療劑,和重組病毒以用作疫苗或產(chǎn)生病毒載體用于基因治療。
文檔編號C12N15/54GK1554764SQ20041003671
公開日2004年12月15日 申請日期1996年7月3日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月4日
發(fā)明者格爾德·薩特, 馬里恩·奧爾曼, 沃爾克·厄夫勒, 厄夫勒, 奧爾曼, 格爾德 薩特 申請人:Gsf環(huán)境與健康研究中心有限公司