專利名稱：一種甲狀腺髓過氧化物酶基因外顯子i的基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種先天性甲狀腺功能低下病人的髓過氧化物酶的基因序列，其具有如下的特征，與正常人的對應(yīng)序列相比，其在外顯子1中第9位的核苷酸序列由A變?yōu)镚，這種序列可以用于先天性甲狀腺功能低下病人的篩選和診斷。
背景技術(shù)：
及

發(fā)明內(nèi)容
先天性甲狀腺功能低下是一種比較常見的遺傳性疾病，在人群中的發(fā)病率為1/3000-4000。若不能早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)，可以引起智力低下。中國已經(jīng)通過立法，對所有的新生兒都需進(jìn)行強(qiáng)制性的篩查，以期望早期發(fā)現(xiàn)甲低的患兒。對早期發(fā)現(xiàn)的甲低的新生兒，可以通過補(bǔ)充甲狀腺素而使絕大部分的患兒的智力發(fā)育不受任何影響，可以使患兒過上正常的生活。因此，對先天性甲低患兒的篩選是一種利國利民的舉措。
對出生新生兒的篩選是一種事后的篩選，即在疾病發(fā)生之后的篩選。目前隨著基因檢測技術(shù)，特別是基因芯片技術(shù)的發(fā)展，使得對多種先天性疾病的一次檢測成為可能。而在對各種先天性疾病的檢測過程中，知道所需要檢測的目的基因的變異序列，是一個(gè)關(guān)鍵的必需的步驟。只有在知道變異序列的情況下，才能利用諸如基因芯片等類的技術(shù)對相關(guān)的變異基因及其相對應(yīng)的疾病進(jìn)行檢測。
甲狀腺素是正常發(fā)育所必需的一種激素，其在人體合成的部位在甲狀腺。甲狀腺素的合成是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，參與該過程的基因有數(shù)十個(gè)之多。其生成和滅活受到嚴(yán)格的控制。
甲狀腺髓過氧化物酶基因位于人染色體2的2P24-25的位置，共有17個(gè)外顯子，整個(gè)序列約分布在150kb的片段上。甲狀腺髓過氧化物酶是一種膜結(jié)合蛋白，負(fù)責(zé)對甲狀腺球蛋白中的酪氨酸的碘化和偶聯(lián)，其是有933個(gè)氨基酸的糖蛋白。目前已經(jīng)報(bào)道了幾乎涉及每一個(gè)外顯子的編碼序列的變異。編碼序列的變異可以使甲狀腺髓過氧化物酶的翻譯缺失或活性喪失或缺如，而使甲狀腺素的合成受到阻礙。
甲狀腺髓過氧化物酶外顯子1參與髓過氧化物酶轉(zhuǎn)錄的控制，其編碼基因序列的變異，可以引起甲狀腺髓過氧化物酶的合成缺如，從而導(dǎo)致甲狀腺素合成的障礙。本發(fā)明首次報(bào)道了一種發(fā)生在先天性甲低病人甲狀腺髓過氧化物酶外顯子1中的核苷酸序列的變異。在所檢測的57份標(biāo)本中，總共有4份標(biāo)本出現(xiàn)了第9位核苷酸由A變?yōu)镚的變異。這種變異引起了甲狀腺髓過氧化物酶表達(dá)的變異，而導(dǎo)致先天性甲狀腺功能低下的發(fā)生。
經(jīng)甲狀腺素、甲狀腺素促激素測定和甲狀腺同位素掃描證實(shí)的甲狀腺功能低下的病人，平時(shí)體檢化驗(yàn)時(shí)收集到的血凝塊，經(jīng)病人或監(jiān)護(hù)人同意，用來分離染色體DNA，進(jìn)行甲狀腺髓過氧化物酶編碼基因的研究。
1.染色體DNA的分離將1毫升血液所獲得的血凝塊中加入1/2體積的10毫摩爾三羥氨基甲烷鹽酸(pH8.0)，1毫摩爾的乙二胺四乙酸(pH8.0)和0.1％的十二烷基磺酸鈉，和蛋白酶K，使其終濃度微400微克/毫升，在攝氏55度消化16小時(shí)。在消化4小時(shí)后，再加入一次等量的蛋白酶K。然后加入1/10體積的3摩爾的醋酸鉀，混勻，再分別加入等體積的酚，酚/氯仿和氯仿各抽提一次。收取上清，加入2倍體積的無水乙醇，置零下攝氏20度16小時(shí)，于16000轉(zhuǎn)/分鐘離心，收集沉淀，并用70％的酒精洗沉淀一次。棄上清，將沉淀溶于100微升10毫摩爾三羥氨基甲烷鹽酸(pH8.0)，1毫摩爾的乙二胺四乙酸(pH8.0)中。
2.根據(jù)已知的正常人的甲狀腺髓過氧化酶外顯子I基因序列，分別設(shè)計(jì)了只與外顯子互補(bǔ)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的引物序列15’agg caa tta a gg cgc cca t3’序列25’ttt ttt cct ctt ctc agc caa 3’并根據(jù)外顯子I周圍的內(nèi)含子序列，設(shè)計(jì)了只與內(nèi)含子互補(bǔ)的PCR引物序列35’ATCCAAGCGCAGAGTCAGTT3’序列45’CCCAAATTACAGCCACTCTT3’3.甲狀腺功能低下染色體標(biāo)本的擴(kuò)增將所獲得的臨床已經(jīng)明確的58份甲狀腺功能低下的染色體DNA用序列1和序列2組成的引物對進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的條件為攝氏94度30秒，52度30秒，72度30秒，45個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)在72度延伸5分鐘。所獲得的標(biāo)本經(jīng)8％的聚丙稀酰胺電泳，發(fā)現(xiàn)除4份標(biāo)本外，其余均有82堿基對的目標(biāo)DNA片段。
4.可能有變異的DNA片段的擴(kuò)增將4份用序列1和序列2構(gòu)成的引物對不能擴(kuò)增的染色體DNA，分別用序列1和序列4，序列3和序列2組成的引物對進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的條件為攝氏94度30秒，52度30秒，72度30秒，45個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)在72度延伸5分鐘。所獲得的標(biāo)本經(jīng)8％的聚丙稀酰胺電泳，發(fā)現(xiàn)序列3和序列2組成的引物對可以擴(kuò)增對應(yīng)的標(biāo)本而獲得對應(yīng)的目標(biāo)DNA，而序列1和序列4構(gòu)成的引物對不能擴(kuò)增相應(yīng)的標(biāo)本而獲得相應(yīng)的目標(biāo)DNA片段。說明在序列1所在的位置可能有核苷酸突變。
5.將序列3和序列2所構(gòu)成的引物對擴(kuò)增所獲得的PCR產(chǎn)物(序列5)，經(jīng)純化后，用序列3作為引物，并以其余甲狀腺功能低下的病人和甲狀腺功能正常的人的染色體DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物為對照(序列6)，測序獲得如下序列序列55’aggcaattga ggcgcccatt tcagaagagt tacagccgtgaaaattactc agcagtgcagttggctgaga agaggaaaaa a 3’序列65’aggcaattaa ggcgcccatt tcagaagagt tacagccgtgaaaattactc agcagtgcag ttggctgaga agaggaaaaa a 3’與正常人相比，所檢測的4例甲狀腺功能低下的病人的甲狀腺髓過氧化物酶的外顯子1的第9位核苷酸由A→G。
6.利用所測定的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，可以用于變異的甲狀腺髓過氧化物酶基因外顯子I的檢測，使用這種PCR引物，正常的標(biāo)本無擴(kuò)增產(chǎn)物，只有變異的基因序列測能得到擴(kuò)增。
序列75’agg caa ttg a gg cgc cca t3’序列7和序列2組成PCR引物對，對標(biāo)本進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的條件為攝氏94度30秒，52度30秒，72度30秒，45個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)在72度延伸5分鐘。所獲得的標(biāo)本經(jīng)8％的聚丙稀酰胺電泳，發(fā)現(xiàn)除4份變異的標(biāo)本有82堿基對的目標(biāo)DNA片段外，其余均為陰性。
7.利用所獲得的核苷酸序列合成寡核苷酸探針，序列同序列7，用同位素磷32標(biāo)記，將制備的病人的染色體DNA用DdeI進(jìn)行限制性酶切，所獲得的片段進(jìn)行瓊脂糖電泳，轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，用同位素標(biāo)記的探針雜交，經(jīng)同位素顯色，只有在有核苷酸序列變異的標(biāo)本中出現(xiàn)陽性帶。
權(quán)利要求
1.一種先天性甲狀腺功能低下病人的髓過氧化物酶的基因序列，其具有如下的特征，與正常人的對應(yīng)序列相比，其在外顯子1中第9位的核苷酸序列由A變?yōu)镚。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其可以用來設(shè)計(jì)聚合酶鏈反應(yīng)的引物，用來特異性擴(kuò)增有變異的基因序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其可以用來設(shè)計(jì)核苷酸探針，用來通過雜交來檢測有變異的基因序列。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種先天性甲狀腺功能低下病人的髓過氧化物酶的基因序列，其具有如下的特征，與正常人的對應(yīng)序列相比，其在外顯子1中第9位的核苷酸序列由A變?yōu)镚，這種序列可以用于先天性甲狀腺功能低下病人的篩選和診斷。
文檔編號C12N15/11GK1654649SQ20041003944
公開日2005年8月17日 申請日期2004年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月13日
發(fā)明者劉吉榮, 張霆, 戴耀華, 李莉, 張帥民, 劉愛華, 于娟娟, 陳功, 龐麗華, 滕紅紅, 張玉敏, 李淑華, 裘蕾 申請人:首都兒科研究所