專利名稱：煙草疫霉的產(chǎn)孢培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明特別涉及一種煙草疫霉在培養(yǎng)基上培養(yǎng)、產(chǎn)孢以及孢子囊釋放的方法。
背景技術(shù)：
煙草疫霉是重要的病原菌，煙草黑脛病是毀滅性病害之一，寄主范圍廣泛，在我國寄生于煙草、大蔥、顛茄、辣椒、柚、甜橙、黃瓜、海島棉、番茄、蘋果、芝麻等中，使作物在其根莖部產(chǎn)生病害。
煙草黑脛病(tobacco black shank)是由煙草疫霉引起的，煙草疫霉以菌絲體與厚壁孢子隨病株殘?bào)w在土壤或堆肥中越冬，成為次年的初浸染源。病株上產(chǎn)生的孢子囊或釋放出來的游動(dòng)孢子通過地面流水或風(fēng)雨吹濺進(jìn)行再侵染，侵染主要部位是土表及土面以下5cm深的莖基部。
病原菌是研究其引起的病害、生理小種和生物防治的重要內(nèi)容。而國內(nèi)外對(duì)煙草疫霉病原菌的產(chǎn)孢方法眾多，標(biāo)準(zhǔn)不一。在人工培養(yǎng)條件下，煙草疫霉在相當(dāng)長時(shí)間內(nèi)不產(chǎn)生孢子囊或很少產(chǎn)生，即使產(chǎn)生孢子囊，一般也不集中釋放游動(dòng)孢子。而游動(dòng)孢子又是重要的侵染形式，因此就影響該病原菌的生理?；?、生防測定以及病害等研究工作。
對(duì)于煙草疫霉孢子囊的形成和游動(dòng)孢子的釋放研究，目前采用在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌絲，再加入0.1％KNO3溶液浸潤產(chǎn)孢的方法。Gooding雖然從燕麥培養(yǎng)基上刮取菌絲加0.1％KNO3浸潤能產(chǎn)生大量孢子囊，其游動(dòng)孢子的濃度越大，游動(dòng)的時(shí)間越長，但產(chǎn)孢方法并不穩(wěn)定，重復(fù)性低。劉延榮等在1987年《山東農(nóng)業(yè)科學(xué)》中的關(guān)于“煙草黑脛病菌孢子囊形成和游動(dòng)孢子釋放條件的研究”報(bào)道了在人工培養(yǎng)條件下，用低濃度的無機(jī)鹽溶液，如33％Hoagland’s營養(yǎng)液、0.1％KNO3或蒸餾水浸泡生長旺盛的菌絲，可促使較快形成孢子囊，游動(dòng)孢子的濃度對(duì)游動(dòng)孢子的游動(dòng)性影響不大；楊建卿等在2001年《植物保護(hù)》第27(4)期中關(guān)于“煙草疫霉菌的培養(yǎng)及大量產(chǎn)生游動(dòng)孢子方法的研究”報(bào)道了在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌絲，再用加土壤浸出液，可在3天內(nèi)產(chǎn)生大量游動(dòng)孢子囊，低溫處理后再培養(yǎng)24小時(shí)，可產(chǎn)生大量游動(dòng)孢子，但這些方法產(chǎn)孢不穩(wěn)定，而且孢子囊較小，釋放率不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，是提供一種煙草疫霉的培養(yǎng)和產(chǎn)孢方法。它具有產(chǎn)孢穩(wěn)定，孢子囊較大，釋放率高的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的分離煙草疫霉，選擇芝麻培養(yǎng)基或黑麥培養(yǎng)基為煙草疫霉的孢子囊培養(yǎng)基，在芝麻培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基平板上接種活化的煙草疫霉，重復(fù)數(shù)次，28℃溫箱中培養(yǎng)14天后，刮取菌絲，用0.1％KNO3浸潤，5-8天后測孢子囊數(shù)量、孢子囊大小，孢子囊在6-11℃下處理15-25min釋放游動(dòng)孢子，測孢子囊的釋放率。
由于煙草疫霉的致病力強(qiáng)弱與產(chǎn)孢能力，孢子囊大小，釋放率等三種因素緊密相關(guān)，芝麻是煙草疫霉的自然寄主，芝麻做成的培養(yǎng)基中含有煙草疫霉生長、產(chǎn)孢的物質(zhì)，有利于其生長、產(chǎn)孢，而且芝麻還廣泛用于低等真菌孢子的誘集研究中。因此芝麻培養(yǎng)基上培養(yǎng)煙草疫霉，產(chǎn)孢子囊能力強(qiáng)，孢子囊大，釋放率高，游動(dòng)孢子活動(dòng)時(shí)間長。在盆栽試驗(yàn)以及大田試驗(yàn)中，培養(yǎng)病原菌煙草疫霉采用芝麻培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)孢較好。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明不僅限于這些例子。
1.分離煙草疫霉將煙草種子于28℃下浸泡1天，再鋪在濕潤濾紙上28℃下催芽，3天后播于裝有濕潤土的瓷盤里，上面再覆一層細(xì)沙，20-26℃溫室中光照培養(yǎng)，20天后移栽子裝有沙壤土的塑料缽中，每缽1株，塑料缽的體積為0.21dm3，每10天施一次Hoaland’s全營養(yǎng)液，10ml/缽。
煙草疫霉的分離采用髓部碟片分離法，取典型煙草黑脛病病株莖桿，洗凈拭干，醮95％的酒精，燒干，重復(fù)3次，用滅菌解剖刀剖開，再用滅菌的鑷子夾取碟片置于燕麥培養(yǎng)基平板上28℃培養(yǎng)。3后純化，保存于燕麥培養(yǎng)基斜面上。
調(diào)整孢子囊濃度為1×104個(gè)/ml，8℃下處理20min，稀釋10倍后加入1％的葡萄糖，注射8-10葉期煙苗莖基部以上1cm處髓部，每株0.1ml接種菌液，對(duì)照注射無菌水。再從接種發(fā)病的植株上分離煙草疫霉，4℃冰箱中保存待用，以后每6個(gè)月回接一次煙草，以恢復(fù)致病力。
2.選擇生長培養(yǎng)基選擇生長培養(yǎng)基取燕麥培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)3d的煙草疫霉邊緣菌絲塊，菌塊直徑0.4cm，分別接種于直徑為9cm的PDA、PSA、燕麥培養(yǎng)基、芝麻培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基平板中心上，每皿培養(yǎng)基量為15ml，28℃溫箱中培養(yǎng)，3次重復(fù)。記錄菌絲在平板上生長的時(shí)間和測菌落生長量，菌落生長量的測定方法為，采用垂直十字交叉法測量菌落直徑，以測得兩值的平均值減去菌塊直徑0.4cm，所得差值除以2即為菌落生長量。計(jì)算平均每天生長量。煙草疫霉在不同培養(yǎng)基上的生長情況，見表1。
表1 煙草疫霉在不同培養(yǎng)基上的生長情況Table 1 The growth speeds of Phytophthora parasitica var.nicotianae on thedifferent culture medium
培養(yǎng)基種類 平均每天菌落生長量(cm) 差異顯著性 菌絲Significant differenceCulture Average growth speeds/d(cm)0.050.01 HyphaPDA 0.46 e D 稀薄rarityPSA 0.52 d D 稀薄rarity燕麥培養(yǎng)基 0.86 b B 豐厚thickOats culture mediums芝麻培養(yǎng)基 1.10 a A 豐厚thickSesame culture medium黑麥培養(yǎng)基 0.78 c C 豐厚thickRye culture medium從表1可以看出，煙草疫霉在芝麻培養(yǎng)基上生長最快，平均每天菌落生長量達(dá)1.10cm，而且菌絲豐厚。PDA、PSA上生長最差，平均每天菌落生長量僅為0.46、0.52cm，而且菌絲稀薄，這兩種培養(yǎng)基不適于培養(yǎng)煙草疫霉，在α＝0.05和α＝0.01水平上，芝麻培養(yǎng)基上菌落生長量和燕麥培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基等相比，都呈顯著差異。
因此，選擇芝麻培養(yǎng)基和黑麥培養(yǎng)基為煙草疫霉的產(chǎn)孢培養(yǎng)基。
3.選擇煙草疫霉的產(chǎn)孢方法煙草疫霉產(chǎn)孢方法(1)直接培養(yǎng)產(chǎn)孢分別在等量15ml的芝麻培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基平板以及含有煙莖皮汁液的燕麥培養(yǎng)基、含有0.1％KNO3的燕麥培養(yǎng)基、含有0.1％Ca(NO3)2的燕麥培養(yǎng)基平板上接種活化的煙草疫霉，3次重復(fù)，28℃溫箱中培養(yǎng)，21天后檢測產(chǎn)孢情況。加入煙汁、Ca(NO3)2的燕麥培養(yǎng)基、芝麻培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基上菌絲生長良好。
(2).培養(yǎng)后誘導(dǎo)處理產(chǎn)孢分別在等量15ml的芝麻培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基平板上接種活化的煙草疫霉，28℃溫箱中培養(yǎng)14天后，①在芝麻培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基平板上加入滅菌水，培養(yǎng)基平板培養(yǎng)；②在燕麥培養(yǎng)基平板上加入0.1％KNO3、0.05％KNO3、0.1％Ca(NO3)2溶液、蒸餾水、煙根際土壤浸出過濾液、滅菌水，燕麥培養(yǎng)基平板光照2小時(shí)后繼續(xù)培養(yǎng)，4℃處理8h后繼續(xù)培養(yǎng)，劃破燕麥培養(yǎng)基平板后繼續(xù)培養(yǎng)；③在芝麻培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基平板上分別加入0.1％KNO3、滅菌水，分別刮取燕麥培養(yǎng)基、芝麻培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基平板上的菌絲加入0.1％KNO3浸潤，培養(yǎng)基平板培養(yǎng)。3次重復(fù)，6天后檢測產(chǎn)孢情況。
在培養(yǎng)基上培養(yǎng)煙草疫霉14天后，在芝麻培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基平板上加入滅菌水，都未產(chǎn)生孢子囊。燕麥培養(yǎng)基平板加入煙根際土壤浸出過濾液的培養(yǎng)基上，產(chǎn)生了孢子囊，但燕麥培養(yǎng)基平板加入煙根際土壤浸出過濾液產(chǎn)孢后污染嚴(yán)重，不能采用。芝麻培養(yǎng)基平板和黑麥培養(yǎng)基平板上加入0.1％的KNO3溶液后，都產(chǎn)生了孢子囊。
(3)不同培養(yǎng)基產(chǎn)孢量及孢子囊釋放率比較分別在15ml燕麥培養(yǎng)基、芝麻培養(yǎng)基和黑麥培養(yǎng)基平板上接種活化的煙草疫霉，重復(fù)數(shù)次，28℃溫箱中培養(yǎng)14天后，刮取菌絲，用0.1％KNO3浸潤，5-8天后測孢子囊數(shù)量、孢子囊大小及釋放率。三種培養(yǎng)基產(chǎn)孢量、孢子囊大小及釋放率比較，見表2。
表2三種培養(yǎng)基產(chǎn)孢量、孢子囊大小及釋放率比較Table 2 Comparing the producing zoosporangia quantity，size and release rate ofzoosporangia培養(yǎng)基種類 平均產(chǎn)孢量(×104個(gè)/cm2)差異顯著性 孢子囊大小(μm) 釋放率％Medium Average producing Significant differenceSize of zoosporangiaRelease ratezoosporangia quantity 0.05 0.01燕麥培養(yǎng)基 2.15 b B 26.84×23.66 28.0Oats eulture mediums芝麻培養(yǎng)基 2.52 a A 8.98×30.19 43.0Sesame culture medium黑麥培養(yǎng)基 2.07 b B 29.07×25.01 32.1Rye culture medium從三種培養(yǎng)基產(chǎn)孢囊量比較可以看出，在芝麻培養(yǎng)基上產(chǎn)孢能力最強(qiáng)，平均為2.52×104個(gè)孢子囊/cm2，而在燕麥培養(yǎng)基和黑麥培養(yǎng)基上分別為2.15×104個(gè)孢子囊/cm2和2.07×104個(gè)孢子囊/cm2，在α＝0.05和α＝0.01水平上，芝麻培養(yǎng)基上平均產(chǎn)孢量和燕麥培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基相比，都呈顯著差異。從孢子囊大小來看，芝麻培養(yǎng)基上所產(chǎn)孢子囊最大，為38.98×30.19μm，而燕麥培養(yǎng)基和黑麥培養(yǎng)基上所產(chǎn)孢子囊較小，大小為26.84×23.66μm和29.07×25.01μm。從釋放率來看，芝麻培養(yǎng)基上所產(chǎn)孢子囊釋放率最高，為43.0％，而其他兩種分別為28.0％和32.1％。
結(jié)論芝麻培養(yǎng)基的產(chǎn)孢能力、釋放率都比燕麥培養(yǎng)基高，釋放率高出15.0個(gè)百分點(diǎn)，而且孢子囊較大。雖然芝麻培養(yǎng)基和黑麥培養(yǎng)基都可用來培養(yǎng)煙草疫霉產(chǎn)孢，但芝麻培養(yǎng)基產(chǎn)孢能力強(qiáng)，所產(chǎn)孢子囊較大，釋放率也較高。
權(quán)利要求
一種煙草疫霉的產(chǎn)孢培養(yǎng)方法，其特征在于分離煙草疫霉，選擇芝麻培養(yǎng)基或黑麥培養(yǎng)基為煙草疫霉的孢子囊培養(yǎng)基，在芝麻培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基平板上接種活化的煙草疫霉，重復(fù)數(shù)次，28℃溫箱中培養(yǎng)14天后，刮取菌絲，用0.1％KNO3浸潤，5-8天后測孢子囊數(shù)量、孢子囊大小，孢子囊在6-11℃下處理15-25min釋放游動(dòng)孢子，測孢子囊的釋放率。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種煙草疫霉的產(chǎn)孢培養(yǎng)方法，其特征在于分離煙草疫霉，選擇芝麻培養(yǎng)基或黑麥培養(yǎng)基為煙草疫霉的孢子囊培養(yǎng)基，在芝麻培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基平板上接種活化的煙草疫霉，重復(fù)數(shù)次，28℃溫箱中培養(yǎng)14天后，刮取菌絲，用0.1％KNO
文檔編號(hào)C12N1/14GK1614002SQ20041004093
公開日2005年5月11日 申請(qǐng)日期2004年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月26日
發(fā)明者王萬能, 全學(xué)軍, 陸天健 申請(qǐng)人:重慶工學(xué)院