專利名稱：番茄潰瘍病菌的檢測基因及其檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明番茄潰瘍病菌的檢測基因及其檢測試劑盒，屬于植物病原菌的檢測領(lǐng)域，尤其是對(duì)番茄潰瘍病菌Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis(Cmm)的檢測。專用于番茄潰瘍病菌的田間預(yù)防及海關(guān)植物檢疫的Cmm的快速檢測。
二、技術(shù)背景番茄潰瘍病是我國的三類危險(xiǎn)性病害。1909年首次由Erwin F.Smith在美國的密歇根州發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在北美洲、南美洲、非洲、澳大利亞、新西蘭、亞洲，中國的新疆和北京地區(qū)均報(bào)道有發(fā)生，除危害番茄外，還可以危害辣椒、龍葵等茄科植物。番茄潰瘍病菌屬于革蘭氏陽性菌，可侵染番茄及其他茄科植物的種子、根、莖桿或子葉。番茄潰瘍病菌存在兩種侵染方式一種是通過表面侵染，可引起葉片邊緣的壞死和果實(shí)斑。在田間葉片邊緣壞死癥狀最普遍。果實(shí)斑點(diǎn)俗稱鳥眼斑，在相對(duì)溫度高的條件下病情會(huì)擴(kuò)展，病斑最初為白色，白斑逐漸發(fā)展形成一個(gè)壞死中心，一般直徑在3-6mm，中心有褐色凸起。鳥眼斑作為番茄潰瘍病的一個(gè)典型癥狀常用來鑒定該病害。此外還可以通過維管束侵染，引起系統(tǒng)性病害。病植株常表現(xiàn)為萎蔫癥狀，維管束組織變褐，髓部形成空腔。最近研究發(fā)現(xiàn)，在花期兩天后，番茄潰瘍病菌還可以通過番茄花侵染。每年此病害能在世界范圍內(nèi)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。
到目前為止該病害還沒有特別有效的化學(xué)藥劑或抗性品種來防治此病害。由于Cmm可以借種子傳播，目前各國主要通過種子檢疫來控制此病害。全世界的學(xué)者都認(rèn)為，有必要建立一種準(zhǔn)確率和靈敏度高的快速檢測方法來檢測Cmm，尤其對(duì)無癥狀植株和種子的檢測，提前預(yù)防病菌的擴(kuò)散，建立預(yù)警系統(tǒng)，及早撲滅病菌，提出防治策略。番茄潰瘍病菌在我國只有局部地區(qū)發(fā)生，因此我國要嚴(yán)格限制或禁止從發(fā)生番茄潰瘍病害的國家或地區(qū)進(jìn)口或調(diào)運(yùn)番茄種子、果實(shí)和植株。從其他國家進(jìn)口的種子和果實(shí)必須進(jìn)行有關(guān)的檢驗(yàn)。目前Cmm具體檢驗(yàn)手段主要是(1)癥狀觀察，但只能作為初步檢驗(yàn)，做出初步判斷；(2)分離、純化培養(yǎng)病原菌，進(jìn)行革藍(lán)氏、鞭毛染色和生理生化反應(yīng)特性測定。對(duì)于Cmm還可以使用D2和SCM兩種選擇性培養(yǎng)基作為分離培養(yǎng)基(參考文獻(xiàn))。(3)利用BIOLOG鑒定系統(tǒng)來檢測。BIOLOG鑒定系統(tǒng)是一種快速、相對(duì)準(zhǔn)確且標(biāo)準(zhǔn)化程度高的鑒定系統(tǒng)，主要根據(jù)細(xì)菌鑒定對(duì)95種碳源的利用情況，將結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后并與數(shù)據(jù)庫內(nèi)已知的細(xì)菌比較，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測菌的快速鑒定及檢測。但此系統(tǒng)對(duì)Cmm來說，只能在種水平上進(jìn)行鑒定，而且還需對(duì)病原菌先進(jìn)行分離。(4)血清學(xué)方法酶聯(lián)免疫方法和多克隆抗體免疫熒光法。有人在實(shí)驗(yàn)中制備幾種來源的的單克隆抗體，進(jìn)行ELISA檢測。結(jié)果表明除兩個(gè)無致病性菌株NCPPB254和NCPPB861外與所有的Cmm菌株都發(fā)生了反應(yīng)。此外還與所有的C.michiganensis亞種和棒形細(xì)菌中的一些腐生菌也發(fā)生了反應(yīng)。由于C.michiganensis不同亞種的抗原決定位點(diǎn)都普遍相似，造成交叉反應(yīng)非常明顯。ELISA只能檢測到104CFU純培養(yǎng)菌體，且只能從表現(xiàn)癥狀的植物組織中檢測到Cmm。事實(shí)上用于檢測Cmm篩選出的單克隆或多克隆抗體在特異性和靈敏度上都存在缺陷，十分影響其陽性鑒定。
最近的一個(gè)可選擇的檢測方法是分子生物學(xué)方法。在國外已有許多較好的例子應(yīng)用。德國曾報(bào)道對(duì)不同的Cmm菌株的質(zhì)粒作標(biāo)記，分析發(fā)現(xiàn)他們都存在一個(gè)共同的致病基因CelA，該基因分別存在兩個(gè)質(zhì)粒上PCM1和PCM2。在研究過程中他們還發(fā)現(xiàn)由CelA基因編碼的一段Pat-1區(qū)域，對(duì)Cmm菌株具有特異鑒別性，然后根據(jù)此片段的序列設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物，可以特異的鑒別所有的Cmm菌株，而其它細(xì)菌均無反應(yīng)。(參考)眾所周知，危險(xiǎn)性植物病原菌的檢測、鑒定方法要求靈敏、特異、快速。目前，病原菌檢測技術(shù)繁多，各國主要采用選擇培養(yǎng)基法、凝集和免疫熒光檢測及血清檢測等方法進(jìn)行檢疫控制病害的傳播。由于這些檢測鑒定方法靈敏性低、特異性差、費(fèi)時(shí)不穩(wěn)定，很難在成功檢測到病菌，不適宜廣泛應(yīng)用。
隨著近年來我國口岸進(jìn)口番茄果實(shí)、種子的增多以及國內(nèi)蔬菜的大量調(diào)運(yùn)，勢必增加該病菌由疫區(qū)傳入非疫區(qū)的危險(xiǎn)性，但我國口岸缺乏必要的對(duì)該病菌的檢測方法。病害防治、預(yù)測、預(yù)報(bào)及植物檢疫需要有準(zhǔn)確快速的病菌檢測技術(shù)，尤其是需要我國擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的檢測方法，從而可以將之投入到商業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用中。目前在這一領(lǐng)域還沒有一種靈敏、特異性強(qiáng)、簡便快速檢測Cmm方法所屬技術(shù)領(lǐng)域的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有的植物病原菌檢測方靈敏性低、特異性差、費(fèi)時(shí)不穩(wěn)定的不足，提供番茄潰瘍病菌的檢測基因及其檢測試劑盒，克隆Cmm的一段位于16S-23SrDNA間的ITS序列，并以此設(shè)計(jì)出一對(duì)Cmm的特異性引物和其檢測試劑盒，使用該試劑盒達(dá)到對(duì)樣本中Cmm的快速準(zhǔn)確檢測。
技術(shù)方案番茄潰瘍病菌(Cmm)的檢測基因，其特征在于，Cmm的ITS全序列為516bp1 AGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGAT CACCTCCTTTCTAAGGAGCA61 TGTGCACCTCTCCTCTGTATACAGGGAGATCAAGGGTGCC AAGTCACGCGTCAGGCGTCT121 GTTCTGGCGGTGGCGCTCATGGGTGGAACATTGACATTGA TGCCGGCTGATGTGTCGGGC181 TGCTAGTACGCCTCCTTGTGGGGTGGGAACGTGGTCTGGT GTGTCGAGGGCATGTTGCAC241 GCTGTTGGGTCCTGAGGGACCGGGCCGCACCTTTTGGGTG TGTCTGGTTTCTTGTCGGAC301 CCTTTCCGTCGTCCTGTTGTGGATGGTGGTGGGGTACCGC CCGTATATTGAGAACTACAC241 GCTGTTGGGTCCTGAGGGACCGGGCCGCACCTTTTGGGTG TGTCTGGTTTCTTGTCGGAC301 CCTTTCCGTCGTCCTGTTGTGGATGGTGGTGGGGTACCGC CCGTATATTGAGAACTACAC361 AGTGGACGCGAGCATCTTAGATTCACCGGTTTTCCGGTGG ATCACAAAGATCTATTTATA421 GATCATTGGTCAATTCTGTCTCCCTTCGGGGAGGCGAAAC GATTCAATCTCATGTGATTT481 CAAGATTCTAAGGGCAAACGGTGGATGCCTTGGCAC上述番茄潰瘍病菌(Cmm)的檢測基因，其特征在于，其檢測引物序列為CmmF15‘-CCTTTCCGTCGTCCTGTTGT-3’CmmR25‘-TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3’上述番茄潰瘍病菌(Cmm)的檢測基因的檢測試劑盒，包括管號(hào) 名稱濃度1 超純水 99％～100％2 PCR反應(yīng)緩沖液9×～10×3 dNTPs9mM～10mM4 Mg2+20mM～25mM5 陽性對(duì)照DNA 95ng/μl～100ng/μl6 DNA marker 2Kb7 上樣緩沖液 5×～6×8 正向引物(CmmF1) 20μM～25μM9 反向引物(CmmR2) 20μM～25μM使用該試劑盒對(duì)參試細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Cmm產(chǎn)生分子量為425bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
有益效果本發(fā)明番茄潰瘍病菌的檢測基因及其檢測試劑盒，涉及一種檢測危險(xiǎn)性植物病原菌的分子技術(shù)，尤其是能快速、簡便、準(zhǔn)確的檢測病原菌的試劑盒，在36h內(nèi)就可以完成檢測。
本發(fā)明提供了一種依賴PCR的分子檢測試劑盒，克服現(xiàn)有的植物病原菌檢測方靈敏性低、特異性差、費(fèi)時(shí)不穩(wěn)定的不足該試劑盒能快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測到病原菌，并直接可從植物種子、組織中檢測病原菌。大大簡化了檢測程序，提高了我國口岸的檢疫水平，同時(shí)為病害防治策略的制定提供了依據(jù)。
通過對(duì)番茄潰瘍病菌的特異性檢測，引物CmmF1-CmmR2和優(yōu)化的PCR條件對(duì)目標(biāo)菌和其他44個(gè)供試菌株進(jìn)行特異性擴(kuò)增，只有目標(biāo)菌株擴(kuò)增得到了一段長425bp的PCR產(chǎn)物，其他三個(gè)致病變種和腐生菌等無擴(kuò)增產(chǎn)物。本檢測試劑盒的使用，引物CmmF1/CmmR2可以穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增Cmm得到分子量為425bp的特異性產(chǎn)物，可以特異的檢測目標(biāo)菌。
通過靈敏度的檢測，利用不同濃度的Cla模板DNA(10ng-1pg)進(jìn)行靈敏性檢測，Cff最低檢出量是50pg純DNA或3×102CFU/ml細(xì)胞。
通過對(duì)大豆植株、蕃茄植株種子、海關(guān)進(jìn)口的Cmm其它寄主種子等的檢測，準(zhǔn)確穩(wěn)定地電泳檢測到目標(biāo)菌425bp的清晰產(chǎn)物(呈陽性反應(yīng))。
四

圖1是本試劑盒的檢測原理圖。
圖2是通用引物U1/U2對(duì)16個(gè)測序棒形細(xì)菌菌株的擴(kuò)增結(jié)果1-16依次代表2607、6165、2566、2594、2632、3496、2626、7221、MH、1369、3298、2550、1373、1372、1371、1370圖3是引物CmmF1/引物CmmR2對(duì)44個(gè)供試菌的擴(kuò)增結(jié)果電泳圖。
泳道序列(上排1-25)2632、1349、2584、20135、6887、2594、2566、15828、15830、15831、49174、19096、Marker2Kb DNA ladder、1370、1371、1372、1373、2550、BR、T30、Pn-2、A6、JM101、Ga、Ck(下排1-25)5833、6162、6163、6164、6165、10002T、2607、1483、9667T、MH、2621、1369、Marker2Kb DNA ladder、1370、1371、1372、1373、2550、3298、9666T、7221、2574、Ta-10、2626、3496圖4是目標(biāo)菌的靈敏性檢測Marker2Kb DNA ladder；10ng，9ng，8ng，7ng，6ng，5ng，4ng，3ng，2ng，1ng，100pg，50pg，10pg，5pg，1pg，0.1pg
五具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1Cmm的特異性引物CmmF1-CmmR2的PCR擴(kuò)增。通過原核生物ITS通用引物U1/U2(5’-GTGGATCACCTCCTTC-3’；5’-TTCGCTCGCCCTAC-3’)，分別對(duì)Cmm及其它相關(guān)細(xì)菌和對(duì)照細(xì)菌的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均得到了一條長度為700bp左右的PCR產(chǎn)物(圖1)。這些細(xì)菌包括萎蔫短小桿菌萎蔫致病變種Curtobacterium flaccumfaciens pv.flaccumfaciens(ICMP2584)，萎蔫短小桿菌甜菜致病變種Cur.f.pv.betae(ICMP2594)，萎蔫短小桿菌奧氏致病變種Cur.f.pv.oortii(ICMP 2632)，萎蔫短小桿菌一品紅致病變種Cur.f.pv.poinsettiae(ICMP2566)；密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞種Clavibacter michiganensis subsp.Michiganensis(ICMP 2550，JCM1370、1371、1372、1373)；帶化紅球菌Rhodococcusfascians(JCM6165)；密執(zhí)安棒形桿菌內(nèi)布拉斯亞種Cl.michiganensis subsp.nebraskensis(ATCC3298)；密執(zhí)安棒形桿菌詭譎亞種Cl.michiganensis subsp.insidisus(JCM1369)；密執(zhí)安棒形桿菌花葉亞種Cl.michiganensis subsp.tesselarius(ATCC7221)；密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種Cl.michiganensis subsp.sepedonicus(JCM1483)；美國冬青節(jié)桿菌Arthobacter ilicis(ICMP2607)；小麥棒形桿菌Cl.tritici(ICMP2626)。
將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，并連接到PUC-T載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM110感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行測序，獲得所有的參試菌株的ITS序列。其中Cmm的ITS全序列(SEQ ID NO.1)為(516bp)1 AGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGGAGCA61 TGTGCACCTCTCCTCTGTATACAGGGAGATCAAGGGTGCCAAGTCACGCGTCAGGCGTCT121 GTTCTGGCGGTGGCGCTCATGGGTGGAACATTGACATTGATGCCGGCTGATGTGTCGGGC181 TGCTAGTACGCCTCCTTGTGGGGTGGGAACGTGGTCTGGTGTGTCGAGGGCATGTTGCAC241 GCTGTTGGGTCCTGAGGGACCGGGCCGCACCTTTTGGGTGTGTCTGGTTTCTTGTCGGAC301 CCTTTCCGTCGTCCTGTTGTGGATGGTGGTGGGGTACCGCCCGTATATTGAGAACTACAC361 AGTGGACGCGAGCATCTTAGATTCACCGGTTTTCCGGTGGATCACAAAGATCTATTTATA421 GATCATTGGTCAATTCTGTCTCCCTTCGGGGAGGCGAAACGATTCAATCTCATGTGATTT481 CAAGATTCTAAGGGCAAACGGTGGATGCCTTGGCAC應(yīng)用分子生物學(xué)軟件，將所得序列及數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道序列進(jìn)行同源性比較，設(shè)計(jì)出以下Cmm引物序列CmmF1 5‘-CCTTTCCGTCGTCCTGTTGT-3’CmmR2 5‘-TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3’。
設(shè)計(jì)番茄潰瘍病菌(Cmm)檢測基因的檢測試劑盒，包括
管號(hào) 名稱 濃度1 超純水99％～100％2 PCR反應(yīng)緩沖液 9×～10×3 dNTPs 9mM～10mM4 Mg2+20mM～25mM5 陽性對(duì)照DNA 95ng/μl～100ng/μl6 DNA marker2Kb7 上樣緩沖液5×～6×8 正向引物(CmmF1) 20μM～25μM9 反向引物(CmmR2) 20μM～25μM使用本發(fā)明的試劑盒配方分別對(duì)Cmm和其它39個(gè)參試菌株的提取的Cmm的DNA和純培養(yǎng)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
反應(yīng)組成(25μl體系)采用25ul反應(yīng)體系。反應(yīng)混合液包括1倍PCR反應(yīng)緩沖液，10ng模板DNA；1.5mM MgCl2；1.5mMdNTPs和1U TaqDNA聚合酶，引物各50pmol。
擴(kuò)增條件94℃預(yù)變性3min，以后30個(gè)循環(huán)，94℃變性30s，62.5℃退火45s，72℃引物延伸30s；最后72℃延伸5min。
44個(gè)參試細(xì)菌除Cmm外的39個(gè)參試菌株分別是Cl.michiganensis subsp.Nebraskensis(ATCC3298)；Cl.michiganensis subsp.Insidisus(JCM1369)；Cl.michiganensis subsp.Tesselarius(ATCC7221)；Cl.michiganensis subsp.Sepedonicus(JCM1483)；Cl.tritici(ICMP2626)；Cur.f.pv.betae(2594)、Cur.f.pv.oortii(2632)、Cur.f.pv.poinsettias(2566)、Cur.flaccumfaciens pv.basellae(BR)、Cur.f.pv.beticila(CV30)、Curtobacterium citreum(15828)、Cur.luteum(15830)、Cur.albidum(15831)、Cur.pusillum(19096)、Cur.plantarum(49174)、R.tritici(2626)、Cl.fangii(Ta-19)、帶化紅球菌(Rhodococcus facians，ICMP 5833，JCM6162、6163、6164、6165、10002T)，美國冬青節(jié)桿菌(Arthrobacter ilicis，ICMP 2607)，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium，Ga5)，茄青枯菌(Ralstonia solanacearum，LE24)，丁香假單胞菌菜豆致病變種(pseudomonas syringae，psp2)，菊歐文氏菌(Erwinia chrysanthemi，Ch10)，根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens，A6)，大腸桿菌(Escherichia coli，JM110)[任欣正，植物病原細(xì)菌的分類和鑒定。1994，農(nóng)業(yè)出版社]。引物CmmF1/CmmR2可以穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增Cmm得到分子量為425bp的特異性產(chǎn)物利用不同濃度的Cmm模板DNA(10ng-1pg)進(jìn)行靈敏性檢測，Cff低檢出量是50pg純DNA或3×102CFU/ml細(xì)胞。用生物素標(biāo)記的引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物作為探針，進(jìn)行Southern雜交，檢出靈敏度未能有提高。
實(shí)施例2對(duì)海關(guān)截獲的帶病番茄種子進(jìn)行的檢測。
用2％的次氯酸鈉將30克種子表面消毒，無菌條件下打碎，加45ml的0.01M PBS緩沖液(pH7.2)。在樣本中加入本發(fā)明的試劑盒各組分進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)組成和循環(huán)參數(shù)下反應(yīng)組成(25μl體系)(1)10×PCR緩沖液350mM KCl；10mMMgCl2；80mMTris-HCl；8％PVP；(2)10×dNTP(Mixture)8mM；(3)10×引物CffA1/引物CffA28μM；(4)Tag酶1U；(5)模板DNA5μl提取液。
循環(huán)參數(shù)預(yù)擴(kuò)增95℃5分鐘；94℃ 30秒，64℃ 30秒，72℃ 40秒，28個(gè)循環(huán)；72℃10分鐘延伸。
電泳檢測到425bp的清晰產(chǎn)物(呈陽性反應(yīng))，陰性對(duì)照是相同重量的國內(nèi)健康的番茄種子。
實(shí)施例3對(duì)接種番茄植株體的檢測利用濃度為106-108CFU/ml細(xì)菌懸浮液接種二葉期Cmm，番茄品種為農(nóng)友矮生菜豆。接種方法為針刺法，在真葉和子葉之間的莖上，用針劃出約1cm的垂直傷口，涂上菌液，凡士林封傷口，16℃-18℃培養(yǎng)20天。共取50株接種植株分別提取汁液，并在每個(gè)樣本中加入本發(fā)明中的試劑盒各組分進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)組成、循環(huán)參數(shù)如下反應(yīng)組成(25μl體系)(1)10×PCR緩沖液450mM KCl；17mM MgCl2；90mMTris-HCl；8％菲可；(2)10×dNTP(Mixture)6mM；(3)10×引物CmmF1/引物CmmR260pmol；(4)Tag酶1U；(5)模板DNA(20ng/μl)5μl。循環(huán)參數(shù)同實(shí)施例3。同時(shí)用組織印跡免疫結(jié)合分析(tissue blot-immunobinding assay，TB-IBA)的結(jié)果作比較(所用的抗體是Cff的多克隆抗體)。結(jié)果顯示PCR法能從50株接種植株中成功檢測到40株，而TB-IBA法只能檢測到37株，此外TB-IBA法本身在實(shí)驗(yàn)中易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。因此說明本發(fā)明提供的PCR方法對(duì)Cmm的檢測靈敏度和準(zhǔn)確性都高于組織印跡免疫法(如下)。

注+表示檢測出Cmm；-表示未檢出Cmm。
實(shí)施例4對(duì)自然侵染的大豆植株體的檢測隨機(jī)選取海關(guān)獲取的大豆種子，在滅菌土中播種，25～30℃條件下生長10天后共取50株幼苗分別提取汁液(提取方法同實(shí)施例4)；進(jìn)行以下PCR擴(kuò)增反應(yīng)組成(25μl體系)(1)10×PCR緩沖液400mM KCl；13mM MgCl2；60mMTris-HCl；8％PVP；(2)10×dNTP(Mixture)5mM；(3)10×引物CmmF1/引物CmmR260pmol；(4)Tag酶1U；(5)模板DNA5μl。循環(huán)參數(shù)同實(shí)施例3。同時(shí)用組織印跡免疫結(jié)合分析(tissue blot-immunobinding assay，TB-IBA)的結(jié)果作比較(所用的抗體是Cmm的多克隆抗體)。比較結(jié)果顯示本發(fā)明提供的PCR方法PCR方法對(duì)50株自然侵染的大豆植株體的檢測效果與組織印跡免疫法的檢測效果相當(dāng)，分別能檢測到13株和14株被侵染的大豆植株(如下)。

注+表示檢測出Cmm；-表示未檢出Cmm。
實(shí)施例5CfmmF1/CmmR2對(duì)海關(guān)進(jìn)口的Cmm其它寄主種子的檢測結(jié)果每種寄主分別檢查4批種子，每一批隨機(jī)抽取5份樣本，即每個(gè)寄主共20個(gè)樣本。每個(gè)樣本取30g種子進(jìn)行處理(處理方法同實(shí)施例4)，進(jìn)行以下PCR擴(kuò)增反應(yīng)組成(25μl體系)(1)10×PCR緩沖液350mM KCl；16mM MgCl2；70mMTris-HCl；8％PVP；(2)10×dNTP(Mixture)10mM；(3)10×引物CmmF1/引物CmmR260pmol；(4)Tag酶1U；(5)模板DNA5μl。循環(huán)參數(shù)同實(shí)施例4。對(duì)照實(shí)驗(yàn)依然是用Cmm的多克隆抗體進(jìn)行TB-IBA試驗(yàn)。結(jié)果顯示PCR方法和TB-IBA可以從部分寄主中檢測到Cmm，PCR法可以從四批番茄種子成功檢測到兩批種子帶菌，而TB-IBA法只能檢測到一批。此外PCR法還可以從甜胡椒種子內(nèi)檢測到Cmm。說明本發(fā)明提供的PCR法比TB-IBA法檢測靈敏度高(如下)。

注以上數(shù)字表示檢測出的陽性樣本數(shù)。
序列表SEQUENCE LISTING<110>
南京農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>
番茄潰瘍病菌的檢測基因及其檢測試劑盒<130>
說明書<140> 00<141> 2004-06-10<160> 1<170>
PatentIn version 3.1<210> 1<211> 516<212>DNA<213>
密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞種(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)<220><221>
gene<222> (1)..(516)<223> <400>1agtcgtaaca aggtagccgt accggaaggt gcggctggat cacctccttt ctaaggagca 60tgtgcacctc tcctctgtat acagggagat caagggtgcc aagtcacgcg tcaggcgtct 120gttctggcgg tggcgctcat gggtggaaca ttgacattga tgccggctga tgtgtcgggc 180tgctagtacg cctccttgtg gggtgggaac gtggtctggt gtgtcgaggg catgttgcac 240gctgttgggt cctgagggac cgggccgcac cttttgggtg tgtctggttt cttgtcggac 300cctttccgtc gtcctgttgt ggatggtggt ggggtaccgc ccgtatattg agaactacac 360agtggacgcg agcatcttag attcaccggt tttccggtgg atcacaaaga tctatttata 420gatcattggt caattctgtc tcccttcggg gaggcgaaac gattcaatct catgtgattt 480caagattcta agggcaaacg gtggatgcct tggcac 51權(quán)利要求
1.番茄潰瘍病菌(Cmm)的檢測基因，其特征在于，Cmm的ITS全序列(SEQ ID NO.1)為516bp1 AGTCGTAACA AGGTAGCCGT ACCGGAAGGT GCGGCTGGAT CACCTCCTTTCTAAGGAGCA61 TGTGCACCTC TCCTCTGTAT ACAGGGAGAT CAAGGGTGCC AAGTCACGCGTCAGGCGTCT121 GTTCTGGCGG TGGCGCTCAT GGGTGGAACA TTGACATTGA TGCCGGCTGATGTGTCGGGC181 TGCTAGTACG CCTCCTTGTG GGGTGGGAAC GTGGTCTGGT GTGTCGAGGGCATGTTGCAC241 GCTGTTGGGT CCTGAGGGAC CGGGCCGCAC CTTTTGGGTG TGTCTGGTTTCTTGTCGGAC301 CCTTTCCGTC GTCCTGTTGT GGATGGTGGT GGGGTACCGC CCGTATATTGAGAACTACAC361 AGTGGACGCG AGCATCTTAG ATTCACCGGT TTTCCGGTGG ATCACAAAGATCTATTTATA421 GATCATTGGT CAATTCTGTC TCCCTTCGGG GAGGCGAAAC GATTCAATCTCATGTGATTT481 CAAGATTCTA AGGGCAAACG GTGGATGCCT TGGCAC
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述番茄潰瘍病菌(Cmm)的檢測基因，其特征在于，其檢測引物序列為CmmF1 5 ‘-CCTTTCCGTCGTCCTGTTGT-3’CmmR2 5 ‘-TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3’
3.權(quán)利要求1或2所述番茄潰瘍病菌(Cmm)的檢測基因的檢測試劑盒，包括管號(hào) 名稱 濃度1 超純水99％～100％2 PCR反應(yīng)緩沖液 9×～10×3 dNTPs 9mM～10mM4 Mg2+20mM～25mM5 陽性對(duì)照DNA 95ng/μl～1100ng/μl6 DNA marker2Kb7 上樣緩沖液5×～6×8 正向引物(CmmF1) 20μM～25μM9 反向引物(CmmR2) 20μM～25μM使用該試劑盒對(duì)參試細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Cmm產(chǎn)生分子量為425bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
全文摘要
番茄潰瘍病菌(Cmm)的檢測基因及其檢測試劑盒，屬于農(nóng)作物防病治病及植物檢疫范疇?；蛭挥?6S－23S rDNA間的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的核酸序列。試劑盒包括超純水；PCR反應(yīng)緩沖液10×；dNTPs 10mM；Mg2+25mM；陽性對(duì)照DNA 100ng/μl；DNAmarker；上樣緩沖液5×；正向引物(CmmF1)20μM；反向引物(CmmR2)20μM。使用該試劑盒對(duì)44個(gè)參試細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Cmm產(chǎn)生分子量為425bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，其余無產(chǎn)物。達(dá)到對(duì)Cmm快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏的檢測效果。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1584054SQ20041004128
公開日2005年2月23日 申請(qǐng)日期2004年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月16日
發(fā)明者郭堅(jiān)華, 張曉梅 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)