專利名稱：腺苷脫氨酶活性測(cè)定方法及腺苷脫氨酶診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測(cè)定腺苷脫氨酶活性的方法，同時(shí)本發(fā)明還涉及用以實(shí)現(xiàn)該方法的腺苷脫氨酶診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醫(yī)學(xué)研究表明，腺苷脫氨酶是一種與機(jī)體細(xì)胞免疫活性有重要關(guān)系的核酸代謝酶。因此，腺苷脫氨酶活性的測(cè)定被作為良惡性胸腹水，腦脊液鑒別診斷，重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病鑒別的重要診斷標(biāo)志。
腺苷脫氨酶的活性測(cè)定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。據(jù)申請(qǐng)人了解，目前國(guó)際上普遍采用紫外光法，其測(cè)定原理是腺苷(白色結(jié)晶粉末)+水(H2O)腺苷脫氨酶肌苷(Inosine)+氨離子(NH4+)，此反映過(guò)程生成的肌苷會(huì)在波長(zhǎng)為265nm處顯現(xiàn)，因此可以通過(guò)測(cè)定此波長(zhǎng)處吸光度的大小直接反映腺苷脫氨酶活性的大小。然而，此方法無(wú)法用一般醫(yī)院的可見(jiàn)光分析儀測(cè)定，而需要使用專門(mén)的紫外光分析儀，因此難以切實(shí)推廣應(yīng)用。
檢索發(fā)現(xiàn)，申請(qǐng)?zhí)枮?3128092.7、申請(qǐng)日為2003.05.29、名稱為《一種測(cè)定腺苷脫氨酶的試劑及其制法》的中國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)了應(yīng)用酶反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰氨輔酶配制的測(cè)定試劑。該發(fā)明所指的酶法測(cè)定試劑并不加入測(cè)定反應(yīng)所需的還原型煙酰氨輔酶或其類(lèi)似物，而加入其反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰氨輔酶或其類(lèi)似物，及其相應(yīng)的生成還原型輔酶所需的酶和底物系統(tǒng)，通過(guò)在試劑內(nèi)形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反應(yīng)系統(tǒng)，將這類(lèi)氧化型輔酶或其類(lèi)似物緩慢循環(huán)還原為還原型煙酰氨輔酶或其類(lèi)似物，當(dāng)被還原的還原型煙酰氨輔酶或其類(lèi)似物達(dá)到一定的濃度時(shí)，該發(fā)明所指的酶法試劑就可達(dá)到測(cè)定樣本中腺苷脫氨酶及其同工酶活力的目的。該發(fā)明的特點(diǎn)在于為腺苷脫氨酶的測(cè)試提供一個(gè)內(nèi)源合成腺苷脫氨酶反應(yīng)所需要的還原型煙酰氨輔酶的腺苷脫氨酶試劑。其缺點(diǎn)之一為，這個(gè)系統(tǒng)在生成反應(yīng)所需要的還原型煙酰氨輔酶的同時(shí)，也抵消了部分腺苷脫氨酶試劑(腺苷脫氨酶偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶反應(yīng)必定將還原型煙酰氨輔酶氧化成氧化型煙酰氨輔酶)的活性，造成試劑測(cè)試的準(zhǔn)確性大大降低。其缺點(diǎn)之二是，該試劑在正式測(cè)試前必須事先反應(yīng)一段時(shí)間，以便能夠產(chǎn)生足夠的還原型煙酰氨輔酶，這樣一來(lái)就造成了緩不濟(jì)急的結(jié)果，給測(cè)試帶來(lái)很大的不便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種可以克服以上現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的腺苷脫氨酶活性的測(cè)定方法，同時(shí)給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的腺苷脫氨酶診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行腺苷脫氨酶活性測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明測(cè)定腺苷脫氨酶活性的方法步驟如下1)、將樣品與主要由腺苷、單價(jià)磷酸鹽、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過(guò)氧化物酶、脲酶、還原型色原體組合組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應(yīng)腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+單價(jià)磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過(guò)氧化氫尿酸鹽+水+氧脲酶尿曩素+過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫+還原型色原體組合過(guò)氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水2)、檢測(cè)最終反應(yīng)物在主波長(zhǎng)主波長(zhǎng)400--600nm吸光度上升的速度，測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性大小。
通常步驟2)將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)400--600nm(根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)處直接反映吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)含量高低的光吸收大小，得出腺苷脫氨酶測(cè)定結(jié)果。
以上樣品與試劑的混合比例按體積為1/10到1/250，以上過(guò)程的測(cè)定溫度控制在常規(guī)的20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在常規(guī)的2-30分鐘。
本發(fā)明通過(guò)腺苷脫氨酶、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、脲酶、過(guò)氧化物酶等一系列的酶偶聯(lián)反應(yīng)，最終將無(wú)色的還原型色原體組合氧化成有色的吲嗒胺色原或醌亞胺色原，從而可以通過(guò)紫外/可見(jiàn)光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)400--600nm處，測(cè)定吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量的高低，進(jìn)而直接反映出腺苷脫氨酶活性的大小，為多種疾病的診斷提供方便，整個(gè)測(cè)定過(guò)程只需按步驟加入試劑即可，一氣呵成，便于操作。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明不僅便于推廣應(yīng)用，試劑反應(yīng)生成二倍過(guò)氧化氫，理論上靈敏度提高二倍。而且由于所生成的吲嗒胺色原或醌亞胺色原均有較高的摩爾消光系數(shù)，因此靈敏度高、精確度好。
用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的腺苷脫氨酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液40--200mmol/l腺苷 1--50mmol/l單價(jià)磷酸鹽0.2--10mmol/l核苷磷酸酶500--50000U/l黃嘌呤氧化酶 500--50000U/l過(guò)氧化物酶500--50000U/l脲酶 500--50000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)還原型色原體組合 0.1--20mmol/l還原型色原體組合可以是0.5-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙(3-methyl-2-benzothiazolinone-hydrszone簡(jiǎn)稱MBTH)或0.5-20mmol/l的4-氨基抗砒(4-aminoantipyrine，AAP)與0.1--20mmol/l以下十四種成分之一組合而成石碳酸(phenol)N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-m-anisidine簡(jiǎn)稱ESPAS)N，N-雙乙基-m-甲苯胺(N，N-Diethyl-m-toluidine)2，4-雙氯石碳酸(2，4-Dichloriphenol)2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸(2，4，6-Tribromo-3-hydroxy-benzenesulfonic acid簡(jiǎn)稱TBHB)3，5-雙氯石碳酸磺酸(3，5-Dichlorophenol sulfonic acid)3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸(3，5-Dichloro-2-hydroxy-benzenesulfonic acid簡(jiǎn)稱DHBS)N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽(N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine-sodium簡(jiǎn)稱TOOS)
仨溴羥基苯甲酸(Tribromohydroxybenzoic acid)雙甲基苯胺(Dimethylaniline簡(jiǎn)稱DMA)N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺(N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine簡(jiǎn)稱EHSPT)2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)(2，2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)簡(jiǎn)稱ABTS4-羥基-3-甲氧基苯甲酸(Vanillic acid(4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid)簡(jiǎn)稱HMB)3-甲基-乙基-羥基苯胺(3-methyl-ethyl-hydroxyaniline簡(jiǎn)稱MEHA)也可以將以上單劑配成如下雙劑，更有利于消除內(nèi)、外源肌苷、次黃嘌呤及尿酸的污染試劑I緩沖液40--200mmol/l單價(jià)磷酸鹽0.2--10mmol/l核苷磷酸酶500--50000U/l黃嘌呤氧化酶 500--50000U/l過(guò)氧化物酶500--50000U/l脲酶 500--50000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)還原型色原體組合之一 0.1--20mmol/l還原型色原體組合可以是0.5-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙或0.5-20mmol/l的4-氨基抗砒二者中之一。
試劑II緩沖液40--200mmol/l
腺苷 1--50mmol/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)還原型色原體組合之二0.1--20mmol/l還原型色原體組合之二可以是0.1--20mmol/l以下十四種成分之一石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-雙乙基-m-甲苯胺、2，4-雙氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸、3，5-雙氯石碳酸磺酸、3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽、仨溴羥基苯甲酸、雙甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羥基苯胺。
雙劑的配方不僅限于上述配方，還原型色原體組合之一及之二可以互換位置。其中的試劑I的成分，過(guò)氧化物酶可以放在試劑II，如此可以形成多種配方，就不在此一一詳述。
還可以將試劑配成如下三試劑，不但更有利于消除內(nèi)、外源肌苷、次黃嘌呤及尿酸的污染，還更有利于試劑的穩(wěn)定試劑I緩沖液40--200mmol/l單價(jià)磷酸鹽0.2--10mmol/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)還原型色原體組合之一 0.1--20mmol/l還原型色原體組合可以是0.5-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙或0.5-20mmol/l的4-氨基抗砒二者中之一。
試劑II核苷磷酸酶500--50000U/l黃嘌呤氧化酶 500--50000U/l
過(guò)氧化物酶 500--50000U/l脲酶 500--50000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)試劑III緩沖液40--200mmol/l腺苷 1--50mmol/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)還原型色原體組合之 0.1--20mmol/l還原型色原體組合之二可以是0.1--20mmol/l以下十四種成分之一石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-雙乙基-m-甲苯胺、2，4-雙氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸、3，5-雙氯石碳酸磺酸、3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽、仨溴羥基苯甲酸、雙甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羥基苯胺。
三劑的配方不僅限于上述配方，還原型色原體組合之一及之二可以分開(kāi)放在試劑I、II或III的任何位置。其中的試劑I的成分，單價(jià)磷酸鹽可以放在試劑II中，試劑II的成分，核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過(guò)氧化物酶、脲酶、等也可以放在試劑I中，過(guò)氧化物酶還可以放在試劑III，如此可以形成多種配方，就不在此一一詳述。
緩沖劑的pH范圍可以是6.5-10.5。緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、磷酸鹽(Phosphate)緩沖液、三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液、咪唑(Imidazole)緩沖液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液等，但不僅限于這些緩沖液。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩(wěn)定劑10-80％，穩(wěn)定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺、鹽或腺苷二磷酸等中的一種或一種以上。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關(guān)系的本發(fā)明腺苷脫氨酶診斷試劑盒較為理想緩沖液 80--120mmol/l腺苷 1--5mmol/l單價(jià)磷酸鹽 2--5mmol/l核苷磷酸酶 5000--50000U/l黃嘌呤氧化酶 5000--50000U/l過(guò)氧化物酶 5000--50000U/l脲酶 5000--50000U/l穩(wěn)定劑 30--50％(總體積)還原型色原體組合 0.5--2mmol/l還原型色原體組合可以是0.5-2mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙或0.5-20mmol/l的4-氨基抗砒與0.5--2mmol/l以下十四種成分之一組合而成石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-雙乙基-m-甲苯胺、2，4-雙氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸、3，5-雙氯石碳酸磺酸、3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽、仨溴羥基苯甲酸、雙甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羥基苯胺。
由于本發(fā)明是完全利用酶學(xué)方法，酶解反應(yīng)具有特異性高的特點(diǎn)，不易受到內(nèi)、外源其他物質(zhì)的干擾。酶法方法簡(jiǎn)便、易于操作。酶解反應(yīng)的特異性促使測(cè)試結(jié)果精確。酶解反應(yīng)都是在緩沖液條件下進(jìn)行，沒(méi)有污染環(huán)境問(wèn)題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測(cè)試成本低廉。因此可以保證具有較高的測(cè)試準(zhǔn)確性，更便于推廣應(yīng)用。
此外，本發(fā)明的顯著特色之一是可以消除內(nèi)、外源肌苷、次黃嘌呤及尿酸的污染，消除內(nèi)、外源肌苷、次黃嘌呤及尿酸的作用發(fā)生在整個(gè)反應(yīng)時(shí)間段的前半部分，在后半段時(shí)間受污染的內(nèi)、外源肌苷、次黃嘌呤及尿酸已經(jīng)被消耗殆盡，而在后半段時(shí)間測(cè)試腺苷脫氨酶活性所需要的肌苷都是產(chǎn)生于腺苷脫氨酶的活性。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例一(單劑)本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑盒包括緩沖液 80mmol/l腺苷 1mmol/l單價(jià)磷酸鹽 2mmol/l核苷磷酸酶 5000U/l黃嘌呤氧化酶 5000U/l過(guò)氧化物酶 5000U/l脲酶 5000U/l4-氨基抗砒 2mmol/l石碳酸 10mmol/l穩(wěn)定劑 30％(總體積)
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)495～505nm，測(cè)試副波長(zhǎng)600nm以上，被測(cè)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測(cè)時(shí)間2分鐘。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+單價(jià)磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過(guò)氧化氫尿酸鹽+水+氧脲酶尿曩素+過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫+還原型色原體組合過(guò)氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)495～505nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性大小。
本發(fā)明通過(guò)腺苷脫氨酶、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、脲酶、過(guò)氧化物酶等一系列的酶偶聯(lián)反應(yīng)，最終將無(wú)色的還原型色原體組合氧化成有色的吲嗒胺色原或醌亞胺色原，從而可以通過(guò)紫外/可見(jiàn)光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)400--600nm處，測(cè)定吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量的高低，進(jìn)而直接反映出腺苷脫氨酶活性的大小，為多種疾病的診斷提供方便，整個(gè)測(cè)定過(guò)程只需按步驟加入試劑即可，一氣呵成，便于操作。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明不僅便于推廣應(yīng)用，試劑反應(yīng)生成二倍過(guò)氧化氫，理論上靈敏度提高二倍。而且由于所生成的吲嗒胺色原或醌亞胺色原均有較高的摩爾消光系數(shù)，因此靈敏度高、精確度好。
實(shí)施例二(雙劑)本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑有
試劑I緩沖液 100mmol/l單價(jià)磷酸鹽 3mmol/l核苷磷酸酶 20000U/l黃嘌呤氧化酶 20000U/l過(guò)氧化物酶 20000U/l脲酶 20000U/l穩(wěn)定劑 40％(總體積)4-氨基抗砒 1mmol/l試劑II緩沖液 100mmol/l腺苷 3mmol/l穩(wěn)定劑 30mmol/l2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸 1mmol/l測(cè)定腺苷脫氨酶活性時(shí)，溫度控制在30℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)546nm，測(cè)試副波長(zhǎng)630nm以上，被測(cè)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測(cè)時(shí)間2分鐘。
具體測(cè)定步驟為腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+單價(jià)磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過(guò)氧化氫尿酸鹽+水+氧脲酶尿曩素+過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫+還原型色原體組合過(guò)氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)500～600nm光度上升的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在10分鐘。
實(shí)施例三(三劑)本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為三劑，有試劑I緩沖液 120mmol/l單價(jià)磷酸鹽 5mmol/l穩(wěn)定劑 25mmol/l3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2mmol/l試劑II緩沖液 120mmol/l核苷磷酸酶 50000U/l黃嘌呤氧化酶50000U/l過(guò)氧化物酶 50000U/l脲酶50000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)試劑III緩沖液 120mmol/l腺苷5mmol/l雙甲基苯胺 2mmol/l穩(wěn)定劑 30mmol/l在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度25℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)578nm，測(cè)試副波長(zhǎng)700nm以上，被測(cè)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測(cè)時(shí)間2分鐘。
具體測(cè)定步驟為腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+單價(jià)磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過(guò)氧化氫尿酸鹽+水+氧脲酶尿曩素+過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫+還原型色原體組合過(guò)氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)578nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在10分鐘。
實(shí)施例四本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑有試劑I緩沖液 100mmol/l單價(jià)磷酸鹽 4mmol/l核苷磷酸酶 10000U/l黃嘌呤氧化酶 10000U/l過(guò)氧化物酶 10000U/l脲酶 10000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)4-氨基抗砒 1mmol/l試劑II緩沖液 100mmol/l腺苷 2mmol/l
穩(wěn)定劑 30mmol/l石碳酸 7mmol/l在生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)500nm，測(cè)試副波長(zhǎng)600nm以上，被測(cè)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測(cè)時(shí)間2分鐘。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+單價(jià)磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過(guò)氧化氫尿酸鹽+水+氧脲酶尿曩素+過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫+還原型色原體組合過(guò)氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)500nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性大小。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)紫外/可見(jiàn)光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定腺苷脫氨酶活性的方法，步驟如下1)、將樣品與主要由腺苷、單價(jià)磷酸鹽、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過(guò)氧化物酶、脲酶、還原型色原體組合組成的試劑混合，使之發(fā)生如下反應(yīng)腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+單價(jià)磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過(guò)氧化氫尿酸鹽+水+氧脲酶尿曩素+過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫+還原型色原體組合過(guò)氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水2)、檢測(cè)最終反應(yīng)物在主波長(zhǎng)主波長(zhǎng)400——600nm吸光度上升的速度，測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性大小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述測(cè)定腺苷脫氨酶活性的方法，其特征在于所述步驟2)為，將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)400-600nm，測(cè)試副波長(zhǎng)500-700nm以上，吸光度上升的速度，測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性大小。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述測(cè)定腺苷脫氨酶活性的方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在2-30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述測(cè)定腺苷脫氨酶活性的方法，其特征在于被測(cè)樣品與試劑的比例控制在1/10到1/250。
5.一種腺苷脫氨酶診斷試劑盒，包括緩沖液40——200mmol/l腺苷 1——50mmol/l單價(jià)磷酸鹽 0.2——10mmol/l核苷磷酸酶 500——50000U/l黃嘌呤氧化酶 500——50000U/l過(guò)氧化物酶 500——50000U/l脲酶 500——50000U/l穩(wěn)定劑 10——80％(總體積)還原型色原體組合 0.1——20mmol/l
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸銨、鹽或腺苷二磷酸中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑為三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、咪唑緩沖液或雙甘氨肽緩沖液中的一種，pH范圍是6.5-10.5。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于所述還原型色原體為0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙與0.1-20mmol/l以下十四種成分之一組合而成石碳酸N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺N，N-雙乙基-m-甲苯胺2，4-雙氯石碳酸2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3，5-雙氯石碳酸磺酸3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽仨溴羥基苯甲酸雙甲基苯胺N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)4-羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-乙基-羥基苯胺。
10.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述腺苷脫氨酶診斷試劑，其特征在于所述還原型色原體組合為由0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒與0.1-20mmol/l以下十四種成分之一組合而成石碳酸N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺N，N-雙乙基-m-甲苯胺2，4-雙氯石碳酸2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3，5-雙氯石碳酸磺酸3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽仨溴羥基苯甲酸雙甲基苯胺N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)4-羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-乙基-羥基苯胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測(cè)定腺苷脫氨酶活性的方法，同時(shí)本發(fā)明還涉及腺苷脫氨酶診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括緩沖液、腺苷、單價(jià)磷酸鹽、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過(guò)氧化物酶、脲酶、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合，通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生酶偶聯(lián)反應(yīng)，再將最終反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)吸光度變化的情況(速度)，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性大小。采用本發(fā)明完全可以通過(guò)生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/42GK1746317SQ20041004190
公開(kāi)日2006年3月15日 申請(qǐng)日期2004年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月8日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:王爾中