專利名稱：雞骨骼肌表達(dá)序列標(biāo)簽基因芯片的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及利用雞的骨骼肌表達(dá)序列標(biāo)簽構(gòu)成的cDNA芯片的制備方法。
背景技術(shù)：
生物基因組中可轉(zhuǎn)錄表達(dá)的序列(即基因)僅占總序列的3-5％，對(duì)這部分序列進(jìn)行測(cè)定，將直接導(dǎo)致新基因的發(fā)現(xiàn)，并獲取基因組中與產(chǎn)業(yè)化關(guān)系最為密切的信息。早在人類基因組計(jì)劃的實(shí)施中，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院生物學(xué)家Venter JC于1991年提出了發(fā)現(xiàn)表達(dá)基因的新戰(zhàn)略，即用EST克隆和定位新基因，這一構(gòu)想的具體過程是將mRNA在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA后克隆到Vector上構(gòu)建cDNA文庫，再從cDNA文庫中大規(guī)模隨機(jī)挑取cDNA克隆，對(duì)其3’或5’進(jìn)行一次測(cè)序獲得EST。這使基因克隆和定位新基因發(fā)生了革命性的變革。目前，通過數(shù)據(jù)庫查詢，cDNA文庫連接測(cè)序，mRNA差別顯示，代表性差示分析和抑制差減等方法獲得的EST數(shù)據(jù)有數(shù)百萬之多，并且以每月十萬的速度增長(zhǎng)。
表達(dá)序列標(biāo)簽就是一段cDNA，具體就是將mRNA在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA后克隆到載體上，構(gòu)建cDNA文庫，再從cDNA文庫中大規(guī)模挑取cDNA克隆，對(duì)其3′端或5′端進(jìn)行一步法測(cè)序(Single-run sequencing)獲得EST。簡(jiǎn)單說EST是一段長(zhǎng)約150-500bp的基因表達(dá)的外顯子序列片段。EST要求大于150bp，是因?yàn)槿绻∮谶@個(gè)值，那么EST的5′端將可能不包含ORF的序列，這樣的序列毫無意義，但即使大于150bp，3′端也可能缺少蛋白質(zhì)編碼序列。3′端是否包含編碼框并不重要，因?yàn)閙RNA的5′端包含翻譯的起始信息，為蛋白質(zhì)翻譯的必要信息；而3′端有終止密碼和polyA尾，我們很容易通過對(duì)序列的觀察和實(shí)驗(yàn)確定3′端。EST一般小于500bp，是因?yàn)樽詣?dòng)測(cè)序儀一次所能測(cè)的DNA的長(zhǎng)度就是500bp。
基因芯片(Gene chip)，又稱DNA微陣列(DNA microarray)，是指采用原位合成或顯微打印手段，將大量的核酸探針固化在支持物表面，產(chǎn)生二維DNA探針陣列。它通過與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，并檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品快速、高效檢測(cè)的目的。其技術(shù)要點(diǎn)主要包括4個(gè)主要步驟芯片制備、探針標(biāo)記、分子雜交、數(shù)據(jù)獲取。
最初的基因芯片主要是用于DNA測(cè)序。而目前這一技術(shù)以擴(kuò)展至組織、蛋白、細(xì)胞等非核酸領(lǐng)域，因此基因芯片已超出了原來的范圍。1995年P(guān)atrickBrown等提出了cDNA微陣列技術(shù)，M.Schena等首次制造了cDNA陣列，由于各類生物的基因組計(jì)劃帶來了大量EST(cDNA)的積累，這項(xiàng)技術(shù)的出現(xiàn)能更好的利用起這些EST資源，因此得到了飛速的發(fā)展。運(yùn)用基因芯片技術(shù)，將獲得的芯片運(yùn)用雜交技術(shù)和掃描技術(shù)對(duì)基因芯片進(jìn)行芯片處理、有效數(shù)據(jù)提取、分析和報(bào)告，可獲得相應(yīng)的基因表達(dá)譜(Gene expression profiling)。目前DNA芯片因具有強(qiáng)有力性、靈活性、敏感性和相對(duì)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)而被應(yīng)用在許多領(lǐng)域，如DNA測(cè)序、基因多態(tài)性(SNP)檢測(cè)、新基因的發(fā)現(xiàn)、疫苗和藥物研究、植物的抗逆性研究、有機(jī)體的發(fā)育、調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的基因的協(xié)調(diào)性研究、檢測(cè)不同發(fā)育時(shí)期不同組織中基因的波動(dòng)性活動(dòng)等。分析基因組規(guī)?；幕虮磉_(dá)數(shù)據(jù)，將最終導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞分化的整體性觀察，涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡、能量代謝、胞間和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞遷移的基因組分子圖譜等。
通過對(duì)表達(dá)序列標(biāo)簽及其構(gòu)成的基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，有助于發(fā)現(xiàn)并克隆基因家族新成員、基因定位克隆、作為序列標(biāo)簽位點(diǎn)(Sequence-Tagged Sites，簡(jiǎn)稱STSs)染色體的基因定位和基因圖譜制作、導(dǎo)致遺傳病的突變位點(diǎn)的鑒定、分析基因在不同組織中的表達(dá)特異性和建立DNA物理圖譜、新藥的發(fā)明和對(duì)細(xì)胞和有機(jī)體的整體研究等。正因?yàn)楸磉_(dá)序列標(biāo)簽具有如此的優(yōu)越性，因此表達(dá)序列標(biāo)簽測(cè)序已經(jīng)成為許多基因組研究機(jī)構(gòu)的工作重點(diǎn)。
雞作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，由于其胚胎發(fā)育的特殊性一直是胚胎生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究的重要模型。在免疫學(xué)研究方面，雞的淋巴細(xì)胞發(fā)育過程為鑒別T細(xì)胞和B細(xì)胞提供了線索，B細(xì)胞的命名就是基于禽類的法氏囊。在基因表達(dá)調(diào)控方面，早期的激素對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制研究也是利用雞作為模型進(jìn)行分析的?？梢婋u作為模式生物對(duì)生物學(xué)早期研究所起的重要作用。
雞作為模式生物，在開展基因組學(xué)研究方面也有著巨大優(yōu)勢(shì)。首先，雞和人的保守同線性水平非常高，從雞和人比較圖譜發(fā)現(xiàn)進(jìn)化過程中相當(dāng)部分的染色體區(qū)段是非常保守的，物理定位的基因中也發(fā)現(xiàn)許多是保守的，定位在連鎖圖上的235個(gè)已知基因中有204個(gè)在人上已經(jīng)被定位；其次，雞基因組大小只有人的三分之一，基因組中的重復(fù)序列少、內(nèi)含子的長(zhǎng)度小，基因組結(jié)構(gòu)有其獨(dú)特性(微小染色體中的基因密度高于大染色體)。這些特點(diǎn)無疑決定了雞是除河豚、小鼠和大鼠外研究人類基因組和生物進(jìn)化規(guī)律的又一個(gè)很好的模式生物。
特別在骨骼肌發(fā)育的研究中，雞有著其它的模式動(dòng)物無可比擬、不可取代的優(yōu)勢(shì)。雞在長(zhǎng)期的自然及人工選育的過程中形成了在生長(zhǎng)發(fā)育上具有較大差異的兩大品系，即蛋雞和肉雞。即使在相同的飼養(yǎng)條件下，肉雞在骨骼肌生長(zhǎng)速度上遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋雞。由于這兩種不同的雞具有相同的起源，因此，它們?cè)诨蚪M水平上具有大體相同的遺傳背景和與其特定性狀(肌肉生長(zhǎng)速度)相關(guān)的微小差異。通過對(duì)蛋雞和肉雞骨骼肌組織的差異表達(dá)基因?qū)ふ揖涂赡転檠芯考∪獍l(fā)育機(jī)理提供重要線索。
目前，尋找差異表達(dá)基因的方法有很多種。根據(jù)技術(shù)策略的不同，可分為以PCR擴(kuò)增原理為基礎(chǔ)的RNA任意引物PCR指紋(RNA Fingerprinting byArbitrarily Primed PCR，RNA AP-PCR)和差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR(DifferentialDisplay RT-PCR，DDRT-PCR)；以雜交原理為基礎(chǔ)的差異雜交(DifferentialHybridization)、抑制性消減雜交(Supression Subtractive Hybridization，SSH)、cDNA代表差異分析(cDNA Representational Difference Analysis，cDNA RDA)和cDNA微點(diǎn)陣雜交(cDNA microarray Hybridization)；以限制性酶切為策略的RFLP偶聯(lián)的結(jié)構(gòu)域定向差異顯示(RFLP-coupled Domain-DirectedDifferential Display，RC4D)、cDNA 3’端限制性酶切片斷分析(Analysis of cDNA3’-end Restriction Fragments)和基因表達(dá)系列分析(Serial Analysis of GeneExpression，SAGE)。
這些豐富的方法在發(fā)現(xiàn)基因的差異表達(dá)研究中，各有其優(yōu)缺點(diǎn)。比如DDRT-PCR的假陽性率可以高達(dá)70％，而且涉及危險(xiǎn)性的同位素等；SSH要求起始的原材料要多，且依賴序列中酶切位點(diǎn)的存在及接頭與片段的連接效率等；cDNA RDA的缺點(diǎn)在于可比的樣本數(shù)較少，所獲序列較短，且對(duì)于低豐度的mRNA不易檢出等；SAGE技術(shù)的高成本，低效率(測(cè)序大部分得到高豐度看家基因)也影響了其運(yùn)用。
此外，cDNA芯片的制備方法，目前集中利用已經(jīng)修飾的玻片為基片，然后將cDNA點(diǎn)至于玻璃片之上，這種方法的缺點(diǎn)是成本高，玻璃片修飾基團(tuán)不穩(wěn)定，因此不利于基因芯片的推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種成本低、效率高的可在蛋雞和肉雞骨骼肌差異基因表達(dá)篩選中應(yīng)用的雞骨骼肌表達(dá)序列標(biāo)簽基因芯片的制備方法，它的制備過程如下(1)初步處理DNAa.將5～10μg已純化提取的DNA溶解于50μl的0.1～0.15M NaOH溶液中，并在60～70℃溫度下水浴30～60分鐘；b.加入5μl的溶于異丙醇的0.1～0.2M環(huán)氧丙氧基三甲氧基硅烷；c.在60～70℃水浴鍋中水浴3～5個(gè)小時(shí)；d.加50μl中和液，中和液為0.2M Tris.HCl和1M NaCl的混合液；e.加入200μl的乙醇進(jìn)行純化回收，即完成了DNA的初步處理；(2)點(diǎn)樣前處理DNA將初步處理的DNA加入25μl 45～55mM NaOH溶液中進(jìn)行變性，在所得液體中再加25μl 0.08-0.12M的Tris HCl即完成處理；(3)點(diǎn)樣將產(chǎn)物取體積10μl，然后通過8道加樣器，將樣品轉(zhuǎn)移至Axygen的384孔板，然后利用MicroGridII機(jī)器人進(jìn)行cDNA芯片制備使用的點(diǎn)樣針為0.1mm的實(shí)心針，載體為玻璃片，利用4×4的針列進(jìn)行點(diǎn)樣，控制芯片制備外部環(huán)境，溫度保持在21℃，相對(duì)濕度控制在50-55％之間，并使用軟接觸(softtouch)的功能，嚴(yán)格控制點(diǎn)樣針每次取樣之間的洗針程序；(4)點(diǎn)樣完成后，立刻將玻片放在80℃溫度下干烤2～4小時(shí)；取出玻片，在體積濃度為80％的乙醇中浸泡，然后將玻片用保鮮膜包住使其密封，再在60-70℃的水浴鍋中水浴4～8小時(shí)；用濃度為80％的乙醇清洗至其表面雜質(zhì)清除；用氣流吹干或用550rpm離心機(jī)離心3min，即得本發(fā)明所述芯片。本發(fā)明的制備方法具有以下優(yōu)點(diǎn)1.規(guī)模大可以同時(shí)對(duì)10 000個(gè)以上的基因進(jìn)行檢測(cè)，隨著技術(shù)的改進(jìn)，目前芯片已經(jīng)可以達(dá)到400 000probes/1.6cm2的驚人密度。2.速度快芯片的雜交反應(yīng)可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，相對(duì)于其他方法更迅速快捷，另一方面也有利于進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)；3.效率高芯片的高通量性結(jié)合生物信息學(xué)的數(shù)據(jù)挖掘使芯片在效率上大大的高于傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法；4.安全性高使用熒光物標(biāo)記，避免了同位素等物質(zhì)的污染；5.靈敏度高可檢測(cè)豐度差幾個(gè)數(shù)量級(jí)的表達(dá)情況；6.相對(duì)成本低由于高通量，高效率的特點(diǎn)，縮短了研究的實(shí)驗(yàn)周期，相對(duì)于對(duì)單個(gè)基因的研究成本下降；因此，cDNA芯片技術(shù)就規(guī)模、速度，還是效率、成本，都有其他方法不可比擬的優(yōu)勢(shì)，能夠勝任蛋雞和肉雞的骨骼肌差異表達(dá)基因的大規(guī)模分析。本發(fā)明的應(yīng)用如下1.用本發(fā)明的方法獲得的新的表達(dá)序列標(biāo)簽制成表達(dá)序列標(biāo)簽芯片具有許多商用價(jià)值和科研價(jià)值；a.應(yīng)用該基因芯片可以快速、高效的進(jìn)行蛋雞和肉雞的骨骼肌表達(dá)差異基因篩選，研究不同發(fā)育階段的雞的骨骼肌表達(dá)差異基因。并可以分析不同個(gè)體之間的基因表達(dá)差異，從而從整體上研究雞的骨骼肌發(fā)育相關(guān)調(diào)控基因。b.應(yīng)用該表達(dá)序列標(biāo)簽芯片可用于克隆動(dòng)物的重要性狀的基因，如肌肉快速生長(zhǎng)控制基因、肌肉萎縮控制基因及相關(guān)影響肌肉結(jié)構(gòu)組成等基因。c.應(yīng)用該基因芯片也可用于對(duì)動(dòng)物的雜種優(yōu)勢(shì)進(jìn)行早期預(yù)測(cè)，篩選出最佳的優(yōu)勢(shì)雜交種。d.應(yīng)用該基因芯片也能用于對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行商品檢驗(yàn)，以檢驗(yàn)可食轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性。e.應(yīng)用該基因芯片還可用于查找藥物的毒性和副作用，進(jìn)行毒理學(xué)研究，利于對(duì)新型動(dòng)物藥物的篩選。f.該基因芯片可用于動(dòng)物的育種和動(dòng)物新品種的產(chǎn)生。g.該基因芯片還可用于從整體上研究整個(gè)信息利于核糖核酸(mRNA)的表達(dá)，這對(duì)生物體基因調(diào)節(jié)的整體性研究具有重要的科研和實(shí)踐指導(dǎo)價(jià)值。h.應(yīng)用該基因芯片還可以運(yùn)用突變體研究動(dòng)物中胞間和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，為發(fā)現(xiàn)動(dòng)物中的基因功能和生理代謝途徑提供重要的理論依據(jù)。i.該基因芯片能夠作為一種商品，廣泛應(yīng)用于臨床、醫(yī)藥行業(yè)以及實(shí)際生產(chǎn)中。2.可以利用這些新的表達(dá)序列標(biāo)簽繪制基因圖譜。如果一個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽在基因組中只出現(xiàn)一次，那么它可以做為序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)。由表達(dá)序列標(biāo)簽構(gòu)建的物理圖譜叫表達(dá)圖或轉(zhuǎn)錄圖。利用表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行基因圖制作，可以加快序列標(biāo)簽位點(diǎn)的制作和新基因的染色體定位。3.表達(dá)序列標(biāo)簽序列可以作為基因特異性探針，對(duì)組織特異性基因表達(dá)的研究具有重要的作用。4.這些新的表達(dá)序列標(biāo)簽豐富了表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫，并可以最大限度地利用公開的表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫信息，大大縮短克隆新的全長(zhǎng)互補(bǔ)脫氧核糖核酸的周期并可減少克隆的成本，加快雞的生物信息積累較薄弱的基因克隆進(jìn)度。5.表達(dá)序列標(biāo)簽還可進(jìn)行新基因的遺傳進(jìn)化關(guān)系分析。表達(dá)序列標(biāo)簽可以對(duì)所有動(dòng)植物的基因作為一種標(biāo)簽庫，通過不同的序列比較可以獲得保守序列片段，從而獲得基因的遺傳進(jìn)化圖譜。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過分別提取6周齡蛋雞骨骼肌和胚胎期18天肉雞骨骼肌組織高質(zhì)量RNA，然后分別純化mRNA，構(gòu)建6周齡蛋雞骨骼肌組織cDNA文庫和胚胎期18天肉雞骨骼肌組織cDNA文庫。從已構(gòu)建的6周齡蛋雞骨骼肌cDNA文庫和胚胎期18天肉雞骨骼肌組織cDNA文庫中隨機(jī)挑取克隆以文庫質(zhì)粒上的通用引物T7和T3進(jìn)行PCR擴(kuò)增(94℃ 5min預(yù)變性；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 2.5min共40個(gè)循環(huán)；72℃ 7min繼續(xù)延伸；4℃保存)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過異丙醇純化后，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選擇有效擴(kuò)增的10752個(gè)克隆，并對(duì)其中100克隆進(jìn)行測(cè)序，通過NCBI進(jìn)行分析后，使用MicroGridII機(jī)器人進(jìn)行cDNA芯片制備。芯片制備過程中利用Amersham的內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)控制試劑盒進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控，包含有靈敏度檢測(cè)，重復(fù)性檢測(cè)，芯片布局均一性檢測(cè)。
本發(fā)明分離出世界上首次發(fā)現(xiàn)的雞的骨骼肌cDNA表達(dá)序列標(biāo)簽的序列具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.20的序列。
所說的cDNA序列具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.20的序列中的一條或數(shù)條的組合。cDNA序列包括SEQ ID No.1～SEQ ID No.20的序列中每條序列的互補(bǔ)序列或同源序列。cDNA序列包括SEQ ID No.1～SEQ ID No.20的每條序列中的15-100個(gè)連續(xù)核昔酸為探針的序列或其互補(bǔ)序列。
上述序列標(biāo)簽所組成的基因芯片是在載體上結(jié)合有SEQ ID No.1～SEQID No.20的序列、同源序列或其互補(bǔ)序列的核酸分子。載體為固相載體。固相載體為玻片、硅片、尼龍膜、硝酸纖維膜、凝膠。所說的核酸分子是脫氧核糖核酸、核糖核酸和多聚寡核苷酸。
本發(fā)明所述表達(dá)序列標(biāo)簽的基因芯片是用于生物功能的研究和檢測(cè)。所說的生物包括雞及它的細(xì)胞、組織器官及其系統(tǒng)；所說的生物功能的研究包括蛋雞和肉雞的骨骼肌差異基因研究；對(duì)雞進(jìn)行給藥處理后或不同飼料喂養(yǎng)，檢測(cè)前后基因表達(dá)變化，分析藥物和飼料的功能；對(duì)雞進(jìn)行肌肉萎縮模擬后的分析研究；對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)和發(fā)育的機(jī)理的研究；所說的生物功能的檢測(cè)包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的安全性檢測(cè)、食物成分的功能性評(píng)估、病原體的檢測(cè)和診斷、生物物種的鑒定，包括動(dòng)植物和微生物。
一.cDNA文庫的構(gòu)建1.6周齡蛋雞骨骼肌和胚胎期18天肉雞骨骼肌組織mRNA的提取探針退火約350μg總RNA加入DEPC處理水至總體積500μl，65℃水浴10分鐘，加入3μl生物素標(biāo)記寡聚dT引物與13μl 20×SSC。輕柔混勻，室溫冷卻。
洗滌磁珠輕輕拍打管底使磁珠徹底分散，用磁力架捕獲磁珠，小心去上清。以0.3ml 0.5×SSC洗滌磁珠3次，每次洗滌后均以磁力架捕獲磁珠，小心去上清。在最后一次洗滌后，盡可能多移去上清。
mRNA的捕獲與洗滌將加入探針退火的mRNA加入裝有經(jīng)洗滌的磁珠的管中，室溫放置10分鐘，每1-2分鐘顛倒混勻一次。用磁力架捕獲磁珠，小心去上清。以0.1×SSC洗滌磁珠4次，最后一次洗滌之后，盡可能多移去上清。
溶解mRNA將磁珠重新懸浮于0.1ml DEPC處理水中，以磁力架捕獲磁珠，取上清。再將磁珠懸浮于0.15ml DEPC處理水中，以磁力架捕獲磁珠，取上清。將兩次上清混合，共0.25ml。
2合成cDNA第一條鏈加樣之前，先設(shè)置42℃溫浴，把有關(guān)試劑解凍，并離心。
在0.5mlRNase free的離心管中加入下列試劑試劑 體積(μl)
10×first-strand buffer 5First-strand methyl nucleotide mixture 3Linker primer 2DEPC-treated H2O xRNase Block Ribonuclease Inhibitor 1Poly(A+)RNA(5μg) xTotal 48.51.混勻，室溫放置10分鐘，使引物與模板結(jié)合。在此期間，在另外一個(gè)離心管中加入0.5μl[α-32P]dATP作為對(duì)照。
2.在反應(yīng)體系中加入1.5μl StrataScript RT，此時(shí)總反應(yīng)體系為50μl。
3.從第一條鏈合成反應(yīng)體系中吸出5μl，加到有0.5μl[α-32P]dNTP的管中，作為第一條鏈合成的對(duì)照反應(yīng)。
4.把反應(yīng)體系和對(duì)照反應(yīng)在42℃反應(yīng)1小時(shí)。
5.停止反應(yīng)，將第一條鏈合成反應(yīng)體系放置于冰上，將第一條鏈合成的對(duì)照反應(yīng)管放置于-20℃下，待堿變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)你轉(zhuǎn)錄效率。
3合成cDNA第二條鏈1.在反應(yīng)結(jié)束的cDNA第一條鏈合成反應(yīng)體系中加入下列試劑試劑 體積(μl)10*second-strand buffer 20second-strand dNTP mixture6dd H2O 114[α-32P]dNTP 2RNase H 2DNA polymerase11Total 1552.混勻并離心，16℃反應(yīng)2.5小時(shí)。
3.結(jié)束反應(yīng)，立即放置于冰上。
4補(bǔ)平cDNA末端1.在反應(yīng)結(jié)束的cDNA第二條鏈合成體系中加入下列試劑.
23μl Blunting dNTP mix2μl Pfu DNA polymerase2. 72℃反應(yīng)0.5小時(shí).(不要超過30分鐘！)3.結(jié)束反應(yīng)，加入200μl酚-氯仿，震蕩，室溫離心12000rpm，2分鐘。
4.轉(zhuǎn)移上清到新的1.5ml離心管中，加入200μl氯仿，震蕩，室溫離心12000rpm，2分鐘。轉(zhuǎn)移上清到新的1.5ml離心管中，加入20μl醋酸鈉和400μl100％乙醇，放置在-20℃過夜。
5. 4℃離心12000rpm 1小時(shí)。
6.倒掉上清，加入500μl70％乙醇，不要讓沉淀重懸，室溫離心12000rpm 2分鐘。
7.倒掉上清，真空干燥。
8.加入9μl EcoR I adapters，重懸沉淀，放置在4℃至少30分鐘。
9.從中吸出1μl到新的0.5ml離心管中作為第二條鏈合成反應(yīng)的對(duì)照反應(yīng)。把第一條鏈合成的對(duì)照反應(yīng)和第二條鏈合成反應(yīng)的對(duì)照反應(yīng)跑alkaline agarosegel。
5連接EcoR I Adapters1.在補(bǔ)平末端的cDNA和EcoR I adapters中加入下列試劑試劑 體積(μl)10*ligase buffer 1rATP 1T4 DNAligase 12. 8℃過夜，或4℃兩天。
3.第二天(或第三天)于70℃加熱30分鐘以終止反應(yīng)，并使連接酶失活。
6磷酸化EcoR I末端1.將反應(yīng)體系離心2秒鐘，室溫放置5分鐘。
2.加入下列成分試劑 體積(μl)10*ligase buffer 1rATP 2
dd H2O5T4 polynucleotide kinase 23. 37℃反應(yīng)0.5小時(shí)。
4. 70℃，0.5小時(shí)以終止反應(yīng)，并使激酶失活。
5.離心2秒鐘，室溫放置5分鐘。
7Xho I酶切1.反應(yīng)體系中加入28μl Xho I buffer supplement和3μl Xho I。
2. 37℃反應(yīng)1.5小時(shí)。
3.加入5μl 10*STE buffer和125μl 100％乙醇。
4.-20℃過夜。
5. 4℃離心12000rpm，1小時(shí)。
6.倒掉上清，干燥，加入14μl 1*STE buffer重懸cDNA。
7.加入3.5μl column loading dye準(zhǔn)備過柱進(jìn)行分離純化。
8 cDNA分選分離柱的組裝1.將棉塞從移液管的末端挑出一部分，留3-4mm的長(zhǎng)度在移液管中，將剩余部分剪掉。
2.用連接管連結(jié)注射器和移液管。
3.用注射器的活塞將棉塞吹入移液管尖端。
4.將組裝好的裝置垂直固定于蝴蝶夾或三腳架上。
9分離柱的制作及樣品的分離1.將約2ml 1×STE buffer灌入移液管2.立刻加入Sepharose CL-2B filtration medium，等待Sepharose CL-2B filtrationmedium在重力作用下沉淀形成柱子，直至柱床離移液管頂端約0.25inch時(shí)，柱子便做成了。
3.在注射器內(nèi)加入10ml 1×STE buffer，使其緩緩流下，以清洗柱子。這個(gè)過程要經(jīng)歷至少2小時(shí)。
4.把cDNA樣品加入柱子，待樣品進(jìn)入柱子后，加上1×STE buffer。
注整個(gè)過程都要避免氣泡的產(chǎn)生。
10收集分離好的樣品1.準(zhǔn)備12個(gè)0.5ml離心管，編號(hào)，當(dāng)染料前端到達(dá)移液管的-0.4ml刻度時(shí)，開始收集樣品，每三滴一管，直至染料末端到達(dá)0.3ml刻度，停止收集。
2.用counter測(cè)量每管的輻射強(qiáng)度，并做記錄。
3.從每管中取出8μl跑非變性聚丙烯酰胺膠。(見附錄)通過輻射強(qiáng)度的高低，可看出，從第一管到最后一管，輻射強(qiáng)度顯示出兩個(gè)峰值，前一個(gè)較弱，代表cDNA；后一個(gè)較強(qiáng)，代表未為用于合成cDNA鏈的單核苷酸。保留前一個(gè)峰值處的4個(gè)樣品作為下一步連接反應(yīng)的樣品。
11純化分離出來的cDNA1.加入100μl酚-氯仿2.室溫離心12000rpm 2分鐘，將上清移入新的1.5ml管。
3.加入100μl氯仿。
4.室溫離心12000rpm 2分鐘，將上清移入新的1.5ml管。加入200μl 100％乙醇。
5.-20℃過夜。
8.第二天4℃離心12000rpm 1小時(shí)。
6.棄上清，加入200μl 80％乙醇，室溫離心2分鐘7.棄上清，真空干燥，加5μlddH2O重懸沉淀。
8.取0.5μl樣品進(jìn)行EB凝膠分析，從而估計(jì)cDNA的濃度。(見附錄3)12 cDNA與Lambda ZAP-CMV XR Vector連接1.在0.5ml離心管中加入下列成分試劑 體積resuspended cDNA X，～100ng10*ligase buffer 0.5rATP 0.5Lambda ZAP-CMV XR1.0VectorddH2O XT4 DNA ligase 0.5
Total 52. 12℃過夜或4℃反應(yīng)兩天。
3.如果第二天包裝，從LB四環(huán)素平板挑取XL 1-Blue MRF’單菌落，液體培養(yǎng)。
4.連接結(jié)束后，用Gigapack III Gold packaging extract包裝1μl連接產(chǎn)物。
13準(zhǔn)備宿主菌1.將XL 1-Blue MRF’和XLOLR兩種菌在四環(huán)素平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，37℃過夜。
2.挑取單菌落，10ml液體培養(yǎng)(LB with 0.2％MgSO4，10mM maltose)XL 1-BlueMRF’，30℃過夜。
3. 500g離心10分鐘，棄上清。
4.加相當(dāng)于原培養(yǎng)基體積1/2體積的10mM MgSO4，重懸細(xì)胞。
5.用10mM MgSO4將菌液稀釋到OD600為0.5。
14包裝1.一管packaging extract從-80℃取出，放于干冰上。
2.將裝有packaging extract的管夾于兩指之間，直至packaging extract開始融化。
3.立即加入連結(jié)后的DNA(1-4μl包含約0.1-1.0μgDNA連接產(chǎn)物)到packaging extract，用tip頭迅速攪動(dòng)，直至packaging extract完全融化。稍微離心。
1.室溫(22℃)反應(yīng)2小時(shí)。
2.加入500μl SM buffer和20μl氯仿，混勻，離心。
3.樣品保存于4℃。
15涂板和計(jì)數(shù)1.分別混合下列成分1μl包裝反應(yīng)產(chǎn)物和200μl XL 1-Blue MRF’細(xì)胞1μl稀釋十倍后的包裝反應(yīng)產(chǎn)物200μl XL 1-Blue MRF’細(xì)胞2. 37℃放置15分鐘。
3.加入2-3ml NZY top agar。
4.涂布到NZY agar平板，37℃放置6-8小時(shí)。
16 Lambda ZAP-CMV XR文庫的擴(kuò)增1.用10mMMgSO4將宿主菌稀釋至OD600為0.5。
2.于15ml離心管中混合含有約50000pfu的噬菌體和600μl的宿主菌3. 37℃溫浴15分鐘。
4.制備50mlNZY top agar，融化后保溫于48℃。
5.混合6.5ml NZY top agar和侵染的宿主菌，涂布于NZY agar平板。
6.待NZY top agar凝固，將平板放置于37℃溫箱(6-8小時(shí))，直至看噬菌斑。噬菌斑的直徑控制在1-2mm內(nèi)。
7.將平板表面加入8-10ml SM buffer，保存于4℃過夜。(如果條件允許，可進(jìn)行輕微的搖動(dòng))。
8.將噬菌體懸液倒入50ml離心管內(nèi)，用2ml SM buffer沖洗平板表面，收集到同一個(gè)離心管中。加入氯仿至終濃度5％，混勻，室溫放置15分鐘。
9.離心500g 10min10.將上清移入另一干凈的離心管中。加入氯仿至終濃度3％，保存于4℃，或加DMSO至終濃度7％，用1.5ml離心管分裝，保存于-80℃。
11.測(cè)濃度。
17 pCMV-ScriptEX phagemid的體內(nèi)切離1.挑XL 1-Blue MRF’和XLOLR單菌落，分別于LB with 10mM MgSO4，0.2％maltose和NZY broth中搖床培養(yǎng)，30℃ O/N。
2.離心1000g 10min，用10mM MgSO4重懸細(xì)胞至OD600＝1.0。
3.在50ml離心管中，按一定比例混合lambda phage，XL 1-Blue MRF’細(xì)胞和helper phage。
摩爾比ExAssist helper phageXL 1-Blue MRF’細(xì)胞lambda phage＝100∶10∶15. 37℃溫浴15分鐘。
6.加20mlNZY broth，37℃搖床培養(yǎng)2.5-3小時(shí)。
7.將離心管于65-70℃加熱20min。
8.離心，1000g 10min，將上清移入干凈的離心管中。
9.如果要測(cè)濃度切離下來的phagemid的濃度，取1μl的上清，與200μl的XLOLR細(xì)胞混合于1.5ml離心管中。
10. 37℃溫浴15分鐘。
11.加4μl的5*NZY broth，37℃溫浴45分鐘。
12.取100μl的細(xì)胞混合物，涂布于LB-卡那平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。
二.cDNA(Taget DNA)的制備從已構(gòu)建的6周齡蛋雞骨骼肌(胚胎期18天肉雞骨骼肌)cDNA文庫中隨機(jī)挑取克隆，以文庫質(zhì)粒上的通用引物T7和T3進(jìn)行PCR擴(kuò)增(94℃ 5min預(yù)變性；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 2.5min共40個(gè)循環(huán)；72℃ 7min繼續(xù)延伸；4℃保存)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過異丙醇純化后，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)DL2 000 DNA(0.3ug/μl)和λDNA(0.1ug/μl)分子量標(biāo)準(zhǔn)，篩選出濃度大于0.5ug/μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10752個(gè)，舍棄擴(kuò)增多個(gè)條帶及擴(kuò)增效率低的克隆。
三.cDNA(Taget DNA)的測(cè)序隨機(jī)選取100個(gè)cDNA克隆進(jìn)行測(cè)序，統(tǒng)計(jì)分析文庫的代表性。
(1)將樣品送聯(lián)合基因公司進(jìn)行測(cè)序。
(2)獲得的序列剔除載體序列和冗余序列。
(3)用非冗余序列對(duì)公共表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，將其分類。
四.數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建雞cDNA質(zhì)?？寺∮陕?lián)合基因科技(集團(tuán))有限公司測(cè)序，使用T3引物測(cè)序，去除序列中的載體序列并修正測(cè)出序列中的模糊堿基后，將片段長(zhǎng)度小于100bp的序列視為無效，所有的序列利用DNA TOOLs 5.1(1995-1999，S.W.Rasmussen)進(jìn)行比對(duì)去除冗余序列后得到100條ESTs，將這些ESTs與GenBank數(shù)據(jù)庫(截至2003年5月)用Blastn進(jìn)行搜索，得到的Blast最高分值，概率以及同源序列長(zhǎng)度和功能識(shí)別描述編輯成ESTs數(shù)據(jù)庫。
五.基因芯片的制備(一)PCR產(chǎn)物的純化1.異丙醇純化(1)按體積比1∶1用異丙醇沉淀PCR產(chǎn)物，然后放置15分鐘。
(2)3 200rpm、4℃離心40分鐘。
(3)70％乙醇洗沉淀。
(4)3 200rpm、4℃離心40分鐘。
(5)干燥，加12μl ddH2O溶解沉淀。
(6)取1μl電泳檢測(cè)。
(二)cDNA芯片制備
(1)初步處理DNAa.將5～10μg已純化提取的DNA溶解于50μl的0.1～0.15M NaOH溶液中，并在60～70℃溫度下水浴30～60分鐘；b.加入5μl的溶于異丙醇的0.1～0.2M環(huán)氧丙氧基三甲氧基硅烷；c.在60～70℃水浴鍋中水浴3～5個(gè)小時(shí)；d.加50μl中和液，中和液為0.2M Tris.HCl和1M NaCl的混合液；e.加入200μl的乙醇進(jìn)行純化回收，即完成了DNA的初步處理；(2)點(diǎn)樣前處理DNA將初步處理的DNA加入25μl 45～55mM NaOH溶液中進(jìn)行變性，在所得液體中再加25μl 0.08-0.12M的Tris HCl即完成處理；(3)點(diǎn)樣將產(chǎn)物取體積10μl，然后通過8道加樣器，將樣品轉(zhuǎn)移至Axygen的384孔板，然后利用MicroGridII機(jī)器人進(jìn)行cDNA芯片制備使用的點(diǎn)樣針為0.1mm的實(shí)心針，載體為玻璃片，利用4×4的針列進(jìn)行點(diǎn)樣，控制芯片制備外部環(huán)境，溫度保持在21℃，相對(duì)濕度控制在50-55％之間，并使用軟接觸(softtouch)的功能，嚴(yán)格控制點(diǎn)樣針每次取樣之間的洗針程序；(4)點(diǎn)樣完成后，立刻將玻片放在80℃溫度下干烤2～4小時(shí)；取出玻片，在濃度為80％的乙醇中浸泡，然后將玻片用保鮮膜包住使其密封，再在60-70℃的水浴鍋中水浴4～8小時(shí)；用體積濃度為80％的乙醇清洗至其表面雜質(zhì)清除；用氣流吹干或用550rpm離心機(jī)離心3min，即得本發(fā)明所述芯片。芯片制備過程中利用Amersham的內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)控制試劑盒進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控，包含有靈敏度檢測(cè)控制點(diǎn)，重復(fù)性檢測(cè)控制點(diǎn)，芯片布局均一性檢測(cè)控制點(diǎn)，carryover現(xiàn)象的檢測(cè)控制點(diǎn)。
六.本發(fā)明所述芯片在快速篩選蛋雞和肉雞骨骼肌差異表達(dá)基因研究中的應(yīng)用分別選取相同飼養(yǎng)條件下7周齡雄性蛋雞和肉雞的骨骼肌組織，利用RNeasy RNA試劑盒提取骨骼肌組織總RNA，通過紫外分光度計(jì)檢測(cè)RNA的Ratio值。進(jìn)一步利用Oligotex mRNA Midi試劑盒純化分離mRNA，選取Cy3和Cy5為熒光物，進(jìn)行后標(biāo)記，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)標(biāo)記效率。
探針與雜交液(含50％甲酰胺)均勻混合，平鋪于芯片表面，蓋上Takara的芯片專用蓋玻片，置于42℃避光水浴20小時(shí)進(jìn)行雜交。
取出雜交后的芯片，利用嚴(yán)謹(jǐn)型洗片方法進(jìn)行后處理，自動(dòng)化的洗片機(jī)保證芯片之間的差異程度降到最低，具體過程如下先在250ml預(yù)熱至55℃的1×SSC/0.2％SDS中洗10分鐘；然后在預(yù)熱至55℃的0.1×SSC/0.2％SDS中洗兩次，每次洗10分鐘；在0.1×SSC中室溫洗兩次，每次1分鐘；最后在ddH2O中浸一下(小于10s)；500g短暫離心干燥。
經(jīng)過洗滌后的芯片立刻用Axon4000A型掃描儀進(jìn)行掃描，根據(jù)內(nèi)標(biāo)控制點(diǎn)的信號(hào)調(diào)整激發(fā)光能量，采集數(shù)據(jù)。
通過分析每一個(gè)點(diǎn)陣?yán)锏膬?nèi)標(biāo)控制點(diǎn)來決定芯片的質(zhì)量，再利用差異表達(dá)基因篩選SMA方法分析數(shù)據(jù)，顯著性水平為0.0001。
選取從芯片得到的基因進(jìn)行Northern Blot的驗(yàn)證，將EST進(jìn)行同位素標(biāo)記，雜交蛋雞和肉雞的RNA。
序列表(1)SEQ ID No.1的信息(a)序列特征長(zhǎng)度211個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.1GGCACGAGGAATTCTTTAGCAAAGGAAGTTTGAAATCAGTTACCCAAGAGCTGTTATCCCCGATCTCCGCATCTGGGATGGAAAATGCAGGATGCAGTCGGGTGAAATGCAGTGCTTTCACGTCACTGTGCCATACTTCCCATCAGCAGAGGCCCGAAAGTGGTTACAATGTGTGAAATACAAGTTAAGATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(2)SEQ ID No.2的信息(a)序列特征長(zhǎng)度678個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.2GGCACGAGGTGAAAAGATGACCCAAATCATGTTTGAGACCTTTAACGTGCCCGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCTGTGCTGTCCCTGTATGCCTCTGGCCGTACCACCGGTATTGTGCTGGACTCCGGCGATGGTGTGACACACAAC
GTCCCCATCTATGAAGGGTATGCCCTGCCCCATGCCATCATGCGCTTGGATCTGGCTGGCCGCGACCTCACTGACTACCTGATGAAGATCCTGACTGAGCGTGGCTATTCCTTTGTCACCACAGCTGAACGTGAGATTGTCCGTGACATCAAGGAGAAGCTGTGCTATGTGGCTCTGGACTTTGAGAACGAGATGGCCACCGCTGCCTCCTCCTCCTCCCTGGAGAAGAGCTATGAGCTGCCTGATGGGCAGGTCATCACCATCGGCAATGAGCGTTTCCGCTGCCCAGAAACCCTCTTCCAGCCTTCCTTCATTGGTATGGAGTCCGCTGGGATCCATGAGACAACTTACAACAGCATCATGAAATGCGACATTGACATCAGGAAGGACCTGTATGCCAACAACGTCATGTCTGGGGGTACCACCATGTACCCANGTATTGCTGACCGCATGCAAAANGAGATCACAGCCCTGGCCCCCANCACAATGAAGATCAAGATCATGGCCCCACCTGAGCGCAAGTACTCTGT(3)SEQ ID No.3的信息(a)序列特征長(zhǎng)度382個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.3GGCACGAGGCTCCCCACTTGTCATACGTACCCCAGTGGCAGCATCCCTGGTGCAGGATCGAGGCCGGTTCTGTAGTCAGCAATGGACGGGCAGTGGTGCTCACACTGCGAAGTAAAGCTCCCTGCACTGGGTCTAGCCTCTTTTGTCTTGCCGCAGAGCACGGGTAACACCGTTGCCACTCTAAACGTGGCAGTGGTGGAATCTGAAACTGTCTCGCTGCAGTCTGGCAAAGGAGGGAAGGGAGCGTGGTGTGCTCTGGGGCCCTGGTGCTTTGTTGTTGGGCCGTTGTAAAATAATGGGGTACACATGTGTCCACCTTGGCAACTGGGGGTGCTCAAGTGCAATAAAGCAAGAAGGACTGGCCTAAAAAAAAAAAAAAAAA(4)SEQ ID No.4的信息(a)序列特征長(zhǎng)度641個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.4GGCACGAGGCCCGGCTCCCGTGGTCTACTTCGTGGATTACGCGTCCAACTGCATTTATCTGGAAGATATCGTTGGCGCGATCGCTGTTCAGGATCACATCTACTCCGTGCAGCGGAGCGGCAGCGATGCCAGCAGCCTCCTCGGCTTGGCGGAGAAGATGGGCCAGCTGCTGGCCAGGATGCACGACGAGGACCTCATCCACGGGGACCTCACGACGTCCAACGTGCTGCTGCGGCCGCCCGCGGAGCGGCTGGACTTGGTGCTGATTGACTTTGGGCTCAGCTTTATTTCGGGTCTTCCCGAGGATAAAGGAGTCGATCTGTACGTGCTGGAAAAAGCCTTCCTTAGTACCCATCCCGATACGGAAACTGTGTTTCAGGCTCTGCTGCAGAGCTACGCGGCCGCCTCTAAGAAATCCGGCCCGGTGATCAAACGTCTGGATGAGGTGCGGCTCAGGGGGAGGAAGAGGTCCATGATTGGGTAACAGCAGGCGGTGACGGAGAAATCTGATGGAGAAATTGGTTCTGCCAAAGGGGGTTATTTATACTGCCGGTTACTTTGGTTGCACAGATGGCTCTTTTGATAGCAGTGCCTCGTATGAAATAATCGGGATTTCTAACCGTTAAAAAAAAAAAAAAAAA(5)SEQ ID No.5的信息(a)序列特征長(zhǎng)度430個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.5GGCACGAGGGCAGGGCAGGACAGAGGCAGTTCTGGACGTGAACAGAACTGAATGGCAGAGCAACAATAAGGAAACAATTGTCATCGGGTTTGACTTGACAGAAACACTAAACTTAGGAAGTTATCAATCACAACTCTTGTTTTCTAAGGAATATCAAGGCAAAAATTACATTGCTGCTTTAAATTCACTGTAATACGATGAGGCCGTTGTCACATTTAAAAAATTACCTGTTTGATTTTTCTGTTGAATTACGTGTTTCCTTCTGCTCAAGTAAAATAAGTGTTTCATGTGAATGCAA
CCTTCTGCACTGTGGTCATCATTTCTTACAGGAATGTAGAACTGTGAACCATCTGTACCCTTTTATTACTTTACCAAGGTCAAATAAACTGGTGTGACTTTTGTAAGCGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(6)SEQ ID No.6的信息(a)序列特征長(zhǎng)度573個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.6GGCACGAGGGTTTCTCCAGGTACTGTGTAGGACATTGTGTCTGTGATTGGTACCATTTCACCGAGTCAAATGGGAGAGGGGGAAAAGTAACTTGAAGCCATGTTCAAGCCATTAGCTTGAACATAACTTATGGCAACTTGCTGATGCTCAGAAGGTAACTAAAAAAGGACTTCAGAGCATGCAAGGAGATGGGGAAGACTAACAGACATGGAGCAATGTGCTACTCCGGTCTCAGTTGGCAGAACAAAGAGATTCCACTCTTGTTCCGCTTCTTTATGTTTTTTCTAGTCTTCTCCAGCCATCAGTGGAGGTAGAAGGAGGTTCTGAAGGCATTAAGCTGATGTTTCTCCAGACAAAAGGGTGTCTGATATGTTTCCTCACCTAAGGGAGCTGCAGGTATGGTGCTACAAAGCACTTCAGAGGGAAAAGGGAGGTGGTGCAGGTCAGACCTGGGGGGCTCTGAGGAGTTCCCACGTGGTGAAGGTCATAGGGATGAGACAGTTAAAAGAAAAAAGGCATGTGAGCACAGCTGGCAGAAATTCCTCCAACACTGCAATGAACAGGAAAAAAAAA(7)SEQ ID No.7的信息(a)序列特征長(zhǎng)度666個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞
(d)序列描述SEQ ID No7GGCACGAGGAAGTGTTTGGGTTGGGTAGATGGGTGTGGGGATATGAATTCTTAGGATTTGCTGTTGTTGTAGGCTTCCACAAATCAGTGTGTTTTGCAGACAGTTTTCCTTCAGGTTTAAAAGTACAAGTCTGATGTCTGAACTTGGAGTAACCTTTGTTTCCGTCTCTCTTTGCTTTGGGCTGCCATCATTCTATGAATGTATCCCTGAAAACAATTCTTAGAGCTCCTATTCCACAGCAAACCTGCCTCATTGTAACTTCTGATTAAATGTGTTGTAAGAGGTGGAAGTGAGAGTGACCACACGTGTAAGACTCCTTTTTCTAGGCTATTAATCCTGGAAAACGGTTGTTGAATACAAGGTTTAATCTCGGTCTCTTAGAAAGCTGTGTTCCCTGTACATGGATGAGGGAGAGTGCAGGTCAGTAGTTCTGAACAATAAAGAGTTGTATTAGTCTATTGGCCGAGCTGGCCGTAGTAAGAGAATGCTGCGTCTTAGTACTGTTATCCGGAGTCACTGAAACTCTGAAGTATGAGCTTACTGCAGAGAACTTCAGTTACTTCATATTTTGCTGCAGCAGGACCTCTTTTTAGCTTGAAAATAACTGCTTATGAACAAGTAAACTTTTTTTGAAGTTGGGTGGGAGTTTCAATGGAGAAAAAAAAA(8)SEQ ID No.8的信息(a)序列特征長(zhǎng)度511個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.8GGCACGAGGGGATAATAGCTTGCGTGCTTTCTGTTACCACAGAAGTCTTAGAAGGATTTTGGTGAAAATACGTATTCAGTCCTTGTGGATGCAGGTCATTCTCGAGGGGATTTTTTTCATTCTGGTTGTTAAGTGTGCTTTAATGATGCTTTTCAAGGATACCTGATTTTAGTCAGAGTAGCACTTTGACATATAAGGAATATTTAAATATATTTTGAAAGACATTTTGCAACTTTCCTAACATCAGAATTGTAAGTTGAACTACGCTTTCTCCTGTCACCTCTTGTTTTCTACATTGAGCTAACAGGAAAGAGGGCAGTTCTCTGTGTTTTCATCATTCCATTCAAGCATGACTGAGATGAATTAAAAAGCTTTAATTTTGCTAAACTATTTCAGATCACTTTT
GTTTTGCAATTCAGATAGCCCAGATTATTTGTTTAAACCTTTTTTTTTTCTTTTACATTAAATGATCTGACAGAGAGCAACGGGCTTCTTCAGTTTAAAAAAAAAA(9)SEQ ID No.9的信息(a)序列特征長(zhǎng)度525個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.9GGCACGAGGGTTTTTAGTTTGATATTTTACCATGCTAAAATGGGAGGTCTGCCCAACCGTGTACTGGATTCTTGTTTCCTTTAAAAGATTGTTTAGTACAGCACTCACTGCATTGTGTACTAGTGCTAAAACTAACACTGTATCTTATGAAATTCTTCAGCTTTAAAAAAAAATTAACCTGATTACTATTACATTTGTTTAGCTGTGCCCGCTGACCTTGTCAGATTCAGTTGGCTATTTGTACAATTTCATTTTCTGTAACTGTTAAGAAACTTGTACAGCTAAAACAAAAACAGAACCTATGGACAACAGCCTCGGAGGTACCAGTTCTGCTTCAGCAATCAAGACGACAGCTAGCTCACCAAGCGACTACATTGCTAAAGAGACTGTAAAACCTCTGTTGTGGATTGTCCATAAAATGGCATTCCGACATGTGCCTTATTTGCTGGATAGTATGCAGCTTTCCTCTAGTATTCTAGCATTTTAATGCTGTATTAAAATAATGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(10)SEQ ID No.10的信息(a)序列特征長(zhǎng)度380個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.10
GGCACGAGGGAGCGGCGGCGGCAGCTACGGCGGAGGGAGGAGGTTCTGACGCCCGCAGGAAACAAAGCTTAGCAGGAGAGGAGAGCCAGAGAGAAGGGACAGGGCAAAGCTGCAGGTTACCCGAGCTGTGAACTCAGCCAGCTGACAGCTGTGGCGGGGGGGGTGGCTGCGACGTCAAGACGTGCATTAGCCAGAAGTCTCCTTTGCGAACAGGACTGTAATTGTGACTCATTGTATAACAGGTTCTTTTAGTTTTCTGTGCCGTGGAAGCATTCCTTCAAACGAGGGCTCCCGGGAGCCTCGGTTTTATTTGCGCGCCCGTGCTGTCGATCGATCGCTGACTGTAACAGGAAATGACGCTGAATAAATGTGTCCTTTGG(11)SEQ ID No.11的信息(a)序列特征長(zhǎng)度707個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.11GGCACGAGGCTGGAATGGAGTGGCCCTGCCCCGGAGTGCAGGGCGGTTCACTGCCCCAAGCCCGTGGTTGAGAATGGAGAGATGGTTACGCTGAGGCACACGTTCCCCTATGGGACATCTGTGAGCTTCTACTGCAAGGAGGGCTTCATGCTGCGCGGCAGTGCTGAGAGCCGCTGCGTGGCTGATGGCACCTGGCAGCCAGCCCTGCCCAAATGCCAGCCAGTTAAGTGTTCTGCACCAAGGAGCAAGGAGAACCTACAATTTTTCCCTGTGAAGGGGGAGTACGAGTTTAAGGAATCTCTGTACTTCTCCTGCAAGCTTAACAACAATGCAGCAGACAGGGCATTAACCACCTGCTCTACTGGCGGCTCTTGGATGCCACCACCCAACTGTAAAACATTTTACGTACGCAAGAAGATTGATCAAATAAAGGAAACTTTTGATTGCGGATTGCCTCTGGCAGAACTGAGAACTCTGCTGGAAGTACAGAAGCTCTACCTGGAGATCCAGAAGCTGGAGAAGGAGCTGGGAGCCAAAGGAAGCCGCTGGTGGCCGTGACTGGTNTTGTGGTGGGCATAGCANTCANTGAAGGAACAGATTTGGATCATAGGAGGAATCGGAGTCCTTTGGCTCATTCNGGCANAGCTCNCTGCGTTAGGNTNGNGCATCACTTTNTGCCTTTTAAGCTTTACATTTNNGGCTGNTTC
(12)SEQ ID No.12的信息(a)序列特征長(zhǎng)度714個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.12GGCAGAGCGGGGCTGAGCCCAGCGGGGACACAGAGCAGCCGAGGGGGGAAAGGGGCCCTCTGTGCAAAGCCCCACACGCTGTGGGGTTCTCCTCCTCCTCTTCCTCCCCACACTGCACGGCTCCACCATGGAGTACATCATAGGGATCGGAGGCGTCACCAACGGAGGCAAAACCACGCTGACCAACAGGATCGTCAAGGCGCTGCCCAACTGCTGCGTCATCCACCAGGACGACTTCTTCAAGCCTCAAGATCAAATAGAAGTCGGGGAGGACGGCTTTAAGCAATGGGACGTCCGTTAACCTTTTGAACCCGTGCGGGTGGCGGCGTTTGATGGGGACCCTCTCTCCCACCCACCCCTCAGTGTTGGACTCGCTGGATATGGAGGCCATGGTGAGCACGGTGCGTGCCTGGATGGAGAACCCAGTCAAGTTCGCCCGTTCCCATGGGGTGAACGTCACGCCCGACCCTACAGAGCCTCCCTCCAAAGAGCCCCACATTCTGCTCATCGAAGGCTTCCTGCTTTACAACTACAGACCCCTCATGGAGCTCTTCGACCTCCGCTACTTCCTGGCAGTGCCGTACGATGAGTGCAAACGGAGGANGAGTACACGCAGCTACACCGTCCCCGACCCCCCCGGCCTNTTCNATGGCCACGTGTGGCCCATGTACCTGAAGCACCGGAAGGAGATGGAGGACANCGGGGTCNATGTCT(13)SEQ ID No.13的信息(a)序列特征長(zhǎng)度519個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.13
GGCACGAGGACAAATACTAAAACAGTATTTGCTCATCTGGAATAGTCAAGCAAATGACTTTTTAAAAAAAGCACCCTTTAATTTTATTTTATTTTTAAAATACAGATTTTATTACAGCTACTTATGTGTCTACTTTGTATTAAGAACTGCAAACGATTTTAGCAGTATAAACTATTGTTCAGGAAACAGTCATTTTATGGTAGCTATAACTTTGCAGAAGATTTCAGTCTTATTGCGTATCTTCAGTGTGCTCTGAAACATAACTGTATATGTATGCTACACAAACTGACATACTTAATGTTTCCAGCAGTGTGGTAATTGACATTTGTATTGGGCTGTGGCCACAAAGGCAAACAATAGTTTTATTTCCATTCGAACTGCTGAAGACAACAACATCAGATACTTTGGAATGACTAGATATACGTGTCTAACGAGCAGAAGCCATATGTTTGGCTTCTGAATGTTGTAACTTATTAATAAATCTGATATTGATTTCAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(14)SEQ ID No.14的信息(a)序列特征長(zhǎng)度207個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.14GGCACGAGGTGGGCACTTGGGGGGCAGCCCAACAGCACGGAAAGGCCTCAGCCCCTGTGACCCACAGAGCGGGGGGGGGAGGGCGCACGTGGCGCGCGCTGTCGCTGCTGGGGGCGCTGCCTGGCCGTGGCNCTCTGCATGGCCAANGTGATGCTNCNTTCTTCGCNNCCANCNNCCNGCTCGCCTCNCATTCGTGCCNTNCCNCCC(15)SEQ ID No.15的信息(a)序列特征長(zhǎng)度648個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞
(d)序列描述SEQ ID No.15GGCACGAGGCCGCCGAGAAGGGCGGAAGTGGGGGCGCGGGGCCCGGCGGCATGGAGGGGACCCTGGAGCAGCACCTGGAGGACACCATGAAGAGCCCGGCCGTGGTGGGCGTCCTCTGCACCGACTCGCAGGGCCTCAACCTGGGATGCCGAGGAACGCTCTCAGATGAACATGCTGGAGTCATCTCTGTGCTCGCCCAGCAGGCAGCCAAGCTCACCTCCGACCCAACCGACACGCCCGTGGTGTGCCTGGAGTCGGACAGCGGGAACATCATGATCCAGAAGCATGACAGCATCACCGTAGCAGTGCACAAGCTGGCATCCTGACCCTGGCATCCTGATACTCCACTCCCTGCTCCAGACCAGCTCCTCCTCCCTGAACAACTGCTCTCCTCAGCTGTTCCAATGCAGAACATGCTTCTAGTACCAAATCTGGGCTGAAGGCTCTCCCTCTCTACTTACCAGCTCCTACGCATCTATCAGGGTTTCCAGCTCACATTTTAGCAGTCATGCTGTTAAAGATGAAATGTGAGTCACTCACCAAGCTCGTGTCATGATAGATACTACAAGGTGTGTGTGTGTGTGNGCCCCTTGTGGCCTTATTTGTTGGAGAAATCAATAAATANCCTGCAAAAAAAAAAAAAAAAAA(16)SEQ ID No.16的信息(a)序列特征長(zhǎng)度723個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.16GGCACGAGGGTCTACTATGAATAGCAAATGTTTTTTTAATAGCAATAAGAAAAAACTAGATCTACCTTTTTTGTTCTAAAGGCTTTTTTGGGGGGTAGATTTCTCAATGGAAAATAAAGTCCTACTCTGTTTATTTATTTCAAATAGGAAGTTCAGAAGTAATGATGATAATTACTGAGCATATTGACTTAAATACTGCATTGAGGCAACTCTTACCCCATTGAATAAGCTGCAATCACCAAAGGTCACCAGTTCAGGAGTATTTTCACTCACTCAGTGAATGAAATGGATAACAAAACTGAAATATCTTTGTCTAGAAAATACAGGTGTGAAAAATCTGCTTTCACTGCCATAATATACTTGAATACTTTGACCTTGTATTGAATATAAGGTCACAAAAATATGCCTAGATAGTTATTAAGTAAACACAATACCTCTTTGTCTGCACTCAGTA
ATGCTTGAATGTGATTTACAATCTTCTGATAGACTGTAGATCTGTAACACAGCTTCAGCTACTGCAGGTTGAAGCTGTAATGTCTATTTTAAAAGCATCTGAAGCATGTGGGCGCTGTAAATGAATGTCTGTAATAGTGCTTGCAAATAGCAGCTTTCTGGATAAGTATAATCTCGAAGTTGTATATGCAGAACATACAATGAANACCGTGTGTAGCACTTAANGAAACCTTATGGAGTCTCCTTTAGTATTAAAAACTTGTTAANGGC(17)SEQ ID No.17的信息(a)序列特征長(zhǎng)度350個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.17CAGGTAATAAAACCTTCTGGCAAGCCTAACATAGGAAGGTAAGAACTAGCATCTCCCTCCTGTGCCAGGCATCAGGCAGCTTGATCATTTCTAGCCAGACTGAACATACAGAAGCAGGAACAGTAGCAAGAAATCTGAACCTTCATCTCATCTGGGCATGCAGCCACCCTCATAACTGGGTTAGAGTCTGTGAGCTGACACCCACTCCTGAATTTCTATACTACAGGTGCTGAAATGCAGCAGAAAGTAGATTTCCAGAATAAGCTCTTTGTACAGAATATGACAATCTCATCATTCAACTGTCAGACACATTTGTTCACAAGCATAAATTAATTAATAAATCTTTGTCA(18)SEQ ID No.18的信息(a)序列特征長(zhǎng)度248個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.18CGTATAGTACTGTATAAACCAGTTTGCTGTCTTGTTGTTATTATTATTGTTTTTTAAAGGAAGCGTCCTCCTTGAAGAATTGCCTTTTAGTAACGCAGACTG
TATTATAGTCCCTCTGTCACCACATCCATCGCTTGTCTTTTTTGATTTCCAAACGCCTCCGATGTTACCGACCAGGAAGGAAGGTGCCCACCCAGGGGATGCTGTTGGGAGGGGGCGCAGGGATTAATAAAGCCAGCTTTCCTTCC(19)SEQ ID No.19的信息(a)序列特征長(zhǎng)度449個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.19GCATTGAAGGATATCCCACCTGTAAAGAGAAAGTGAAGAGGAGGCCGGGTGGTCGCTCAGAAGTGATCTACAACTACGTTCAGCGGCCGTTCATCCAGATGTCCTGGCAAAAGGAGGAGGGGAAAAGCCGTCACGTTGACTTCCAGTGTGTCCGGAGCAAATCTCTAACAAACCTGGTCACTGTGGGTGATGACGTTTCAGAGGACCATGAGGTTATAATGCATCACCCCCCACAGGTAGATGAACTGGATAGGCTAAATGCACCATTCTCCCAGATGGCCGTTAATGATCTACCTGATTAGTCATGGCTCCAGCTTGATGTGGGAACATCTCGGCATAGTTTCATCCTAGTAATGGAACACAGACTCCTTGCAAGGTGCTTTATCCTCATTCATCCTCTTACTATGTTGTCATATTTCAAGCATGTTAATAAAGAGCCACACTCCTTA(20)SEQ ID No.20的信息(a)序列特征長(zhǎng)度94個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源雞(d)序列描述SEQ ID No.20CTGTGTCCAACAATCGTTTATTTACCAAACCATTGTAGCAAACACCATTCGACGCGTAGAAAGAAGGCCCGTGATAAAAACTAAAATGGAAGTT。
權(quán)利要求
1.一種雞骨骼肌表達(dá)序列標(biāo)簽基因芯片的制備方法，其特征在于它的制備過程如下(1)初步處理DNAa.將5～10μg已純化提取的DNA溶解于50μl的0.1～0.15M NaOH溶液中，并在60～70℃溫度下水浴30～60分鐘；b.加入5μl的溶于異丙醇的0.1～0.2M環(huán)氧丙氧基三甲氧基硅烷；c.在60～70℃水浴鍋中水浴3～5個(gè)小時(shí)；d.加50μl中和液，中和液為0.2M Tris.HCl和1M NaCl的混合液；e.加入200μl的乙醇進(jìn)行純化回收，即完成了DNA的初步處理；(2)點(diǎn)樣前處理DNA將初步處理的DNA加入25μl 45～55mM NaOH溶液中進(jìn)行變性，在所得液體中再加25μl 0.08-0.12M的Tris HCl即完成處理；(3)點(diǎn)樣將產(chǎn)物取體積10μl，然后通過8道加樣器，將樣品轉(zhuǎn)移至Axygen的384孔板，然后利用MicroGridII機(jī)器人進(jìn)行cDNA芯片制備使用的點(diǎn)樣針為0.1mm的實(shí)心針，載體為玻璃片，利用4×4的針列進(jìn)行點(diǎn)樣，控制芯片制備外部環(huán)境，溫度保持在21℃，相對(duì)濕度控制在50-55％之間，并使用軟接觸(softtouch)的功能，嚴(yán)格控制點(diǎn)樣針每次取樣之間的洗針程序；(4)點(diǎn)樣完成后，立刻將玻片放在80℃溫度下干烤2～4小時(shí)；取出玻片，在濃度為80％的乙醇中浸泡，然后將玻片用保鮮膜包住使其密封，再在60-70℃的水浴鍋中水浴4～8小時(shí)；用體積濃度為80％的乙醇清洗至其表面雜質(zhì)清除；用氣流吹干或用550rpm離心機(jī)離心3min，即得本發(fā)明所述芯片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述雞骨骼肌表達(dá)序列標(biāo)簽基因芯片的制備方法，其特征在于復(fù)合在玻片上的DNA序列如下GGCACGAGGAATTCTTTAGCAAAGGAAGTTTGAAATCAGTTACCCAAGAGCTGTTATCCCCGATCTCCGCATCTGGGATGGAAAATGCAGGATGCAGTCGGGTGAAATGCAGTGCTTTCACGTCACTGTGCCATACTTCCCATCAGCAGAGGGCCGAAAGTGGTTACAATGTGTGAAATACAAGTTAAGATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述雞骨骼肌表達(dá)序列標(biāo)簽基因芯片的制備方法，其特征在于復(fù)合在玻片上的DNA序列如下GGGACGAGGTGAAAAGATGACCCAAATCATGTTTGAGACCTTTAACGTGCCCGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCTGTGCTGTCCCTGTATGCCTCTGGCCGTACCACCGGTATTGTGCTGGACTCCGGCGATGGTGTGACACACAACGTCCCCATCTATGAAGGGTATGCCCTGCCCCATGCCATCATGCGCTTGGATCTGGCTGGCCGCGACCTCACTGACTACCTGATGAAGATCCTGACTGAGCGTGGCTATTCCTTTGTCACCACAGCTGAACGTGAGATTGTCCGTGACATCAAGGAGAAGCTGTGCTATGTGGCTCTGGACTTTGAGAACGAGATGGCCACCGCTGCCTCCTCCTCCTCCCTGGAGAAGAGCTATGAGCTGCCTGATGGGCAGGTCATCACCATCGGCAATGAGCGTTTCCGCTGCCCAGAAACCCTCTTCCAGCCTTCCTTCATTGGTATGGAGTCCGCTGGGATCCATGAGACAACTTACAACAGCATCATGAAATGCGACATTGACATCAGGAAGGACCTGTATGCCAACAACGTCATGTCTGGGGGTACCACCATGTACCCANGTATTGCTGACCGCATGCAAAANGAGATCACAGCCCTGGCCCCCANCACAATGAAGATCAAGATCATGGCCCCACCTGAGCGCAAGTACTCTGT。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述雞骨骼肌表達(dá)序列標(biāo)簽基因芯片的制備方法，其特征在于復(fù)合在玻片上的DNA序列如下GGCACGAGGCTCCCCACTTGTCATACGTACCCCAGTGGCAGCATCCCTGGTGCAGGATCGAGGCCGGTTCTGTAGTCAGCAATGGACGGGCAGTGGTGCTCACACTGCGAAGTAAAGCTCCCTGCACTGGGTCTAGCCTCTTTTGTCTTGCCGCAGAGCACGGGTAACACCGTTGCCACTCTAAACGTGGCAGTGGTGGAATCTGAAACTGTCTCGCTGCAGTCTGGCAAAGGAGGGAAGGGAGCGTGGTGTGCTCTGGGGCCCTGGTGCTTTGTTGTTGGGCCGTTGTAAAAMGGGGTACACATGTGTCCACCTTGGCAACTGGGGTGCTCAAGTGCAATAAAGCAAGAAGGACTGGCCTAAAAAAAAAAAAAAAAA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述雞骨骼肌表達(dá)序列標(biāo)簽基因芯片的制備方法，其特征在于復(fù)合在玻片上的DNA序列如下GGCACGAGGCCCGGCTCCCGTGGTCTACTTCGTGGATTACGCGTCCAACTGCATTTATCTGGAAGATATCGTTGGCGCGATCGCTGTTCAGGATCACATCTACTCCGTGCAGCGGAGCGGCAGCGATGCCAGCAGCCTCCTCGGCTTGGCGGAGAAGATGGGCCAGCTGCTGGCCAGGATGCACGACGAGGACCTCATCCACGGGGACCTCACGACGTCCAACGTGCTGCTGCGGCCGCCCGCGGAGCGGCTGGACTTGGTGCTGATTGACTTTGGGCTCAGCTTTATTTCGGGTCTTCCCGAGGATAAAGGAGTCGATCTGTACGTGCTGGAAAAAGCCTTCCTTAGTACCCATCCCGATACGGAAACTGTGTTTCAGGCTCTGCTGCAGAGCTACGCGGCCGCCTCTAAGAAATCCGGCCCGGTGATCAAACGTCTGGATGAGGTGCGGCTCAGGGGGAGGAAGAGGTCCATGATTGGGTAACAGCAGGCGGTGACGGAGAAATCTGATGGAGAAATTGGTTCTGCCAAAGGGGGTATTTATACTGCCGGTTACTTTGGTTGCACAGATGGCTCTTTTGATAGCAGTGCCTCGTATGAAATAATCGGGATTTTCTAACCGTTAAAAAAAAAAAAAAAAA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述雞骨骼肌表達(dá)序列標(biāo)簽基因芯片的制備方法，其特征在于復(fù)合在玻片上的DNA序列如下GGCACGAGGGCAGGGCAGGACAGAGGCAGTTCTGGACGTGAACAGAACTGAATGGCAGAGCAACAATAAGGAAACAATTGTCATCGGGTTTGACTTGACAGAAACACTAAACTTAGGAAGTTATCAATCACAACTCTTGTTTTCTAAGGAATATCAAGGCAAAAATTACATTGCTGCTTTAAATTCACTGTAATACGATGAGGCCGTTGTCACATTTAAAAAATTACCTGTTTGATTTTTCTGTTGAATTACGTGTTTCCTTCTGCTCAAGTAAAATAAGTGTTTCATGTGAATGCAACCTTCTGCACTGTGGTCATCATTTCTTACAGGAATGTAGAACTGTGAACCATCTGTACCCTTTTATTACTTTACCAAGGTCAAATAAACTGGTGTGACTTTTGTAAGCGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述雞骨骼肌表達(dá)序列標(biāo)簽基因芯片的制備方法，其特征在于復(fù)合在玻片上的DNA序列如下GGCACGAGGGTTTCTCCAGGTACTGTGTAGGACATTGTGTCTGTGATTGGTACCATTTCACCGAGTCAAATGGGAGAGGGGGAAAAGTAACTTGAAGCCATGTTCAAGCCATTAGCTTGAACATAACTTATGGCAACTTGCTGATGCTCAGAAGGTAACTAAAAAAGGACTTCAGAGCATGCAAGGAGATGGGGAAGACTAACAGACATGGAGCAATGTGCTACTCCGGTCTCAGTTGGCAGAACAAAGAGATTCCACTCTTGTTCCGCTTCTTTATGTTTTTTCTAGTCTTCTCCAGCCATCAGTGGAGGTAGAAGGAGGTTCTGAAGGCATTAAGCTGATGTTTCTCCAGACAAAAGGGTGTCTGATATGTTTCCTCACCTAAGGGAGCTGCAGGTATGGTGCTACAAAGCACTTCAGAGGGAAAAGGGAGGTGGTGCAGGTCAGACCTGGGGGGCTCTGAGGAGTTCCCACGTGGTGAAGGTCATAGGGATGAGACAGTTAAAAGAAAAAAGGCATGTGAGCACAGCTGGGAGAAATTCCTCCAACACTGCAATGAACAGGAAAAAAAAA。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述雞骨骼肌表達(dá)序列標(biāo)簽基因芯片的制備方法，其特征在于復(fù)合在玻片上的DNA序列如下GGCACGAGGAAGTGTTTGGGTTGGGTAGATGGGTGTGGGGATATGAATTCTTAGGATTTGCTGTTGTTGTAGGGTTCCACAAATCAGTGTGTTTTGCAGACAGTTTTCCTTCAGGTTTAAAAGTACAAGTCTGATGTCTGAACTTGGAGTAACCTTTGTTTCCGTCTCTCTTTGCTTTGGGCTGCCATCATTCTATGAATGTATCCCTGAAAACAATTCTTAGAGCTCCTATTCCACAGCAAACCTGCCTCATTGTAACTTCTGATTAAATGTGTTGTAAGAGGTGGAAGTGAGAGTGACCACACGTGTAAGACTCCTTTTTCTAGGCTATTAATCCTGGAAAACGGTTGTTGAATACAAGGTTAATCTCGGTCTCTTAGAAAGCTGTGTTCCCTGTACATGGATGAGGGAGAGTGCAGGTCAGTAGTTCTGAACAATAAAGAGTTGTATTAGTCTATTGGCCGAGCTGGCCGTAGTAAGAGAATGCTGCGTCTTAGTACTGTTATCCGGAGTCACTGAAACTCTGAAGTATGAGCTTACTGCAGAGAACTTCAGTTACTTCAATTTTGCTGCAGCAGGACCTCTTTTTAGCTTGAAAATAACTGCTTATGAACAAGTAAACTTTTTTTGAAGTTGGGTGGGAGTTTCAATGGAGAAAAAAAAA。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述雞骨骼肌表達(dá)序列標(biāo)簽基因芯片的制備方法，其特征在于復(fù)合在玻片上的DNA序列如下GGCACGAGGGGATAATAGCTTGCGTGCTTTCTGTTACCACAGAAGTCTTAGAAGGATTTTGGTGAAAATACGTATTCAGTCCTTGTGGATGCAGGTCATTCTCGAGGGGATTTTTTTCATTCTGGTTGTTAAGTGTGCTTTAATGATGCTTTTCAAGGATACCTGATTTTAGTCAGAGTAGCACTTTGACATATAAGGAAATTTAAAATATTTTGAAAGACATTTTGCAACTTTCCTAACATCAGAATTGTAAGTTGAACTACGCTTTCTCCTGTCACCTCTTGTTTTCTACATTGAGCTAACAGGAAAGAGGGCAGTTCTCTGTGTTTTCATCATTCCATTCAAGCATGACTGAGATGAATTAAAAAGCTTTAATTTTGCTAAACTATTTCAGATCACTTTTGTTTTGCAATTCAGATAGCCCAGATTATTTGTTTAAACCTTTTTTTTTTTCTTTTACATTAAATGATCTGACAGAGAGCAACGGGCTTCTTCAGTTTAAAAAAAAAA。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述雞骨骼肌表達(dá)序列標(biāo)簽基因芯片的制備方法，其特征在于復(fù)合在玻片上的DNA序列如下GGCACGAGGGTTTTTAGTTTGATATTTTACCATGCTAAAATGGGAGGTCTGCCCAACCGTGTACTGGATTCTTGTTTCCTTTAAAAAGATTGTTTAGTACAGCACTCACTGCATTGTGTACTAGTGCTAAAACTAACACTGTATCTTATGAAATTCTTCAGCTTTAAAAAAAAATTAACCTGATTACTATTACATTTGTTTAGCTGTGCCCGCTGACCTTGTCAGATTCAGTTGGCTATTTGTACAATTTCATTTTCTGTAACTGTTAAGAAACTTGTACAGCTAAAACAAAAACAGAACCTATGGACAACAGCCTCGGAGGTACCAGTTCTGCTTCAGCAATCAAGACGACAGCTAGCTCACCAAGCGACTACATTGCTAAAGAGACTGTAAACCTCTGTTGTGGATTGTCCATAAAATGGCATTCCGACATGTGCCTATTTGCTGGATAGTTGCAGCTTTCCTCTAGTATTCTAGCATTTTAATGCTGTATTAAAATAATGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
全文摘要
雞骨骼肌表達(dá)序列標(biāo)簽基因芯片的制備方法，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域?，F(xiàn)有的cDNA芯片的制備方法存在成本高、玻璃片修飾基團(tuán)不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。本發(fā)明的制備過程包括初步處理DNA、點(diǎn)樣前處理DNA、點(diǎn)樣、制備等過程，通過上述過程即得本發(fā)明所述基因芯片。本發(fā)明的制備方法具有以下優(yōu)點(diǎn)1.規(guī)模大可以同時(shí)對(duì)10000個(gè)以上的基因進(jìn)行檢測(cè)；2.速度快芯片的雜交反應(yīng)可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成；3.效率高；4.安全性高避免了同位素等物質(zhì)的污染；5.靈敏度高可檢測(cè)豐度差幾個(gè)數(shù)量級(jí)的表達(dá)情況；6.相對(duì)成本低；因此，cDNA芯片技術(shù)具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢(shì)，能夠勝任蛋雞和肉雞的骨骼肌差異表達(dá)基因的大規(guī)模分析。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1594595SQ20041004366
公開日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2004年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月30日
發(fā)明者顧雪鋒, 朱大海, 趙心怡 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)