專利名稱：用a－fabp基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標(biāo)記方法
(一)、所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬于動(dòng)物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種用分子標(biāo)記檢測(cè)雞腹脂量的方法。
(二)、背景技術(shù)快大型肉雞體脂(尤其是腹脂)蓄積過多已成為一個(gè)突出的問題。肉仔雞體內(nèi)沉積過多的脂肪有諸多不利(1)明顯降低飼料轉(zhuǎn)化效率，因?yàn)槌练e單位重量的脂肪組織比沉積單位重量的瘦肉多消耗三倍的能量；(2)降低了胴體瘦肉對(duì)脂肪組織的比例，因而降低了分割肉產(chǎn)量；(3)加工者和消費(fèi)者將肉仔雞體內(nèi)沉積的這些脂肪的很大一部分(腹脂墊、肌胃周圍脂肪、嗉囔脂肪及腸系膜脂肪等)丟棄，這不僅增加了加工者和消費(fèi)者的負(fù)擔(dān)，而且增加了廢物及處理水中的脂肪含量，從而污染環(huán)境。由此看來，肉仔雞體內(nèi)沉積過多的脂肪將會(huì)給生產(chǎn)者、加工者和消費(fèi)者造成顯而易見的經(jīng)濟(jì)損失。肉種雞過肥將會(huì)嚴(yán)重影響產(chǎn)蛋率、受精率和孵化率，并且會(huì)誘導(dǎo)脂肪肝綜合癥的發(fā)生，從而加大了產(chǎn)蛋期的死淘率。因此，控制脂肪在雞體內(nèi)的過多蓄積，進(jìn)一步提高肉雞的飼料轉(zhuǎn)化效率和胴體質(zhì)量是我國(guó)急需研究解決的重大問題。
脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP)屬于脂類結(jié)合蛋白超家族的成員，存在于動(dòng)物體的細(xì)胞內(nèi)，是一類分子量為14-15KD的蛋白。FABP對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪酸具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，其主要功能是運(yùn)輸細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)鏈脂肪酸、調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化、細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄和保護(hù)游離脂肪酸的酶解。在哺乳動(dòng)物中至少有9種FABP已經(jīng)被分離出來，它們分別是肝臟(L-)FABP、小腸(I-)FABP、心臟(H-)FABP、脂肪(A-)FABP、表皮(E-)FABP、回腸(IL-)FABP、腦(B-)FABP、髓磷脂(M-)FABP和睪丸(T-)FABP。
在禽類有至少5種FABP被分離出來，它們分別是肝臟(L-)FABP、小腸(I-)FABP、脂肪(A-)FABP、肌肉(M-)FABP和視網(wǎng)膜(R-)FABP。這些蛋白由126-134個(gè)氨基酸組成，并且由第一個(gè)被分離的組織而命名。編碼這些蛋白的基因具有相同的結(jié)構(gòu)，都是由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，并且外顯子的長(zhǎng)度基本相同或相近，但內(nèi)含子的長(zhǎng)度變異很大。
在哺乳動(dòng)物中，對(duì)各種不同類型的FABP的功能已經(jīng)有了較為深入地研究。其中A-FABP基因敲除的小鼠表現(xiàn)出正常的生理狀態(tài)，可以發(fā)育正常的脂肪組織，在脂類代謝的穩(wěn)定性上變化很小(HotamisLigiL等，1996)。這主要是由于E-FABP基因的上調(diào)表達(dá)對(duì)其產(chǎn)生了補(bǔ)償效應(yīng)(Coe等，1999；Shaughnessy等，2000)，而在正常情況下E-FABP基因在脂肪組織中較低水平的表達(dá)(Krieg等，1993)。與野生型小鼠相比，A-FABP基因敲除的小鼠脂肪組織內(nèi)的脂肪酸流速或脂化作用沒有發(fā)生變化，但基礎(chǔ)脂解作用卻降低了大約40％(Coe等，1999)。在II型糖尿病的發(fā)病機(jī)理中，A-FABP可能通過調(diào)節(jié)脂解作用和胰島素分泌來發(fā)揮其調(diào)控胰島素過多和胰島素抵抗的作用。敲除肥胖小鼠的A-FABP基因?qū)嶒?yàn)表明，A-FABP的缺失不僅可以改善外圍胰島素抵抗，還可以維護(hù)胰腺β-細(xì)胞的正常功能，有利于脂類代謝的正常進(jìn)行(UysaL等，2000)。最近，A-FABP在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)也已經(jīng)被研究(Makowski等，2001)。A-FABP在巨噬細(xì)胞生物反應(yīng)中顯示出其重要的作用，并對(duì)動(dòng)脈硬化癥的發(fā)生有影響。載脂蛋白E和A-FABP同時(shí)缺陷的小鼠可以防止動(dòng)脈硬化癥的發(fā)生(Makowski等，2001)。人的巨噬細(xì)胞中被氧化的低密度脂蛋白可以誘導(dǎo)A-FABP的mRNA和蛋白的表達(dá)(Fu等，2000)。這些數(shù)據(jù)表明在脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中A-FABP有不同的作用，這為動(dòng)脈硬化癥的預(yù)防提供了一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。Gerbens等(1998)在A-FABP基因的第一個(gè)內(nèi)含子檢測(cè)到了一個(gè)微衛(wèi)星序列，對(duì)六個(gè)豬種的測(cè)試發(fā)現(xiàn)具有多態(tài)性。在杜洛克群體中，A-FABP的遺傳變異和IMF含量有關(guān)。
FABP在禽類的肝臟、肌肉、小腸、視網(wǎng)膜和脂肪組織中也已被分離出來(SeweLL等，1989a，1989b；Sams等，1990，1991；Gotz等，1996；SeLLner等，1993)。雞脂肪型FABP(A-FABP)也已經(jīng)被分離出來，其分子量為14KD，等電點(diǎn)為5.1，從氨基酸組成方面分析，該蛋白與哺乳動(dòng)物H-FABP和A-FABP在結(jié)構(gòu)上高度同源，配體結(jié)合特點(diǎn)研究表明，雞A-FABP對(duì)亞油酸具有極強(qiáng)的結(jié)合能力，其次是油酸、棕櫚酰CoA和棕櫚酸，而不能結(jié)合膽固醇(Sams等，1990)。禽類FABP基因多態(tài)性的研究剛剛起步。王啟貴等(2001)研究表明EX-FABP基因的多態(tài)性與腹脂含量極顯著的相關(guān)(p＜0.01)。
王啟貴等(2002)克隆了雞A-FABP基因，研究表明該基因由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成(Genbank Accession No.AF432507)，并且僅在脂肪組織中表達(dá)。
(三)、發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的是提供一種分子生物學(xué)技術(shù)，即采用PCR-RFLP方法來檢測(cè)雞基因型，從而預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標(biāo)記方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的1、根據(jù)雞A-FABP基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物AFF和AFRAFF5’-AGA CTG CTA CCT GGC CTG ACA-3’AFR5’-CAT CCT ACT GGA ATA CGG-3’2、利用該引物對(duì)雞的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為702bp；3、利用限制性內(nèi)切酶Taq I消化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；4、使用2％的瓊脂糖凝膠對(duì)消化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，檢測(cè)出A-FABP基因外顯子I中的C/T變異位點(diǎn)；5、當(dāng)雞A-FABP基因外顯子I中變異位點(diǎn)為C堿基時(shí)，會(huì)產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶Taq I的酶切位點(diǎn)(T/CGA)，Taq I消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生2個(gè)片段(629bp和73bp)，將其命名為BB基因型；該位點(diǎn)為T堿基時(shí)(TTGA)，則不存在Taq I酶切位點(diǎn)，Taq I消化PCR產(chǎn)物后只有1個(gè)片段(702bp)，將其命名為AA基因型；該位點(diǎn)為C/T雜合時(shí)，Taq I消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生3個(gè)片段(702bp、629bp和73bp)，將其命名為AB基因型。
本發(fā)明還可以包括1、其中分析基因多態(tài)性的方法是通過檢測(cè)堿基的突變而分類的基因型。
2、其中用于分析基因多態(tài)性的部位是外顯子。
3、其中用于分析基因多態(tài)性的部位是由AFF和AFR表示的引物擴(kuò)增的外顯子區(qū)。
4、其中用于分析多態(tài)性的位點(diǎn)選自雞A-FABP基因如下序列中第74位的C-T的堿基突變。
1AGACTGCTAC CTGGCCTGAC AAAATGTGCG ACCAGTTTGT GGGCACCTGG AAGCTCCTTT61 CTAGTGAAAA CTTCGAGGAC TATATGAAAG AGCTGGGTGA GAAATGTTAC CTGAAATTAT121 TGTGTCTGGG GAAGGGAGGG AATGCTGAAC TTGAGCTCTA TTCCTTACTT GCTTTTTCAG181 TCTATGCTGT TTACCAAGGT CTTTTTAGTC CAACTACTTT TATTAAATAG TTCTAAACTG241 GAAAACTTGG CTGTTTGGAT TAGCGTTGTC ACATTCCTAT AACATAGGAA AGCTTGACTG301 GGAGGAATAG TTTCAGGTAG GCCAAGTCTA TGCATGCCTA ACTGCTAGTG CTATAAATGA361 AAGTAAACAC TTTGCTGCAG TATTTTATGT GAATTTGCTT TTAAACTTTT GGAAGTACAA421 AGTGATGTAA TGCTAGAATG CAGGAAGCTT CTCTGTGTCT ATGAGCAACA CACCTAAATT481 TGCTCTTGGA CTAGGACACT GATTAATTGT CATGGCTATT ATAGTAAGTG AATGAAACTC541 TGCGATTGCC TCCAGTGAAT ATTAACAAAG AAAGTTGCAC AGATTCATGA CAGGTACTGC601 AGTATACCTG CAAAAGTATT CAAGGAATAA CACTCTAAAG GTGTTGACTT CTCACTTAGA661 ATTAAATCTG GGCTTTAAAA TTTTCCGTAT TCCAGTAGGA TG5、其中雞腹脂量是雞的腹脂重和腹脂率。
6、其中用于消化PCR產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶是Taq I。
7、其中用于瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠濃度為2％。
實(shí)驗(yàn)證明具有AA基因型個(gè)體的腹脂重和腹脂率顯著低于具有BB基因型雞的腹脂重和腹脂率(P＜0.05)。在我們所研究的2個(gè)群體中，具有AA基因型個(gè)體的腹脂重比BB基因型個(gè)體的腹脂重低8.67-13.02克；具有AA基因型個(gè)體的腹脂率比BB基因型個(gè)體的腹脂率低0.34-0.66％。
本發(fā)明巧妙地采用PCR-RFLP的方法檢測(cè)雞A-FABP基因外顯子I中C/T變異位點(diǎn)。
本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低、精確度高，可進(jìn)行快速檢測(cè)。使用本發(fā)明的標(biāo)記基因型對(duì)雞的腹脂量進(jìn)行選擇時(shí)，將使腹脂重降低10克左右。我國(guó)每年要規(guī)?；a(chǎn)40億只商品肉雞，如果每只雞能夠減少10克腹脂，至少相當(dāng)于節(jié)約2.4億公斤飼料，可以帶來很大的經(jīng)濟(jì)效益。總之，該研究發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記可以用于雞脂肪性狀的標(biāo)記輔助選擇，不僅有重要的生產(chǎn)意義，而且為禽類脂肪代謝在分子水平上的研究打開了新的窗口。


附圖是A-FABP基因Taq I酶切位點(diǎn)分析圖譜。
(五)、具體實(shí)施方案下面舉例對(duì)本發(fā)明做更詳細(xì)地描述一、實(shí)驗(yàn)材料1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和性狀測(cè)定東北農(nóng)業(yè)大學(xué)育種基地建立的以肉雞高脂品系和白耳雞為親本雜交產(chǎn)生的F2資源群體。本研究選取5個(gè)家系，共計(jì)455只雞。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)建立的以明星肉雞和絲毛烏骨雞為親本雜交產(chǎn)生的F2資源群體，其中肉雞做父本為正交，烏骨雞做父本為反交。本研究選取正反交各4個(gè)家系，共計(jì)558只雞。
兩個(gè)F2代群體于12周齡時(shí)翅靜脈采血，草酸鹽抗凝，稱量活重后屠宰，然后剝離腹脂并稱量腹脂重(g)，并除以12周齡活重計(jì)算出腹脂率。
2.藥品和酶三羥甲基氨基甲烷(Tris)，Sigma ChemicaLs Co；Tris飽和酚，北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心；蛋白酶K(Proteinase K)，MMERCK Co；DL 2000、dNTP(dATP；dTTP；dCTP；dGTP)、Taq酶，大連寶生物公司；瓊脂糖(Agarose)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺，原平皓公司。
3.主要儀器PTC-200PCR儀(PERKIN ELMER)、Biometra梯度PCR儀、UVP多功能成像系統(tǒng)、ULtrospec 1000紫外分光光度計(jì)、BECKMAN冷凍離心機(jī)、MiLLi-Q超純水儀、DYY-III2穩(wěn)壓電泳儀及配套電泳槽。
二、實(shí)驗(yàn)方法1.緩沖液與常用試劑的配制1M Tris CL121.14g Tris堿溶于800mL雙蒸水中，用鹽酸調(diào)pH值至8.0，定容至1000mL，高壓滅菌。
TE緩沖液10mM Tris CL，1mM EDTA，pH8.0，高壓滅菌。
20×SET緩沖液3MNaCL，1M Tris CL(pH 8.0)，20mM EDTA(pH 8.0)，高壓滅菌。
5×TBE緩沖液54g Tris堿，27.5g硼酸，20mL 0.5M EDTA(pH8.0)，加水至1L。
50×TAE緩沖液242g Tris堿，57.1mL冰乙酸，100mL 0.5MEDTA(pH8.0)，加水至1L。
1M Tris CL121.14g Tris堿溶于800mL雙蒸水中，用鹽酸調(diào)pH值至8.0，定容至1000mL，高壓滅菌。
0.5M EDTA186.1g EDTA溶于800mL雙蒸水中，用NaOH調(diào)pH值至8.0，定容至1000mL，高壓滅菌。
3M NaAc(pH5.2)408.1g NaAc 3H2O溶于800mL雙蒸水中，用冰乙酸調(diào)pH至7.0，定容至1000mL。
200mL銀染液NH3H2O 2mL；3.6％NaOH 4.2mL；20％AgNO33.6mL，加去離子水至200mL。
200mL顯色液1％檸檬酸鈉1mL；甲醛100uL；加去離子水至200mL。
禽血裂解液10mM Tris·CL(pH8.0)，0.1M EDTA(pH8.0)，0.5％SDS。
2.引物的設(shè)計(jì)與合成以下引物由上海博亞生物公司合成AFF5’-AGA CTG CTA CCT GGC CTG ACA-3’AFR5’-CAT CCT ACT GGA ATA CGG-3’3.雞基因組DNA的小量提取方法一(1)取20μL抗凝血液，加入500μL禽裂解液，加入蛋白酶K至終濃度為100-200μg/mL，混勻55℃消化12hr，直至溶液中不再有粘稠的團(tuán)塊。
(2)將溶液冷卻至室溫，加入5M NaCL至終濃度1.5M，混勻10min。加入等體積酚/氯仿，反復(fù)顛倒離心管混勻10min。□(3)12,000rpm，室溫離心10min。取上清，加等體積氯仿混勻10min。□(4)12,000rpm，室溫離心10min。取上清2倍體積無水乙醇沉淀DNA。□(5)將DNA挑出放到1.5mL離心管中，用70％乙醇洗1次?！?6)7,500rpm，室溫離心5min，棄上清。
(7)將DNA干燥后(注意不能太干)溶于200μL TE中。
方法二(1)將20μL全血加入裝有700μL 1×SET的1.5mL離心管中，輕輕混勻。
(2)加入蛋白酶K(10mg/mL)至終濃度100-200μg/μL和10％的SDS至終濃度0.5％，55℃消化12h。
(3)待消化完全后，加入等體積的Tris飽和酚，來回顛倒，使其混勻(4)12,000rpm離心10min，用剪去尖端的吸頭將上層水相小心移入另一個(gè)離心管中，棄去有機(jī)相。重復(fù)第三和第四步驟一次。
(5)向水相中加入等體積的酚、氯仿、異戊醇混合液(體積比為24∶23∶1)，混合10min。12,000rpm.，離心10min，移出水相到另一個(gè)離心管。
(6)向水相中加入等體積的氯仿、異戊醇混合液(23∶1)，來回顛倒混合10min，12，000rpm，離心10min，移出水相到另一個(gè)離心管。
(7)向水相中加入1/10體積NaAc(3M，pH5.2)和2倍體積的無水乙醇，來回顛倒，沉淀DNA。
(8)將DNA挑出放到1.5mL離心管中，用70％乙醇洗1次。
(9)7,500rpm離心5min。小心倒掉管中乙醇，將倒置在濾紙上，讓乙醇流盡，置于空氣中干燥。
(10)加入200μL的TE，置50℃水浴中過夜溶解DNA。溶解后貯存于-20℃?zhèn)溆谩?br> 4.PCR反應(yīng)(1)以雞DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，10uL反應(yīng)體系中包含以下溶液或試劑10×PCR reaction buffer 1μLdNTP Mixture(各2.SmM) 0.8μL引物1(10μM)0.2μL引物2(10μM)0.2μLEX-Taq(5U/μL) 0.1μL去離子水6.7μL；基因組DNA(50ng/μL) 1.0μL(2)將上述溶液混合并按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。
94℃變性5min；94℃30sec，58℃ 30sec，72℃ 50sec，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。
(3)反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液(3μL)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物。
5.PCR-RFLP反應(yīng)體系及條件酶切體系如下Taq I內(nèi)切酶10U/μL0.5μL10×Buffer 2μLPCR Production5μL加去離子水至 20μL將上述反應(yīng)液混勻，于65℃水域中消化3～5小時(shí)。
6.瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)將消化之后將全部反應(yīng)液進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物酶切片段多態(tài)性。
7.統(tǒng)計(jì)模型建立根據(jù)F2資源群體的特點(diǎn)，構(gòu)建線性模型如下Y＝μ+G+F+S+H+R+eY為性狀觀察值，μ為群體均值，a為剩余多基因效應(yīng)，G為基因型固定效應(yīng)，F(xiàn)為家系固定效應(yīng)，S為性別固定效應(yīng)，R為正反交(組合)固定效應(yīng)(東北農(nóng)大建立的資源群體無此效應(yīng))，H為孵化批次固定效應(yīng)，e為剩余值。使用統(tǒng)計(jì)軟件JMP 4(SAS Institute Inc.，Cary，NC)檢驗(yàn)基因型與性狀間的相關(guān)程度，并估計(jì)性狀的最小二乘均值。
實(shí)施例1、雞A-FABP基因的多態(tài)性與東北農(nóng)大F2資源群體腹脂性狀的相關(guān)利用本發(fā)明的引物(AFF和AFR)對(duì)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)建立的F2資源群體455個(gè)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并利用Taq I限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，然后進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳分析。在F2資源群體中共檢測(cè)到3種基因型，當(dāng)雞A-FABP基因外顯子I中變異位點(diǎn)為C堿基時(shí)，會(huì)產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶Taq I的酶切位點(diǎn)(T/CGA)，Taq I消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生2個(gè)片段(629bp和73bp)，將其命名為BB基因型；該位點(diǎn)為T堿基時(shí)(TTGA)，則不存在Taq I酶切位點(diǎn)，Taq I消化PCR產(chǎn)物后只有1個(gè)片段(702bp)，將其命名為AA基因型；該位點(diǎn)為C/T雜合時(shí)，Taq I消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生3個(gè)片段(702bp、629bp和73bp)，將其命名為AB基因型(附圖)。
對(duì)A-FABP基因C/T變異位點(diǎn)產(chǎn)生的3種基因型與東北農(nóng)大F2資源群體455個(gè)個(gè)體的腹脂重和腹脂率進(jìn)行最小二乘分析，結(jié)果表明基因型對(duì)F2資源群體的腹脂重和腹脂率有極顯著影響(P＜0.01)(表1)。
表1.東北農(nóng)大F2資源群體腹脂性狀的最小二乘分析結(jié)果(P值)
對(duì)3種基因型間F2資源群體腹脂性狀的最小二乘均值進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明AA基因型個(gè)體的腹脂重和腹脂率顯著低于AB和BB型個(gè)體的腹脂重和腹脂率(P＜0.05)；具有AA基因型個(gè)體的腹脂重和腹脂率比BB基因型個(gè)體的腹脂重和腹脂率分別低8.67克和0.34％(表2)。
表2.A-FABP基因不同基因型對(duì)東北農(nóng)大F2資源群體雞只腹脂性狀的影響
均值比較時(shí)同一列無相同字母者差異顯著(a-bp＜0.05)D顯性度D＝d/a；a＝(BB-AA)/2；d＝AB-(AA+BB)/2實(shí)施例2、雞A-FABP基因的多態(tài)性與中國(guó)農(nóng)大F2資源群體腹脂性狀的相關(guān)利用本發(fā)明的引物(AFF和AFR)對(duì)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)建立的F2資源群體588個(gè)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并利用Taq I限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，然后進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果在中國(guó)農(nóng)大F2資源群體中也檢測(cè)到3種基因型，并且與在東北農(nóng)大F2資源群體中檢測(cè)到的基因型相同。當(dāng)雞A-FABP基因外顯子I中變異位點(diǎn)為C堿基時(shí)，會(huì)產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶Taq I的酶切位點(diǎn)(T/CGA)，Taq I消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生2個(gè)片段(629bp和73bp)，將其命名為BB基因型；該位點(diǎn)為T堿基時(shí)(TTGA)，則不存在Taq I酶切位點(diǎn)，Taq I消化PCR產(chǎn)物后只有1個(gè)片段(702bp)，將其命名為AA基因型；該位點(diǎn)為C/T雜合時(shí)，Taq I消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生3個(gè)片段(702bp、629bp和73bp)，將其命名為AB基因型(附圖)。
對(duì)A-FABP基因Taq I酶切多態(tài)位點(diǎn)的3種基因型與中國(guó)農(nóng)大F2資源群體558個(gè)個(gè)體的腹脂重和腹脂率進(jìn)行最小二乘分析。結(jié)果表明基因型對(duì)F2資源群體的腹脂重和腹脂率有顯著影響(P＜0.05)(表3)。
表3.中國(guó)農(nóng)大F2資源群體腹脂性狀的最小二乘分析結(jié)果(P值)
對(duì)3種基因型間F2資源群體腹脂性狀的最小二乘均值進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明AA基因型個(gè)體的腹脂重和腹脂率顯著低于AB和BB型個(gè)體的腹脂重和腹脂率(P＜0.05)；具有BB基因型個(gè)體的腹脂重和腹脂率比AA基因型個(gè)體的腹脂重和腹脂率分別低13.02克和0.66％(表4)。
表4.A-FABP基因不同基因型對(duì)中國(guó)農(nóng)大F2資源群體雞只腹脂性狀的影響
均值比較時(shí)同一列無相同字母者差異顯著(a-bp＜0.05)D顯性度D＝d/a；a＝(BB-AA)/2；d＝AB-(AA+BB)/權(quán)利要求
1.用A-FABP基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標(biāo)記方法，其特征是(1)、根據(jù)雞A-FABP基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物AFF5’-AGA CTG CTA CCT GGC CTG ACA-3’AFR5’-CAT CCT ACT GGA ATA CGG-3’(2)、利用該引物對(duì)雞的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為702bp；(3)、利用限制性內(nèi)切酶Taq I消化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；(4)、使用2％的瓊脂糖凝膠對(duì)消化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，檢測(cè)出A-FABP基因外顯子I中的C/T多態(tài)性位點(diǎn)；(5)、當(dāng)雞A-FABP基因外顯子I中多態(tài)性位點(diǎn)為C堿基時(shí)，會(huì)產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶Taq I的酶切位點(diǎn)(T/CGA)，Taq I消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生2個(gè)片段(629bp和73bp)，將其命名為BB基因型；該位點(diǎn)為T堿基時(shí)(TTGA)，則不存在Taq I酶切位點(diǎn)，Taq I消化PCR產(chǎn)物后只有1個(gè)片段(702bp)，將其命名為AA基因型；該位點(diǎn)為C/T雜合時(shí)，Taq I消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生3個(gè)片段(702bp、629bp和73bp)，將其命名為AB基因型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標(biāo)記方法，其特征是其中分析基因多態(tài)性的方法是通過檢測(cè)堿基的突變而分類的基因型。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標(biāo)記方法，其特征是其中用于分析基因多態(tài)性的部位是外顯子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標(biāo)記方法，其特征是其中用于分析基因多態(tài)性的部位是由AFF和AFR表示的引物擴(kuò)增的外顯子區(qū)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標(biāo)記方法，其特征是其中用于分析多態(tài)性的位點(diǎn)選自雞A-FABP基因如下序列中第74位的C-T的堿基突變。1 AGACTGCTAC CTGGCCTGAC AAAATGTGCG ACCAGTTTGT GGGCACCTGG AAGCTCCTTT61 CTAGTGAAAA CTTCGAGGAC TATATGAAAG AGCTGGGTGA GAAATGTTAC CTGAAATTAT121TGTGTCTGGG GAAGGGAGGG AATGCTGAAC TTGAGCTCTA TTCCTTACTT GCTTTTTCAG181TCTATGCTGT TTACCAAGGT CTTTTTAGTC CAACTACTTT TATTAAATAG TTCTAAACTG241GAAAACTTGG CTGTTTGGAT TAGCGTTGTC ACATTCCTAT AACATAGGAA AGCTTGACTG301GGAGGAATAG TTTCAGGTAG GCCAAGTCTA TGCATGCCTA ACTGCTAGTG CTATAAATGA361AAGTAAACAC TTTGCTGCAG TATTTTATGT GAATTTGCTT TTAAACTTTT GGAAGTACAA421AGTGATGTAA TGCTAGAATG CAGGAAGCTT CTCTGTGTCT ATGAGCAACA CACCTAAATT481TGCTCTTGGA CTAGGACACT GATTAATTGT CATGGCTATT ATAGTAAGTG AATGAAACTC541TGCGATTGCC TCCAGTGAAT ATTAACAAAG AAAGTTGCAC AGATTCATGA CAGGTACTGC601AGTATACCTG CAAAAGTATT CAAGGAATAA CACTCTAAAG GTGTTGACTT CTCACTTAGA661ATTAAATCTG GGCTTTAAAA TTTTCCGTAT TCCAGTAGGA TG
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)所述的預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標(biāo)記方法，其特征是其中雞腹脂量是雞的腹脂重和腹脂率。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)所述的預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標(biāo)記方法，其特征是其中用于消化PCR產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶是Taq I。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6任何一項(xiàng)所述的預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標(biāo)記方法，其特征是其中用于瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠濃度為2％。
全文摘要
本發(fā)明提供的是用A－FABP基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標(biāo)記方法。根據(jù)雞A－FABP基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物；利用該引物對(duì)雞的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并利用限制性內(nèi)切酶TaqI消化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；然后使用2％的瓊脂糖凝膠對(duì)消化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，檢測(cè)出A－FABP基因外顯子I中的C/T變異位點(diǎn)；分別對(duì)雞A－FABP基因外顯子I中C堿基、T堿基及該位點(diǎn)雜合時(shí)進(jìn)行命名。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明具有AA基因型個(gè)體的腹脂重和腹脂率比BB基因型個(gè)體的腹脂重低8.67－13.02克和0.34％－0.66％。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低、精確度高，可進(jìn)行快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1654681SQ20041004410
公開日2005年8月17日 申請(qǐng)日期2004年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月8日
發(fā)明者李輝, 王啟貴, 李寧 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)