專利名稱：用于結(jié)核病診斷的結(jié)核分支桿菌蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用基因工程制備的結(jié)核分支桿菌蛋白，以及該蛋白在結(jié)核病診斷、結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查及監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用和其作為抗原成份在疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
結(jié)核分支桿菌是結(jié)核病的致病菌，每年全世界大約三百萬人罹患結(jié)核桿菌導(dǎo)致的結(jié)核病。我國(guó)是世界上22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，病人人數(shù)居世界第二位，僅次于印度。近年來，結(jié)核病的發(fā)病人數(shù)在我國(guó)又呈上升趨勢(shì)。
結(jié)核病是一種呼吸道傳染病，因此，對(duì)該病的早期、準(zhǔn)確診斷是有效控制該病廣泛傳播的關(guān)鍵。
在20世紀(jì)的20年代，國(guó)外研究者已將液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的結(jié)核桿菌裂解的可溶性產(chǎn)物的濃縮過濾物制成了供皮試的變態(tài)反應(yīng)原(舊結(jié)核菌素，OT)。1934年seiber建立硫酸銨鹽析法制備出了PPD。1982年我國(guó)開始研制PPD，其基本制備方法為將蘇通培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)8-10周培養(yǎng)物，100℃ 60min滅活后過濾除去菌體，然后用終濃度2％三氯醋酸鹽析法沉淀，提純蛋白衍化物，此蛋白衍生物即為PPD[王國(guó)治，中國(guó)防癆雜志，1991]。OT與PPD均能引起分支桿菌致敏機(jī)體的DTH反應(yīng)，廣泛應(yīng)用于結(jié)核病初步診斷，結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查及監(jiān)測(cè)。但是，由于OT與PPD中除蛋白衍化物以外，還包含結(jié)核桿菌代謝產(chǎn)物，菌體多糖、核酸、脂類物質(zhì)以及培養(yǎng)基中的一些成份等，常常造成非特異性交叉反應(yīng)和其他副反應(yīng)。美國(guó)Konstantin在報(bào)告中指出，PPD抗原與幾乎所有分支桿菌有共同抗原，存在著廣泛的交叉反應(yīng)[Konstantin L，et al.，Infection and Immunity，1998]；黃健報(bào)道，在1184人群的流行病學(xué)調(diào)查中，注射局部出現(xiàn)皮膚異常反應(yīng)，如出現(xiàn)水皰、壞死的約占1.7％[黃健，中國(guó)防癆雜志，1994]；劉元東等報(bào)道，PPD皮試強(qiáng)陽性266人，其中出現(xiàn)水皰，壞死的人數(shù)為132人，占49.6％[劉元東等，中國(guó)防癆雜志，2000]；吳蘭珍等報(bào)道89例結(jié)核性疾病(肺結(jié)核、肺外結(jié)核)患者中，PPD皮試出現(xiàn)水皰，壞死及反應(yīng)范圍超過20mm以上者占34.7％[吳蘭珍等，中國(guó)防癆雜志，1991]。除此之外，還有極少數(shù)患者在PPD皮試后出現(xiàn)全身過敏性反應(yīng)，如變態(tài)反應(yīng)性壞死性血管炎，過敏性紫癜，淋巴管炎，過敏性休克等。
鑒于PPD存在上述毒副反應(yīng)及特異性差問題，近年來，研究人員在尋找能取而代之的、更加特異，更加安全的變態(tài)反應(yīng)原方面進(jìn)行了許多有益的嘗試，在眾多研究中，結(jié)核分支桿菌38KDa蛋白倍受關(guān)注。
結(jié)核分支桿菌38KDa蛋白是結(jié)核分支桿菌主要的免疫原，具有較強(qiáng)的免疫活性。Wilkinson等英國(guó)、丹麥、意大利、印度、德國(guó)等國(guó)家學(xué)者合作研究，于1997年報(bào)道，用38KDa蛋白作豚鼠DTH變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)，其效果優(yōu)于17KDa、19KDa、24KDa和32KDa蛋白，其效力與PPD基本相似。該38KDa蛋白誘發(fā)由結(jié)核分支桿菌、BCG(卡介苗)和胞內(nèi)分支桿菌致敏豚鼠產(chǎn)生DTH，而與鳥分支桿菌、堪薩斯分支桿菌、瘰癘分支桿菌不發(fā)生或僅發(fā)生極輕微的反應(yīng)[Wilkinson et al，Journal of Clinical Microbiology 1997]。盡管這種38KDa蛋白有較好的變態(tài)反應(yīng)原特性，但存在的問題是結(jié)核分支桿菌合成38KDa蛋白少，僅占總蛋白的千分之一。由于通過結(jié)核分支桿菌獲取38KDa蛋白產(chǎn)量低且需要大量培養(yǎng)和操作有毒菌種，存在傳染人的危險(xiǎn)，因此，研究工作者投入了大量的實(shí)驗(yàn)研究，通過基因工程技術(shù)發(fā)酵大腸桿菌生產(chǎn)重組38KDa蛋白。目前，雖然通過基因工程生產(chǎn)38KDa蛋白已使其產(chǎn)量大大增加，例如，M.Singh等通過重組大腸桿菌K-12菌株CAG629[pMS9-2]制備了重組Ag38蛋白，重組蛋白的表達(dá)量達(dá)到了總細(xì)胞蛋白的10％，但這樣的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床結(jié)核病診斷和結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查的需要，影響了該蛋白在結(jié)核病領(lǐng)域中的實(shí)際應(yīng)用。
目前極需要找到一種既能大量生產(chǎn)，又具有良好特異性，而且更加安全的結(jié)核分支桿菌變態(tài)反應(yīng)原，克服人們長(zhǎng)期以來渴望解決的結(jié)核病診斷和篩選方面所存在的問題。
本發(fā)明通過大量研究，發(fā)現(xiàn)了一種特定序列的核苷酸，用具有該核苷酸序列的核酸構(gòu)建重組表達(dá)載體后導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞，如大腸桿菌中表達(dá)，可使重組蛋白表達(dá)量成倍增加，達(dá)到占總細(xì)菌蛋白的36％。而且，表達(dá)后的蛋白通過動(dòng)物試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)證實(shí)，其有良好的變態(tài)反應(yīng)原效力和高度的特異性，并且副反應(yīng)極小。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明公開了一種編碼結(jié)核分支桿菌蛋白的如序列2所示的核苷酸序列，利用該核苷酸序列制備結(jié)核分支桿菌蛋白的方法，以及由該方法制備的結(jié)核分支桿菌蛋白。
本發(fā)明的結(jié)核分支桿菌蛋白由序列2所示核苷酸序列的核酸表達(dá)。所表達(dá)的蛋白的氨基酸序列如序列3所示。
本發(fā)明如序列2所示的核苷酸序列可以插入適合在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)的載體中構(gòu)建成表達(dá)載體，從而在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)。優(yōu)選的原核細(xì)胞表達(dá)載體為PET9d、PET22b(+)或PET15b質(zhì)粒；優(yōu)選的原核宿主細(xì)胞為大腸桿菌，更優(yōu)選為BL21(DE3)或HMS174(DE3)。
本發(fā)明利用序列2所示核苷酸序列通過基因工程方法制備結(jié)核分支桿菌蛋白可通過如下步驟實(shí)現(xiàn)1)獲得具有序列2所示的多核苷酸序列；2)將該多核苷酸序列導(dǎo)入質(zhì)粒，優(yōu)選PET9d、PET22b(+)或PET15b質(zhì)粒；3)將該質(zhì)粒導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞，優(yōu)選，大腸桿菌宿主細(xì)胞，更優(yōu)選BL21(DE3)或HMS174(DE3)中；4)在有利于所述多核苷酸序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和5)回收、純化及復(fù)性所表達(dá)的重組蛋白。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白的組合物以及試劑盒。所述組合物可作為結(jié)核病診斷以及結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)試劑，用于臨床結(jié)核病的診斷和結(jié)核病流行病學(xué)的調(diào)查、篩選和監(jiān)測(cè)。
所述蛋白或組合物也可制備成結(jié)核病診斷試劑盒或結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查篩選試劑盒，方便地用于臨床結(jié)核病的診斷和結(jié)核病流行病學(xué)的調(diào)查、篩選和監(jiān)測(cè)。
本發(fā)明涉及到一種新的結(jié)核病診斷方法以及結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)方法，該方法包括利用包含本發(fā)明的結(jié)核分支桿菌蛋白的試劑或試劑盒，通過皮膚試驗(yàn)，或血清學(xué)試驗(yàn)來診斷結(jié)核病患者，或篩選出結(jié)核病疑似患者。因此，本發(fā)明還涉及了包含本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白的結(jié)核病皮膚診斷或流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)的試劑或試劑盒，以及包含本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白的結(jié)核病血清學(xué)診斷或流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)的試劑或試劑盒。
本發(fā)明的結(jié)核分支桿菌蛋白作為結(jié)核桿菌變態(tài)反應(yīng)原，通過動(dòng)物及臨床試驗(yàn)證實(shí)具有良好的免疫原效力，并且還具有特異性強(qiáng)、副作用小的特點(diǎn)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到，本發(fā)明的結(jié)核分支桿菌蛋白可用來制備結(jié)核分支桿菌疫苗，如亞單位疫苗等。同樣，本發(fā)明所公開的如序列2所示的核苷酸序列也可用來制備DNA疫苗，用以預(yù)防結(jié)核病。因此，本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白或核酸的結(jié)核分支桿菌疫苗。
發(fā)明詳述本發(fā)明公開了一種編碼結(jié)核分支桿菌蛋白的如序列2所示的核苷酸序列，利用該核苷酸序列制備結(jié)核分支桿菌蛋白的方法，由該方法制備的包含序列3所示氨基酸序列的結(jié)核分支桿菌蛋白，以及包含該蛋白的組合物和試劑盒，同時(shí)還公開了它們?cè)诮Y(jié)核病診斷和結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。另外，本發(fā)明的結(jié)核分支桿菌蛋白及本發(fā)明的核酸還可用于結(jié)核分支桿菌疫苗的制備。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種編碼結(jié)核分支桿菌蛋白的如序列2所示的核苷酸序列。堿基的編號(hào)為常規(guī)的5’至3’順序(翻譯鏈的起始密碼至終止密碼順序)。
序列2所示核酸序列可通過本領(lǐng)域常規(guī)的方法制備，優(yōu)選根據(jù)Pab基因序列，如序列1(堿基的編號(hào)為常規(guī)的5’至3’順序)所示的核苷酸序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)PCR引物，優(yōu)選序列4和5所示序列的引物進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行如下突變1.使其缺失5’端1-72位堿基；2.將第76-78位堿基TCG突變?yōu)門CT；3.使終止密碼為TAA。
多核苷酸序列結(jié)構(gòu)的改變影響核酸高級(jí)結(jié)構(gòu)例如二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而影響該核酸在宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，具有如上所述結(jié)構(gòu)的核酸分子在用適當(dāng)載體和宿主細(xì)胞表達(dá)時(shí)可大大提高表達(dá)產(chǎn)率。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及應(yīng)用如序列2所示的核苷酸序列制備結(jié)核分支桿菌蛋白的方法。根據(jù)常規(guī)方法，可將含編碼本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白的如序列2所示核苷酸序列的cDNA或DNA核酸分子連接到一表達(dá)載體中，然后通過常規(guī)方法轉(zhuǎn)化細(xì)胞。轉(zhuǎn)化是指作為染色體外成份或者經(jīng)過染色體整合將DNA導(dǎo)入生物以便該DNA能夠復(fù)制。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，使用適合于該細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。Cohen，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，692110(1972)和Mandel等，分子生物學(xué)雜志，53154(1970)所述的采用氯化鈣的鈣處理一般用于原核或其它含有大量細(xì)胞壁障礙的細(xì)胞。
通常，優(yōu)選原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本發(fā)明的載體構(gòu)建。例如，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌等芽孢桿菌和諸如鼠傷寒沙門氏菌或粘質(zhì)沙雷氏菌等腸桿菌科其它細(xì)菌，和假單胞菌屬的各種細(xì)菌。
一般來說，含有與原核宿主細(xì)胞相適合的復(fù)制子和調(diào)控序列的質(zhì)粒載體都能與所述宿主結(jié)合使用。但優(yōu)選編碼本發(fā)明蛋白的DNA序列插入到PET9d、PET22b(+)或PET15b(+)載體形成重組表達(dá)載體。編碼本發(fā)明蛋白的核酸與PET9d、PET22b(+)或PET15b(+)形成的雜合質(zhì)粒具有高度的穩(wěn)定性，有利于本發(fā)明目的蛋白的表達(dá)。
結(jié)核分支桿菌的啟動(dòng)子不能被大腸桿菌RNA聚合酶識(shí)別，T7噬菌體RNA聚合酶只能識(shí)別T7噬菌體啟動(dòng)子，所以選擇T7噬菌體啟動(dòng)子應(yīng)選擇能編碼T7噬菌體RNA聚合酶的宿主菌才能實(shí)現(xiàn)表達(dá)。理論上含有(DE3)溶源菌，并在表達(dá)蛋白前不產(chǎn)生T7噬菌體RNA聚合酶的宿主菌均可選擇，例如，HMS174(DE3)，JM109(DE3)，BL21(DE3)均能高效表達(dá)本發(fā)明目的蛋白，但優(yōu)選HMS174(DE3)和BL21(DE3)，這兩種宿主細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明目的蛋白的產(chǎn)量更高，而且其生長(zhǎng)速度快，有利于提高生產(chǎn)效率。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，如圖1所示，制備含有序列2所示多核苷酸序列的核酸分子和PET9d質(zhì)粒的表達(dá)構(gòu)建體，并將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4-5小時(shí)后，收集菌體。目的蛋白表達(dá)量經(jīng)凝膠光密度掃描定量測(cè)定，結(jié)果占全菌體蛋白的36％-40％，所得目的蛋白經(jīng)質(zhì)譜法檢測(cè)，分子量為35.8KDa。
可采用常規(guī)的純化方法純化所得到的蛋白，并使其復(fù)性。已知的純化方法包括，例如離子交換劑進(jìn)行的吸附和脫附、超速離心、凝膠過濾、親合層析或特異性純化方法。純化后的本發(fā)明蛋白可用包括，例如，二硫蘇糖醇或二巰基乙醇在內(nèi)的常規(guī)還原劑復(fù)性。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及用上述方法制備、純化、復(fù)性的結(jié)核分支桿菌蛋白，該蛋白具有序列3所示氨基酸序列。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及包含本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白的組合物和試劑盒。所述組合物或試劑盒可制備成結(jié)核病診斷及結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)試劑或試劑盒形式。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及包含本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白的結(jié)核病診斷及結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)試劑。在該產(chǎn)品中，本發(fā)明蛋白可以干燥粉末形式存在，在使用前稀釋至所需濃度；也可以一定濃度的溶液形式存在。包含本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白的結(jié)核病診斷及結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)試劑可包括一個(gè)容器和位于該容器表面的或與該容器相關(guān)的標(biāo)簽或包裝插頁。適當(dāng)?shù)娜萜饔衅孔?，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑料制成。該容器可內(nèi)含檢測(cè)結(jié)核病的本發(fā)明蛋白的組合物，并具有無菌存取口(例如該容器可以是帶有能通過皮內(nèi)注射針穿刺的塞子的小瓶)。所述標(biāo)簽或包裝插頁說明所述包含本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白的組合物的使用方法和用途說明。另外，該產(chǎn)品還可進(jìn)一步包括第二個(gè)容器，其中可含有可藥用的緩沖劑，例如注射用的無菌水(BWFI)、磷酸緩沖鹽、Ringer’溶液和葡萄糖溶液。還可包括滿足用戶需要的其它材料，如其它緩沖液、稀釋劑，濾器，針頭和注射器。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及含本發(fā)明的結(jié)核分支桿菌蛋白的結(jié)核病診斷及流行病學(xué)調(diào)查、篩選及監(jiān)測(cè)的試劑盒，在臨床上用于方便、快速和準(zhǔn)確的診斷結(jié)核病，而且，在進(jìn)行大規(guī)模的結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)中該試劑盒更顯其優(yōu)勢(shì)。
本文所述“試劑盒”是指利用本發(fā)明蛋白完成結(jié)核病檢測(cè)而組配制成的成套試劑。該試劑盒用于診斷結(jié)核病，或用于結(jié)核病的流行病調(diào)查和監(jiān)測(cè)。在該試劑盒中，包括一個(gè)容器，該容器內(nèi)含有本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白。本發(fā)明的結(jié)核分支桿菌蛋白可以任何方便的、合適的包裝方式進(jìn)行包裝。例如，如果其是凍干制劑，帶彈性塞子的安瓿或小玻璃瓶可通常用作容器，以便經(jīng)彈性塞子可注入液體來配制一定濃度的本發(fā)明蛋白溶液。無彈性可移動(dòng)蓋子的安瓿(如密封的玻璃)或帶彈性塞子的安瓿最方便用于本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白的可注射形式。本發(fā)明試劑盒還可包括其它多個(gè)容器，其中可分別含有檢測(cè)所用的標(biāo)準(zhǔn)品，抗體或經(jīng)過標(biāo)記的抗體、酶，底物或緩沖液等。在該試劑盒中，還包括標(biāo)簽和包裝插頁用以提供試劑盒的使用說明。還可包括符合用戶需要的其它材料，如微量滴定板等等。
在用于結(jié)核病血清學(xué)輔助檢測(cè)的試劑盒中，本發(fā)明的結(jié)核分支桿菌蛋白也可以是經(jīng)過標(biāo)記的。具體可使用酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、金屬螯合物等標(biāo)記。優(yōu)選的標(biāo)記性酶例如，過氧化物酶，堿性磷酸酶，β-D-半乳糖苷酶，蘋果酸脫氫酶，葡萄球菌核酸酶，δ-5-類固醇異構(gòu)酶，α-甘油磷酸脫氫酶，三糖磷酸異構(gòu)酶，辣根過氧化物酶，天冬酰胺酶，葡萄糖氧化酶，核糖核酸酶，尿素酶，過氧化氫酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，葡糖淀粉酶，以及乙酰膽堿酯酶等。優(yōu)選的熒光物質(zhì)有，異硫氰酸熒光素，藻膽蛋白，羅丹明，藻紅蛋白，藻藍(lán)蛋白，別藻藍(lán)蛋白，以及鄰苯二醛。優(yōu)選的發(fā)光物質(zhì)有異魯米諾，光澤精，魯米諾，芳香族吖啶酯，咪唑，吖啶鹽及其修飾型酯，螢光素，螢光素酶，和水母發(fā)光蛋白。優(yōu)選的放射性物質(zhì)有125I，127I，131I，14C，3H，32P，35S等。優(yōu)選的金屬物質(zhì)有膠體金等。
與上述標(biāo)記物結(jié)合的方法是已知的。具體可使用直接和間接標(biāo)記法。常用的直接標(biāo)記法是，將本發(fā)明蛋白與標(biāo)記物通過一種交聯(lián)劑以化學(xué)共價(jià)鍵結(jié)合。交聯(lián)劑有N，N’-鄰亞苯基二馬來酰亞胺，4-(N-馬來酰亞氨甲基)環(huán)己酸N-琥珀酰亞氨酯，6-馬來酰亞氨己酸N-琥珀酰亞氨酯，4，4’-二硫代吡啶，及其它已知的交聯(lián)劑。間接標(biāo)記法的實(shí)例有，將本發(fā)明蛋白與低分子量半抗原如生物素、二硝基苯、吡哆醛、或熒光胺結(jié)合，以及將本發(fā)明蛋白用半抗原的結(jié)合配對(duì)物間接標(biāo)記?？股锼氐鞍缀玩溍箍股锼氐鞍卓勺鳛樯锼氐淖R(shí)別配體使用。
當(dāng)標(biāo)記物為酶時(shí)，其底物和顯色劑可用于測(cè)定其活性。當(dāng)使用過氧化物酶時(shí)，以H2O2作為底物溶液，并以2，2’-連氮-雙-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸]銨鹽(ABTS)、5-氨基水楊酸、鄰苯二胺、4-氨基氨替比林、或3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺等作為顯色劑。當(dāng)使用堿性磷酸酶時(shí)，可用鄰硝基苯磷酸、對(duì)硝基苯磷酸等作為底物。當(dāng)使用β-D-半乳糖苷酶時(shí)，可使用熒光素-二-(β-D-半乳吡喃糖苷)、4-甲基傘形基(umbelliferyl)-β-D-半乳吡喃糖苷等作為底物。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及應(yīng)用包含本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白的試劑或試劑盒對(duì)個(gè)體，例如結(jié)核病疑似患者、疫區(qū)人群或有可能感染結(jié)核桿菌的個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)，以輔助結(jié)核病的診斷或篩選出可疑患者。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種新的結(jié)核病診斷或流行病學(xué)調(diào)查監(jiān)測(cè)方法，所述診斷或流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)通過應(yīng)用包含本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白的試劑或試劑盒，采用常規(guī)的血清學(xué)方法來實(shí)現(xiàn)，例如，可以使用包含本發(fā)明的結(jié)核分支桿菌蛋白的試劑或試劑盒檢測(cè)血清、腦脊液等體液中的抗結(jié)核分支桿菌抗體。檢測(cè)抗結(jié)核分支桿菌抗體的方法有間接試驗(yàn)，如將本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白抗原吸附于固相載體，然后加入待檢血清，如有相應(yīng)抗體存在，則與抗原在載體上形成抗原-抗體復(fù)合物，洗滌后加入酶標(biāo)抗抗體或膠體金標(biāo)記抗抗體，顯色觀察結(jié)果。所述的間接試驗(yàn)方法例如ELISA法、斑點(diǎn)酶免疫滲濾法、斑點(diǎn)金標(biāo)免疫滲濾法等?；蛘?，血清學(xué)檢測(cè)可使用夾心法，例如，使待檢樣品與結(jié)合至不溶性載體的本發(fā)明活性蛋白和標(biāo)記的本發(fā)明蛋白反應(yīng)，檢測(cè)該反應(yīng)產(chǎn)生的夾心復(fù)合物中的抗體量?；蛘哌€可用競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)來進(jìn)行抗結(jié)核分支桿菌抗體的檢測(cè)，例如，使標(biāo)記的抗結(jié)核分支桿菌抗體與樣品中的抗結(jié)核分支桿菌抗體和本發(fā)明蛋白競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)，根據(jù)與本發(fā)明蛋白反應(yīng)的標(biāo)記的抗結(jié)核分支桿菌抗體的量來確定樣品中的抗結(jié)核分支桿菌抗體的量。樣品中抗結(jié)核分支桿菌抗體的效價(jià)高于對(duì)照1-4倍，優(yōu)選2-3倍，更優(yōu)選2倍，在臨床上對(duì)結(jié)核病有輔助診斷意義，在結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查方面有監(jiān)控意義。
任何生物學(xué)樣品，如血漿、血清、血液、尿液、組織液、或腦脊液等體液，只要它們含有抗結(jié)核分支桿菌抗體，就可用本發(fā)明蛋白，包含該蛋白的組合物或試劑盒來檢測(cè)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種新的結(jié)核病診斷或流行病學(xué)調(diào)查監(jiān)測(cè)方法，所述診斷或流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)通過應(yīng)用包含本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白的試劑或試劑盒，采用例如結(jié)核病常用的皮內(nèi)接種皮膚試驗(yàn)來進(jìn)行結(jié)核病的輔助診斷，或進(jìn)行結(jié)核病的流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)。例如，本發(fā)明的蛋白可通過例如，可用Motouw法，滅菌1ml一次性注射器，吸取0.1ml本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白于左前臂掌側(cè)1/3處皮內(nèi)注射，見有皮丘證明注射成功。于注射后24小時(shí)測(cè)量注射局部紅暈或皮下硬結(jié)的橫、縱徑(mm)。注射局部紅暈(或硬結(jié))的平均橫、縱直徑≥5mm為陽性，平均直徑＜5mm或無反應(yīng)(以0表示)為陰性。在結(jié)核病的流行病學(xué)調(diào)查中，健康人群皮內(nèi)接種皮膚試驗(yàn)試劑后，對(duì)皮膚試驗(yàn)反應(yīng)陽性特別是強(qiáng)陽性的健康人群是結(jié)核病預(yù)防需要監(jiān)控的主要人群。
在上述結(jié)核病血清學(xué)檢測(cè)和皮膚檢測(cè)試驗(yàn)中所用到的包含本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白的所有試劑或試劑盒都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。


圖1顯示重組質(zhì)粒酶切圖。表達(dá)質(zhì)粒雙酶切可見約1.1kb片段的目的基因和約4.5kb的線性質(zhì)粒DNA；單酶切表達(dá)質(zhì)粒只見約為5.6kb片段，編碼蛋白的DNA序列在準(zhǔn)確的酶切位點(diǎn)與載體連接成功，重組質(zhì)粒中含有預(yù)表達(dá)蛋白的基因，且插入的外源基因大小與理論一致。
圖2-A-圖2-B為DNA序列圖。該圖顯示DNA序列與設(shè)計(jì)完全符合，突變位點(diǎn)序列正確，與基因組互補(bǔ)部分與基因組DNA序列完全一致。
圖3顯示重組工程菌SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。該圖顯示工程菌在IPTG誘導(dǎo)條件下表達(dá)重組蛋白，工程菌不經(jīng)IPTG誘導(dǎo)幾乎不表達(dá)重組蛋白。
圖4顯示工程菌表達(dá)重組蛋白表達(dá)量。IPTG誘導(dǎo)工程菌全菌體蛋白凝膠電泳掃描顯示，目的蛋白占總菌體蛋白的36％，圖中峰14是本發(fā)明目的重組蛋白。
圖5為本發(fā)明重組蛋白的純化結(jié)果。包涵體溶解液經(jīng)兩次陰離子柱層析獲得純度較高的重組蛋白。層析純化時(shí)，蛋白上樣量為10μg。純化后經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定呈一條帶。
圖6為本發(fā)明蛋白的氨基酸組成分析圖，插入載體中的基因編碼蛋白時(shí)框架準(zhǔn)確，未發(fā)生移碼，氨基酸組成與理論一致，表明本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白核酸分子在大腸桿菌中獲得表達(dá)。
圖7為N端測(cè)序圖。N端序列表明ATG編碼的甲硫氨酸被大腸桿菌中的酶酶解掉，N端氨基酸序列完全準(zhǔn)確；進(jìn)一步表明基因編碼蛋白時(shí)框架準(zhǔn)確未發(fā)生移位。
具體實(shí)施方案在下文中，本發(fā)明參考實(shí)施例進(jìn)行具體闡述，但這些實(shí)施例不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白的制備根據(jù)Pab基因序列，通過PCR技術(shù)對(duì)Pab基因進(jìn)行突變，作者設(shè)計(jì)合成了一對(duì)PCR引物。上游引物a1長(zhǎng)37個(gè)堿基，如序列4所示，5’端設(shè)計(jì)了保護(hù)堿基和NCOI酶切位點(diǎn)(含起始密碼ATG)，下游引物a2長(zhǎng)34個(gè)堿基，如序列5所示，5’端設(shè)計(jì)BamHI酶切位點(diǎn)和終止密碼TAA。以結(jié)核分支桿菌H37Rv基因組DNA為模板，通過高保真的DNA聚合酶PCR技術(shù)獲得編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸(其中5‘端堿基序列為ATGGGCTCT-(序列1)或ATGGGCTCA-(序列2)，其中最末的堿基由原堿基G突變而來。此引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外檢測(cè)呈現(xiàn)特異擴(kuò)增條帶，約為1050bp，符合設(shè)計(jì)要求。PCR產(chǎn)物已去掉N端編碼24個(gè)氨基酸的三聯(lián)密碼(72個(gè)堿基)、原編碼第26位氨基酸的三聯(lián)密碼TCG突變?yōu)門CT、終止密碼為TAA。
多核苷酸和表達(dá)載體經(jīng)NCOI和BamHI酶切后經(jīng)經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳分離，切割含DNA條帶的瓊脂塊，并按DNA快速純化試劑盒說明書回收DNA?；厥盏亩嗪塑账岷蚉ET9d質(zhì)粒表達(dá)載體在T4DNA連接酶作用下連接成重組雜合質(zhì)粒，重組雜合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，通過挑選重組大腸桿菌菌落篩選和鑒定含重組雜合質(zhì)粒的大腸桿菌桿菌JM109，要求重組雜合質(zhì)粒的單酶切和雙酶切圖譜符合圖1。重組雜合質(zhì)粒中插入的目的基因經(jīng)DNA全自動(dòng)測(cè)序證明序列與設(shè)計(jì)完全符合。目的基因序列正確的重組雜合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，該重組大腸桿菌培養(yǎng)至光密度為0.6-0.8時(shí)，加入0.4mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)4-5小時(shí)，收集菌體。在此誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，目的蛋白表達(dá)量經(jīng)凝膠光密度掃描占全菌體蛋白的36％-40％。本發(fā)明蛋白通過核酸序列的改變和載體與宿主細(xì)胞的選擇實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。
實(shí)施例2本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白的純化、復(fù)性和鑒定菌體加入裂解緩沖液(1g細(xì)菌加3ml裂解緩沖液)懸浮菌體。超聲破碎細(xì)菌，功率200W，超聲20秒，間隙20秒，共超聲80次；4℃、12000rpm離心15分鐘，棄上清，沉淀分別用含1％Triton-X100洗滌2-3次。20mmol/LTris.Cl/8M尿素(pH8.0)溶解包涵體，4℃、12000rpm離心15min，收集上清。
包涵體溶解上清液上樣于處理好的DEAE-52陰離子交換柱。上樣完畢，用20mmol/L Tris.Cl/8 M尿素(pH8.0)充分洗去未結(jié)合的蛋白，然后0-0.3MNaCl梯度洗脫，同時(shí)收集蛋白SDS-PAGE電泳檢測(cè)洗脫峰對(duì)應(yīng)收集管的溶液，含目的蛋白的收集管合并透析脫鹽后，再過QFF陰離子柱，0-0.5M NaCl梯度洗脫，SDS-PAGE檢測(cè)洗脫峰，含目的蛋白較多且較純的收集管合并，透析除鹽復(fù)性。復(fù)性過程緩沖液為20mmol/L Tris.Cl/6M尿素(pH8.0)、4℃透析過夜；緩沖液為20mmol/L Tris.Cl/3 M尿素(pH8.0)、4℃透析過夜；緩沖液為20mmol/L Tris.Cl(pH8.0)、4℃透析2天。所有液體中均含5mM巰基乙醇。通過初步降低緩沖液尿素濃度，從而緩慢去掉蛋白中的尿素而達(dá)到復(fù)性。
整個(gè)純化工作是在LKB層析系統(tǒng)儀器上完成。
純化蛋白經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠光密度掃描顯示該蛋白純度接近96％左右，HPLC純度測(cè)定顯示純度也接近96％。
質(zhì)譜法測(cè)定重組蛋白分子量表明本發(fā)明蛋白分子量為35.8KDa。
N端氨基酸序列分析由北京大學(xué)完成，該蛋白N末端15個(gè)氨基酸依次是甘氨酸(G)-絲氨酸(S)-賴氨酸(K)-脯氨酸(P)-脯氨酸(P)-絲氨酸(S)-甘氨酸(G)-絲氨酸(S)-脯氨酸(P)-谷氨酸(E)-蘇氨酸(T)-甘氨酸(G)-丙氨酸(A)-甘氨酸(G)-丙氨酸(A)。N端結(jié)果證明起始氨基酸正確、編碼氨基酸三聯(lián)密碼正確。
等電點(diǎn)測(cè)定為5.64。
氨基酸組成與多肽序列相符。
肽質(zhì)量指紋圖譜分析表明本發(fā)明多肽賴氨酸和精氨酸在多肽序列中位置是準(zhǔn)確的，從而間接證明多肽結(jié)構(gòu)是準(zhǔn)確的。編碼該蛋白的起始密碼ATG編碼的甲硫氨酸不在編碼的蛋白框架內(nèi)。本發(fā)明蛋白的氨基酸組成表明，該蛋白是一種新的結(jié)核分支桿菌蛋白。
實(shí)施例3本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白用于皮膚變態(tài)反應(yīng)原的豚鼠試驗(yàn)豚鼠DTH試驗(yàn)100只300-350g豚鼠隨機(jī)分成兩組，80只豚鼠于皮下注射滅活的結(jié)核桿菌H37Rv 0.2ml，注射后4周進(jìn)行DTH試驗(yàn)。對(duì)照組豚鼠注射0.2ml生理鹽水。所有豚鼠背部去毛，于脊椎兩側(cè)背部相應(yīng)部位分別皮內(nèi)注射0.1ml本發(fā)明蛋白和0.1ml PPD(要求注射部位出現(xiàn)皮丘為準(zhǔn))，注射后24小時(shí)和48小時(shí)檢測(cè)注射部位的紅暈或硬結(jié)橫、縱直徑(mm)，注射局部紅暈(或硬結(jié))橫、縱平均直徑≥5mm為陽性，平均直徑＜5mm或無反應(yīng)(以0表示)為陰性，結(jié)果見表1。
表1本發(fā)明蛋白用于結(jié)核桿菌致敏的豚鼠DTH試驗(yàn)結(jié)果


本發(fā)明蛋白誘導(dǎo)DTH平均硬結(jié)與PPD比值為0.93，結(jié)果表明重組蛋白誘導(dǎo)致敏豚鼠產(chǎn)生與PPD相當(dāng)?shù)腄TH反應(yīng)。
豚鼠DTH特異性試驗(yàn)不同分支桿菌致敏豚鼠，然后進(jìn)行DTH試驗(yàn)。結(jié)果如表2所示。
表2本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白皮試變態(tài)反應(yīng)原免疫特異性檢測(cè)結(jié)果

注直徑大小平均值/累積值；/未檢測(cè)表2結(jié)果表明本發(fā)明蛋白與人型PPD與結(jié)核分支桿菌致敏豚鼠均呈陽性反應(yīng)，本發(fā)明蛋白與堪薩斯分支桿菌和偶發(fā)分支桿菌致敏豚鼠無交叉反應(yīng)、與卡介苗致敏豚鼠和瘰疬分支桿菌致敏豚鼠陽性反應(yīng)率低于人型PPD。
以上試驗(yàn)表明大腸桿菌表達(dá)的本發(fā)明重組蛋白具有良好的變態(tài)反應(yīng)原效力性，誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌致敏豚鼠產(chǎn)生的DTH反應(yīng)與PPD相當(dāng)，但特異性遠(yuǎn)高于PPD。
實(shí)施例4本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白用于皮膚變態(tài)反應(yīng)原的臨床試驗(yàn)臨床試驗(yàn)入選肺結(jié)核患者必需經(jīng)過臨床確診。同體雙臂Motouw法，即滅菌1ml一次性注射器，吸取0.1ml PPD于右前臂掌側(cè)1/3處皮內(nèi)注射，見有皮丘證明注射成功。另取1ml一次性注射器，吸取0.1ml本發(fā)明蛋白于左前臂掌側(cè)1/3處皮內(nèi)注射，見有皮丘證明注射成功。于注射后24小時(shí)和48小時(shí)雙盲判讀結(jié)果，注射局部紅暈(或硬結(jié))橫、縱平均直徑≥5mm為陽性，平均直徑＜5mm或無反應(yīng)(以0表示)為陰性。510例肺結(jié)核病人皮膚試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。
表3肺結(jié)核病人皮膚試驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果

表3表明本發(fā)明蛋白皮膚試驗(yàn)結(jié)果以24-48小時(shí)觀察，24小時(shí)本發(fā)明蛋白皮膚試驗(yàn)陽性反應(yīng)率與48小時(shí)PPD皮膚試驗(yàn)陽性反應(yīng)率相當(dāng)(X2＝3.07，P＞0.05)。
上述試驗(yàn)證明，本發(fā)明蛋白用于結(jié)核病皮試診斷反應(yīng)陽性率與PPD相當(dāng)，能滿足臨床需要，并未見任何副反應(yīng)。相反，用PPD檢測(cè)，5.9％的肺結(jié)核病人PPD皮膚試驗(yàn)出現(xiàn)水泡或淋巴管炎。
實(shí)施例5本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白用于血清診斷ELISA法檢測(cè)291份血清本發(fā)明蛋白每孔包被0.2-1μg，PPD包被0.2-1μg，對(duì)照孔加入包被液。該試驗(yàn)所用包被液為2.94g/L NaHCO3和1.50g/L Na2CO3。包被2小時(shí)以上，棄去液體，然后用PBST洗板3次，每次3分鐘。樣品稀釋液(含0.1％BSA的PBST)1∶100稀釋待檢血清樣品，每孔加100μl，37℃1小時(shí)，同前洗板3次。用樣品稀釋液(含0.1％BSA的PBST)按要求稀釋HRP標(biāo)記的二抗兔抗人IgG，每孔加100μl，37℃1小時(shí)，同前洗板3次，每孔加100μ1顯色液(檸檬酸和磷酸二氫納緩沖液溶解DAB，臨用前加H2O2)顯色，加2M硫酸2滴終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀上測(cè)量各孔490nm波長(zhǎng)處OD。大于對(duì)照OD值2倍為陽性。29l份血清ELISA檢測(cè)結(jié)果見表4。
表4 重組蛋白用ELISA法檢測(cè)血清的結(jié)果


表中結(jié)果表明本發(fā)明蛋白用于肺結(jié)核病人血清檢測(cè)敏感性與PPD相當(dāng)，但特異性高于PPD，特別是受BCG接種影響明顯低于PPD，這對(duì)BCG計(jì)劃接種的國(guó)家采用結(jié)核病血清學(xué)診斷具有重要意義。
實(shí)施例5本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白用于腦脊液診斷斑點(diǎn)酶免疫滲濾法(DIEFA)快速檢測(cè)CSF抗體取合適濃度的本發(fā)明蛋白0.1ml點(diǎn)膜、膜干燥后封閉、加CSF、洗膜、加酶標(biāo)二抗、洗膜、顯色。凡是膜上出現(xiàn)黑色著色斑點(diǎn)判為陽性。整個(gè)操作在15分鐘內(nèi)完成。130份腦脊液樣品用DIEFA檢測(cè)，結(jié)果見表5。
表5本發(fā)明結(jié)核分支桿菌蛋白用于腦脊液診斷的結(jié)果

表5顯示，本發(fā)明蛋白結(jié)核病人腦脊液檢測(cè)陽性率達(dá)55％，特異性達(dá)97％。建立快速檢測(cè)腦脊液中的結(jié)核抗體，可為結(jié)核性腦膜炎快速診斷提供輔助手段。
表4和5結(jié)果表明重組蛋白用于抗體檢測(cè)敏感性較高，并具有較高的特異性。
序列表<110>莊，玉輝何，秀云張，小剛<120>用于結(jié)核病診斷的結(jié)核分支桿菌蛋白<130>PLMD4562N<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1125<212>DNA<213>結(jié)核分支桿菌H37Rv(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)<400>1gtgaaaattc gtttgcatac gctgttggcc gtgttgaccg ctgcgccgct gctgctagca 60gcggcgggct gtggctcgaa accaccgagc ggttcgcctg aaacgggcgc cggcgccggt 120actgtcgcga ctacccccgc gtcgtcgccg gtgacgttgg cggagaccgg tagcacgctg 180ctctacccgc tgttcaacct gtggggtccg gcctttcacg agaggtatcc gaacgtcacg 240atcaccgctc agggcaccgg ttctggtgcc gggatcgcgc aggccgccgc cgggacggtc 300aacattgggg cctccgacgc ctatctgtcg gaaggtgata tggccgcgca caaggggctg 360atgaacatcg cgctagccat ctccgctcag caggtcaact acaacctgcc cggagtgagc 420gagcacctca agctgaacgg aaaagtcctg gcggccatgt accagggcac catcaaaacc 480tgggacgacc cgcagatcgc tgcgctcaac cccggcgtga acctgcccgg caccgcggta 540gttccgctgc accgctccga cgggtccggt gacaccttct tgttcaccca gtacctgtcc 600
aagcaagatc ccgagggctg gggcaagtcg cccggcttcg gcaccaccgt cgacttcccg660gcggtgccgg gtgcgctggg tgagaacggc aacggcggca tggtgaccgg ttgcgccgag720acaccgggct gcgtggccta tatcggcatc agcttcctcg accaggccag tcaacgggga780ctcggcgagg cccaactagg caatagctct ggcaatttct tgttgcccga cgcgcaaagc840attcaggccg cggcggctgg cttcgcatcg aaaaccccgg cgaaccaggc gatttcgatg900atcgacgggc ccgccccgga cggctacccg atcatcaact acgagtacgc catcgtcaac960aaccggcaaa aggacgccgc caccgcgcag accttgcagg catttctgca ctgggcgatc 1020accgacggca acaaggcctc gttcctcgac caggttcatt tccagccgct gccgcccgcg 1080gtggtgaagt tgtctgacgc gttgatcgcg acgatttcca gctag 1125<210>2<211>1056<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述序列1的突變<400>2atgggctcta aaccaccgag cggttcgcct gaaacgggcg ccggcgccgg tactgtcgcg 60actacccccg cgtcgtcgcc ggtgacgttg gcggagaccg gtagcacgct gctctacccg120ctgttcaacc tgtggggtcc ggcctttcac gagaggtatc cgaacgtcac gatcaccgct180cagggcaccg gttctggtgc cgggatcgcg caggccgccg ccgggacggt caacattggg240gcctccgacg cctatctgtc ggaaggtgat atggccgcgc acaaggggct gatgaacatc300gcgctagcca tctccgctca gcaggtcaac tacaacctgc ccggagtgag cgagcacctc360aagctgaacg gaaaagtcct ggcggccatg taccagggca ccatcaaaac ctgggacgac420ccgcagatcg ctgcgctcaa ccccggcgtg aacctgcccg gcaccgcggt agttccgctg480caccgctccg acgggtccgg tgacaccttc ttgttcaccc agtacctgtc caagcaagat540cccgagggct ggggcaagtc gcccggcttc ggcaccaccg tcgacttccc ggcggtgccg600ggtgcgctgg gtgagaacgg caacggcggc atggtgaccg gttgcgccga gacaccgggc660tgcgtggcct atatcggcat cagcttcctc gaccaggcca gtcaacgggg actcggcgag720
gcccaactag gcaatagctc tggcaatttc ttgttgcccg acgcgcaaag cattcaggcc780gcggcggctg gcttcgcatc gaaaaccccg gcgaaccagg cgatttcgat gatcgacggg840ccggccccgg acggctaccc gatcatcaac tacgagtacg ccatcgtcaa caaccggcaa900aaggacgccg ccaccgcgca gaccttgcag gcatttctgc actgggcgat caccgacggc960aacaaggcct cgttcctcga ccaggttcat ttccagccgc tgccgcccgc ggtggtgaag 1020ttgtctgacg cgttgatcgc gacgatttcc agctaa 1056<210>3<211>350<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述重組的<400>3Gly Ser Lys Pro Pro Ser Gly Ser Pro Glu Thr Gly Ala Gly Ala Gly1 5 10 15Thr Val Ala Thr Thr Pro Ala Ser Ser Pro Val Thr Leu Ala Glu Thr20 25 30Gly Ser Thr Leu Leu Tyr Pro Leu Phe Asn Leu Trp Gly Pro Ala Phe35 40 45His Glu Arg Tyr Pro Asn Val Thr Ile Thr Ala Gln Gly Thr Gly Ser50 55 60Gly Ala Gly Ile Ala Gln Ala Ala Ala Gly Thr Val Asn Ile Gly Ala65 70 75 80Ser Asp Ala Tyr Leu Ser Glu Gly Asp Met Ala Ala His Lys Gly Leu85 90 95Met Asn Ile Ala Leu Ala Ile Ser Ala Gln Gln Val Asn Tyr Asn Leu100 105 110
Pro Gly Val Ser Glu His Leu Lys Leu Asn Gly Lys Val Leu Ala Ala115 120 125Met Tyr Gln Gly Thr Ile Lys Thr Trp Asp Asp Pro Gln Ile Ala Ala130 135 140Leu Asn Pro Gly Val Asn Leu Pro Gly Thr Ala Val Val Pro Leu His145 150 155 160Arg Ser Asp Gly Ser Gly Asp Thr Phe Leu Phe Thr Gln Tyr Leu Ser165 170 175Lys Gln Asp Pro Glu Gly Trp Gly Lys Ser Pro Gly Phe Gly Thr Thr180 185 190Val Asp Phe Pro Ala Val Pro Gly Ala Leu Gly Glu Asn Gly Asn Gly195 200 205Gly Met Val Thr Gly Cys Ala Glu Thr Pro Gly Cys Val Ala Tyr Ile210 215 220Gly Ile Ser Phe Leu Asp Gln Ala Ser Gln Arg Gly Leu Gly Glu Ala225 230 235 240Gln Leu Gly Asn Ser Ser Gly Asn Phe Leu Leu Pro Asp Ala Gln Ser245 250 255Ile Gln Ala Ala Ala Ala Gly Phe Ala Ser Lys Thr Pro Ala Asn Gln260 265 270Ala Ile Ser Met Ile Asp Gly Pro Ala Pro Asp Gly Tyr Pro Ile Ile275 280 285Asn Tyr Glu Tyr Ala Ile Val Asn Asn Arg Gln Lys Asp Ala Ala Thr290 295 300Ala Gln Thr Leu Gln Ala Phe Leu His Trp Ala Ile Thr Asp Gly Asn305 310 315 320Lys Ala Ser Phe Leu Asp Gln Val His Phe Gln Pro Leu Pro Pro Ala325 330 335Val Val Lys Leu Ser Asp Ala Leu Ile Ala Thr Ile Ser Ser340 345 350
<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述上游引物<400>4cgcatgccat gggctctaaa ccaccgagcg gttcgcc 3718<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述下游引物<400>5cgggatccaa tgctggaaat cgtcgcgatc aacg 3權(quán)利要求
1.一種核酸，其具有如序列2所示的核苷酸序列。
2.一種結(jié)核分支桿菌蛋白的基因工程重組制備方法，其特征在于應(yīng)用權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建表達(dá)載體，并在該載體所適合的原核宿主細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求1所述核酸編碼的結(jié)核分支桿菌蛋白。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述表達(dá)載體為PET9d、PET22b(+)或PET15b質(zhì)粒。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21(DE3)或HMS174(DE3)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的方法制備的結(jié)核分支桿菌蛋白。
6.包含權(quán)利要求5的結(jié)核分支桿菌蛋白的組合物。
7.權(quán)利要求6所述的組合物，其為結(jié)核病診斷試劑。
8.權(quán)利要求6所述的組合物，其為結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查監(jiān)測(cè)試劑。
9.包含權(quán)利要求5的結(jié)核分支桿菌蛋白的試劑盒。
10.權(quán)利要求9的試劑盒，其為結(jié)核病診斷及結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查監(jiān)測(cè)試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可用于結(jié)核病診斷和結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)的結(jié)核分支桿菌蛋白，編碼該多肽的多核苷酸，包含該多核苷酸的雜合質(zhì)粒和原核宿主細(xì)胞。本發(fā)明還包括制備該蛋白的方法。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1696289SQ200410044568
公開日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2004年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月11日
發(fā)明者莊玉輝, 何秀云, 張小剛 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三○九醫(yī)院