專利名稱：一種脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物中一種與脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因，特別涉及一種脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白及其編碼基因。
背景技術(shù)：
干旱、高鹽及低溫等逆境脅迫是影響小麥生長、發(fā)育的障礙因子。因此，了解小麥對逆境條件的應(yīng)答與信號傳導(dǎo)機制，提高小麥品種的抗逆性，成為小麥遺傳研究及小麥品種改良的重要任務(wù)之一。
在逆境脅迫下植物體內(nèi)會產(chǎn)生一系列應(yīng)答反應(yīng)，伴隨著許多生理生化及發(fā)育上的變化。明確植物對逆境的反應(yīng)機制，將為抗逆基因工程研究和應(yīng)用提供科學(xué)論據(jù)。目前，植物抗逆性研究已逐漸深入到細胞、分子水平，并與遺傳學(xué)和遺傳工程研究相結(jié)合，探索用生物技術(shù)來改進植物生長特性，其目的是提高植物對逆境的適應(yīng)能力。
在干旱、高鹽和低溫等環(huán)境脅迫的逆境條件下，植物能夠在分子、細胞和整體水平上做出相應(yīng)的調(diào)整，以最大程度上減少環(huán)境所造成的傷害并得以生存。許多基因受脅迫誘導(dǎo)表達，這些基因的產(chǎn)物不僅能夠直接參與植物的脅迫應(yīng)答，而且能夠調(diào)節(jié)其它相關(guān)基因的表達或參與信號傳導(dǎo)途徑，從而使植物避免或減少傷害，增強對脅迫環(huán)境的抗性。與脅迫相關(guān)的基因產(chǎn)物可以分為兩大類第一類基因編碼的產(chǎn)物包括離子通道蛋白、水通道蛋白、滲透調(diào)節(jié)因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜堿等)合成酶等直接參與植物脅迫應(yīng)答的基因產(chǎn)物；第二類基因編碼的產(chǎn)物包括參與脅迫相關(guān)的信號傳遞和基因表達調(diào)節(jié)的蛋白因子，如蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等。其中，轉(zhuǎn)錄因子在植物脅迫應(yīng)答的基因表達調(diào)控中起著重要作用。
轉(zhuǎn)錄因子也稱為反式作用因子，是能夠與真核基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性作用的DNA結(jié)合蛋白，通過它們之間以及與其它相關(guān)蛋白之間的相互作用，激活或抑制轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)決定了它與順式作用元件結(jié)合的特異性，而轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)決定了它對基因表達起激活或是抑制作用。此外，其自身活性還受到核定位及寡聚化等作用的影響。
目前已知在植物中與脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子主要有具有AP2結(jié)構(gòu)域的AP2(APETALA2)/EREBP(乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，ethylene responsive element bindingprotein)轉(zhuǎn)錄因子家族、含有堿性區(qū)域和亮氨酸拉鏈的bZIP(basic region/leucine zipper motif transcription factors)類轉(zhuǎn)錄因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族、含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉鏈的MYC家族和具有色氨酸簇(Trp cluster)的MYB家族。這五個轉(zhuǎn)錄因子家族，除WRKY家族不參與植物的水脅迫反應(yīng)外，其它四個家族均參與調(diào)節(jié)植物對干旱、高鹽和低溫等的逆境脅迫反應(yīng)。其中，AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子在高等植物中廣泛存在，它是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，近年來，在擬南芥、煙草、玉米、水稻、大豆和油菜中均有報道，這表明AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子在高等植物中普遍存在并具有重要作用。
DREB(脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，DRE-binding protein)類轉(zhuǎn)錄因子是AP2家族中EREBP-like亞家族中的一個成員。DREB和EREBP類轉(zhuǎn)錄因子它們在氨基酸序列上沒有顯著的相同性，但都含有一段非常保守的由58個左右氨基酸組成的DNA結(jié)合區(qū)域(EREBP/AP2結(jié)構(gòu)域)。蛋白質(zhì)三維分析表明，該區(qū)域含有3個β-折疊，對識別各類順式作用元件起關(guān)鍵作用。其中位于第二個β-折疊中的第14、19位的兩個氨基酸殘基的差異，決定這類轉(zhuǎn)錄因子與不同順式作用元件的特異結(jié)合。DREB類轉(zhuǎn)錄因子第14位氨基酸是纈氨酸(V14)，第19位氨基酸是谷氨酸(E19)，其中第19位的氨基酸并不保守，例如水稻的OsDREB1轉(zhuǎn)錄因子的第19位氨基酸就是纈氨酸(Dubouzet J.G.，Sakuma Y.，Ito Y.，Kasuga M.，Dubouzet E.G.，Miura S.，SekiM.，Shinozaki K.，Yamaguchi-Shinozaki K.，OsDREB genes in RICE，Oryza sativaL.，encode transcription activators that function in drought-，high-salt-and cold-responsive gene expression.The Plant Journal，2003，33751-763)。在DREB相關(guān)蛋白中決定DNA結(jié)合的特異性方面，V14的作用明顯要比E19重要(Sakuma Y.，Liu Q.，Dubouzet J.G.，Abe H.，Shinozaki K.andYamaguchi-Shinozaki K.，DNA-Binding specificity of the ERF/AP2 domain ofArabidopsis DREBs，transcription factors involved in dehydration-andcold-Inducible gene expression.Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，2002，290998-1009)；而ERF類轉(zhuǎn)錄因子第14位氨基酸是甘氨酸，第19位是天冬氨酸，因而DREB特異結(jié)合DRE/CRT順式元件，ERF特異結(jié)合GCC-盒。AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域的C-端區(qū)還包含1個由18個氨基酸殘基組成的核心序列，該序列形成雙親性的α-螺旋，該α-螺旋可能參與同其它轉(zhuǎn)錄因子及DNA間的相互作用。
目前，在許多植物中都發(fā)現(xiàn)這種含有EREBP/AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，并分別與抗病、抗逆等信號傳遞有關(guān)(劉強，趙南明，Yamaguchi-Shinozaki K.，ShinozakiK.，DREB轉(zhuǎn)錄因子在提高植物抗逆性中的作用.科學(xué)通報，2000，第45卷111-16)。劉強等認為，一個DREB基因可以調(diào)控多個與植物干旱、高鹽及低溫耐性有關(guān)的功能基因的表達(劉強，趙南明，Yamaguchi-Shinozaki K.，Shinozaki K.，DREB轉(zhuǎn)錄因子在提高植物抗逆性中的作用.科學(xué)通報，2000，第45卷111-16)。Kasuga等的研究證實，導(dǎo)入到擬南芥的DREB1A基因可以同時促進與逆境脅迫耐性有關(guān)的基因rd29、rd17、kin1、cor6.6、cor15a以及erd10的表達，轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性大大增強(Kasuga M.，Liu Q.，Miura S.，Yamaguchi-Shinozaki K.，Shinozaki K.，Improving plant drought，salt，and freezing tolerance by gene transfer of asingle stress-inducible transcription factor.Nature Biotechnology，1999，17287-292)。同樣，低溫耐性轉(zhuǎn)錄因子CBF1的轉(zhuǎn)基因植株的耐低溫能力有顯著提高(Jaglo-Ottosen K.R.，Gilmour S.J.，Zarka D.G.，Schabenberger O.，Thomashow M.F.，Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes andenhances freezing tolerance.Science，1998 280(5360)104-106)。由于植物的逆境耐性是由多基因調(diào)控的復(fù)雜性狀，依靠導(dǎo)入單個功能性蛋白基因很難實現(xiàn)植物抗逆性的綜合提高。因此，利用一個關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子促進多個功能基因的表達，從而增強植物的抗逆性，已經(jīng)成為植物抗逆基因工程的研究熱點。
根據(jù)含DNA結(jié)合區(qū)的數(shù)目，AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子分為AP2(APETALA2)和乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白EREBP(ethylene-responsive element binding protein)以及RAV三個大類型。AP2型轉(zhuǎn)錄因子包括擬南芥的AP2、ANT，玉米的Glossy、idsl等。這種類型的轉(zhuǎn)錄因子含有兩個AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，調(diào)節(jié)細胞的生長發(fā)育，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)14個AP2型轉(zhuǎn)錄因子基因；EREBP型轉(zhuǎn)錄因子僅含1個AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，調(diào)節(jié)植物對激素(乙烯)、病原、低溫、干旱及高鹽等地分子應(yīng)答反應(yīng)。EREBP型轉(zhuǎn)錄因子中，已發(fā)現(xiàn)有煙草EREBP1-4、番茄Pti4-6、擬南芥RAV1-2、AtEBP、AtERF1-5、DREB1A-C(CBF1-3)和DREB2A-B等許多成員，分別與細胞發(fā)育、激素、抗病、低溫及干旱、高鹽等信號傳遞有關(guān)。這些EREBP型轉(zhuǎn)錄因子又可以再分為EREBP(ethylene-responsive element binding protein，即ERF)亞組，包括煙草EREBP1-4、番茄Pti4-6、擬南芥AtEBP、AtERF1-5、這類轉(zhuǎn)錄因子與含核心序列AGCCGCC的GCC-盒特異結(jié)合，因此，它的DNA結(jié)合區(qū)又稱為GCC-盒結(jié)合域(GCC-boxbinding domain，GBD)，其中第2個G、第5個G、第7個C對ERF蛋白的識別有重要作用(Hao D.，Ohme-Takagi M.，Sarai A.，Unique mode of GCC box recognitionby the DNA-binding domain of ethylene responsive element-binding factor(ERFdomain)in plant.The Journal of Biological Chemistry，1998，27326857-26861)。用核磁共振對其三維空間結(jié)構(gòu)的研究表明，AtERF1的GBD通過形成3個反向的β-片層與其靶序列GCC-盒的大溝相結(jié)合；DREBP亞組，包括擬南芥DREB1A-C(CBF1-3)和DREB2A-B，這類轉(zhuǎn)錄因子在干旱、高鹽、低溫下特異結(jié)合干旱應(yīng)答元件DRE/CRT，在擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn)124個DREBP型轉(zhuǎn)錄因子基因；RAV型轉(zhuǎn)錄因子包括擬南芥RAV1、RAV2、含有兩個不同的DNA結(jié)合區(qū)-ERF/AP2和B3，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)6個RAV型轉(zhuǎn)錄因子基因。還有一類特殊的轉(zhuǎn)錄因子AL079349，它與以上的轉(zhuǎn)錄因子都不同，自成一類。
最近發(fā)現(xiàn)EREBPs蛋白參與了干旱、高鹽和低溫脅迫的信號傳導(dǎo)和基因表達調(diào)控。Mine等人從低溫儲藏的土豆塊莖中分離到了EREBP轉(zhuǎn)錄因子CIP353，受低溫脅迫誘導(dǎo)強烈表達(Mine T.，Hiyoshi T.，Kasaoka K.，Ohyama A.，2003.CIP353 Encodesan AP2/ERF-Domain Protein in Potato(Solanum tuberosum L.)and RespondsSlowly to Cold Stress.Plant Cell Physiol.，4410-15)，說明可能有EREBP蛋白參與了受低溫脅迫的基因表達調(diào)控。Park等利用西紅柿為材料，得到了受高鹽、乙烯或茉莉酸誘導(dǎo)表達的EREBP轉(zhuǎn)錄因子Tsi基因，EMSA(Electrophoretic mobilityshift assays)試驗分析發(fā)現(xiàn)，Tsi蛋白與GCC-box和DRE/CRT順式元件都能結(jié)合(Park J.M.，Park C.J.，Lee S.B.，Ham B.K.，Shin R.，and Paek K.H.，Overexpression of the Tobacco Tsi1 gene encoding an EREBP/AP2-Type transcriptionfactor enhances resistance against pathogen attack and osmotic stress inTobacco.The Plant Cell，2001，131035-1046)，盡管前者結(jié)合能力大于后者，但說明，某些EREBP蛋白能激活受滲透脅迫誘導(dǎo)表達的基因。在正常生長條件下，Tsi基因的超量表達提高了轉(zhuǎn)基因植株(35S::Tsi1)的耐鹽性、增強了抗病性(ParkJ.M.，Park C.J.，Lee S.B.，Ham B.K.，Shin R.，and Paek K.H.，Over expressionof the Tobacco Tsi1 gene encoding an EREBP/AP2-Type transcription factorenhances resistance against pathogen attack and osmotic stress in Tobacco.The Plant Cell，2001，131035-1046)，以上說明了Tsi基因可能參與了生物脅迫和非生物脅迫兩條信號傳導(dǎo)途徑。由高鹽脅迫激活的一條類MAPK信號傳遞模式(包括SIMKK和SIMK)，將脅迫信號傳遞給EIN2(在乙烯信號傳遞途徑的CTR1下游)(Guo H.W.and Ecker J.，The ethylene signaling pathwaynew insights.CurrentOpinion in Plant Biology，2004，740-49)，最后激活某些EREBPs轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控滲透脅迫相關(guān)基因的表達，提高植物的耐鹽性。對于是否存在含GCC-box元件，且表達產(chǎn)物直接參與非生物脅迫響應(yīng)的基因，還有待作進一步的證實。
綜合目前的研究結(jié)果，植物在逆境脅迫條件下的信號傳遞途徑至少有以下六條途徑(1)依賴于ABA的信號傳遞途徑有三條受干旱、高鹽誘導(dǎo)，激活MYB、MYC類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有MYBR或MYCR順式作用元件的靶基因；受干旱、高鹽誘導(dǎo)，激活A(yù)BF/AREB類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有ABRE順式作用元件的靶基因；受干旱、高鹽誘導(dǎo)，激活CBF4，DREB1類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有DRE/CRT順式作用元件的靶基因。(2)不依賴于ABA的信號傳遞途徑有三條受干旱、高鹽誘導(dǎo)，激活DREB2類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有DRE/CRT順式作用元件的靶基因；受低溫誘導(dǎo)，激活CBF1-3/DREB1A-C類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有DRE/CRT順式作用元件的靶基因；受干旱、高鹽或乙烯誘導(dǎo)，激活ERF類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有DRE/CRT或GCC順式作用元件的靶基因。
用酵母單雜交系統(tǒng)證明轉(zhuǎn)錄因子的激活特性的主要原理如圖3所示，將DRE順式作用元件和突變體DRE順式作用元件分別構(gòu)建到pHISi-1載體和pLacZi載體的基本啟動子Pmin(minimal promoter)上游，Pmin啟動子下游連接報道基因(His3、LacZ和URA3)。當連接有編碼轉(zhuǎn)錄因子的目的基因的表達載體YEP-GAP(不含激活功能)分別轉(zhuǎn)化到連有DRE順式作用元件和突變體DRE順式作用元件的酵母細胞后，如果連有突變體DRE順式作用元件的酵母細胞中的報道基因不能表達，而連有特定的DRE順式作用元件的酵母細胞中的報道基因能夠表達，說明該轉(zhuǎn)錄因子能與DRE順式作用元件結(jié)合，且具有激活功能，激活了Pmin啟動子，促使報道基因表達。從而證明了目的轉(zhuǎn)錄因子的體內(nèi)結(jié)合特異性和激活功能。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，名稱為TaDREB5，來源于小麥屬小麥(Triticum aestivum L.)，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列2的氨基酸殘基序列是由394個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，自氨基端第75位-81位氨基酸殘基序列和第111位-115位氨基酸殘基序列為兩個可能的核定位信號區(qū)，自氨基端第138位-195位氨基酸殘基序列為保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域。
脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白編碼基因，名稱為TaDREB5，來源于小麥屬小麥(Triticumaestivum L.)，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；
2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列1中的cDNA序列由2354個堿基組成，該基因的開放閱讀框架為自5′端第135位-1319位堿基，共編碼394個氨基酸(序列表中的序列2)。
含有本發(fā)明基因的表達載體及細胞系均屬于本發(fā)明的保護范圍。
擴增TaDREB5中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
實驗證明本發(fā)明的TaDREB5在干旱和高鹽的誘導(dǎo)下表達，并且可以特異的調(diào)控含有DRE/CRT順式元件(核心序列CCGAC)的基因的轉(zhuǎn)錄表達，本發(fā)明的TaDREB5為人為控制抗逆和耐逆相關(guān)基因的表達提供了基礎(chǔ)，將在培育抗逆性和耐逆性增強的植物育種中發(fā)揮重要的作用。


圖1為TaDREB5與小麥TaDREB氨基酸序列的同源性比對結(jié)果圖2a-2c為TaDREB5受脅迫誘導(dǎo)表達的Nothern雜交圖譜圖3為用酵母單雜交系統(tǒng)證明轉(zhuǎn)錄因子的體內(nèi)結(jié)合特異性和激活特性的原理示意圖具體實施方式
實施例1、TaDREB5的克隆一、mRNA的分離將水培生長10天左右的小麥三葉期幼苗按如下方法進行干旱處理2小時將幼苗小心取出，注意不要傷根，用干凈的吸水紙將葉片及根部的水分吸干，再將幼苗放在干凈的吸水紙上，置于陰涼處2小時。然后用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆?。采用Quikprep Micro mRNA Purification Kit(Pharmacia)進行mRNA的分離。
將水培的生長10天左右的小麥三葉期幼苗進行干旱處理2小時(處理方法將幼苗小心的取出，注意不要傷根，用干凈的吸水紙將葉片及根部的水分吸干，再將幼苗放在干凈的吸水紙上，置于陰涼處2小時)，用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆?。采用Quikprep Micro mRNA Purification Kit(Pharmacia)進行mRNA的分離。
二、cDNA文庫的構(gòu)建及滴度測定1、cDNA文庫的構(gòu)建采用TimesaverTMcDNA Synthesis Kit(Pharmacia)將步驟一中分離得到的mRNA合成cDNA雙鏈，并加EcoRI/NotI adaptor；采用ZAP ExpressPredigestedGigapackIII Gold Cloning Kit(Stratagene)進行cDNA文庫的構(gòu)建，共得到500ul庫液。
2、滴度的測定(1)取1ul庫液用SM Buffer稀釋1000倍；(2)分別取1ul，10ul，100ul稀釋液入三個10ml離心管中，分別加100ul感受態(tài)宿主菌XL1-Blue MRF’(OD600為1.0)，于37℃溫浴20min；(3)分別加入3ml頂膠(50℃)混勻，立即鋪于固體NZY平板上，凝固后倒置，37℃培養(yǎng)過夜；(4)根據(jù)平板噬菌斑數(shù)，求平均值，即為庫容量。
計算公式 經(jīng)計算，該cDNA文庫的滴度為3.0×106個噬菌斑。
三、cDNA文庫的篩選1、探針的準備根據(jù)已克隆的DREB基因的AP2保守區(qū)序列設(shè)計引物WAPF和WAPR，以普通小麥的cDNA為模板進行PCR擴增，程序及體系如下引物序列WAPF5’ACC GCG GTG TGA GGC AGA GGA 3’WAPR5’TGA GAA GTT GAC ACG TGC TTT GGC 3’反應(yīng)體系(50μl)模板(60ng/ul)0.5μldNTP(10mM) 1μl引物(25μM) 1μl10×buffer 5μlddh2O 42.1μlTaq(5U/μl) 0.4μl擴增條件(PTC-200) 取擴增產(chǎn)物2ul在1.2％瓊脂糖凝膠中電泳檢測，溴化乙啶染色，紫外凝膠成像儀掃描觀察，在180bp的位置處是否有一條亮帶。
2、探針的回收采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.DV805A)回收純化探針。
(1)在紫外燈下迅速切下含有目的DNA片段的帶，大概在180bp的位置處，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎。計算凝膠重量(提前記錄1.5ml離心管重量)，該重量作為一個凝膠體積(如100mg＝100ul)；加入3個凝膠體積的DR-I溶液，混合均勻后于75℃加熱，間斷混合，直至凝膠塊完全熔化(約6-8min)；(2)加0.5個DR-I體積的DR-II溶液，再加入異丙醇至終濃度為20％，混合均勻；(3)吸取步驟(2)中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管(置于2ml離心管中)，3600rpm離心1min，棄濾液；(4)將制備管置回離心管，加0.5ml RinseA溶液，3600rpm離心30s，棄濾液；(5)將制備管置回離心管，加0.7ml RinseB溶液，3600rpm離心30s，棄濾液。以同樣的方法再用0.7ml RinseB溶液洗滌一次；(6)將制備管置于離心管中，最高速度離心1min；(7)將制備管置于潔凈的1.5ml離心管中，在DNA制備膜正中央加25ul水，室溫靜置1min，最高速度離心1min洗脫DNA。
(8)洗脫出的即為目的DNA，保存?zhèn)溆谩?br> 其中，DR-I溶液凝膠熔化劑(含DNA保護劑，防止DNA在高溫下降解)。室溫密閉貯存(TaKaRa公司，Code No.DV805A)。
DR-II溶液高離液序列溶液(促使大于100bp的DNA片段選擇性結(jié)合到DNA制備膜上)。室溫密閉貯存。若出現(xiàn)沉淀，應(yīng)于70℃溫育溶解并冷卻至室溫后再使用(TaKaRa公司，Code No.DV805A)。
RinseA溶液洗滌液。室溫密閉貯存(TaKaRa公司，Code No.DV805A)。
RinseB溶液洗滌液。室溫密閉貯存(TaKaRa公司，Code No.DV805A)。
3、轉(zhuǎn)膜(1)取1ul庫液(見cDNA文庫的構(gòu)建部分)，在直徑150mm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)噬菌體，大概6.0×103pfu；(2)噬菌斑培養(yǎng)好后需要放在4℃冷卻，臨用時取出置于超凈臺吹干，防止轉(zhuǎn)膜時頂膠被膜粘起；(3)將Hybrond-N+膜剪成圓形，比直徑為150mm的培養(yǎng)皿稍小，用鉛筆在膜上表明編號及日期(與培養(yǎng)皿對應(yīng))；(4)用鑷子夾住膜兩邊，有字面朝上，中間先接觸平板，慢慢松開，不要移動，不要有氣泡，使膜自然攤平，完全攤平后，計時；(5)用注射器針頭在膜上扎三個不對稱的孔，在培養(yǎng)皿背面對應(yīng)的位置用記號筆做好標記；(6)3min后，用鑷子從一邊開始輕輕揭起膜，不要帶起頂膠；(7)將膜迅速放入盛有變性液的培養(yǎng)皿中(放一層濾紙及15ml變性液)變性7min，有字面朝下，注意避免溶液到達膜的上表面；(8)將膜轉(zhuǎn)移至盛有中和液的培養(yǎng)皿中(放一層濾紙及15ml中和液)中和兩次，每次3min；(9)然后將膜轉(zhuǎn)入漂洗液中洗30min，可輕輕搖動；(10)取出膜，在干凈的濾紙上吸干，有字面朝下；(11)用保鮮膜將膜包好，在紫外交聯(lián)儀上交聯(lián)1min，4℃存放備用；其中，變性液NaCl1.5M(87.75g/1000ml)NaOH0.5M(20g/1000ml)中和液NaCl1.5M(87.75g/1000ml)Tris0.5M(60.57g/1000ml)EDTA0.001M (2ml 0.5M貯存液/1000ml)加入700-800ml水溶解，用HCl調(diào)pH值至8.0，最后定容至1000ml。
漂洗液Tris-HCl(pH7.5) 0.2M(200ml 1.0M貯存液/1000ml)2×SSC(100ml 20×SSC/1000ml)4、預(yù)雜交和雜交反應(yīng)根據(jù)要雜交的膜的數(shù)量配制預(yù)雜交液，每10ml預(yù)雜交液的成分組成如下。
ddH2O 6.5ml5×HSB 2mlDenHardt’sIII 1ml*ssDNA(鮭魚精DNA，Sigma)(10mg/ml) 0.5ml*ssDNA加入之前需變性煮沸10min后立即放冰上10min。
其中，5×HSB(pH6.8)分子量(MW) g/200mlNaCl(3M) 58.44 35.064PIPES(0.1M) 302.4 6.048EDTA(20mM) 372.24 1.488Denhardt’sIIIg/100ml
2％Gelatin 22％Ficoll-40022％PVP-360 210％SDS 105％Na4P2O·10H2O 5將預(yù)雜交液混勻，于65℃預(yù)熱至澄清后放入尼龍膜，65℃預(yù)雜交5-6h(新膜)；探針標記完后，加入等體積的0.4N NaOH溶液，混勻后于室溫靜置10min使探針變性，然后加入到預(yù)雜交液中，65℃雜交過夜；5、洗脫在55℃-65℃條件下洗膜。
I洗2×SSC/0.5％SDS，洗兩次，每次15min；II洗0.1×SSC/0.1％SDS，洗膜過程中檢測信號強度，確定洗脫時間。
用濾紙吸干洗好的膜，保鮮膜包好，壓X-光片。
6、陽性克隆的二輪篩選(1)將X光片與膜對齊，確定位置，描下膜上的三個不對稱點的位置；(2)在讀片機上放上X光片及相應(yīng)的培養(yǎng)皿，根據(jù)不對稱點使培養(yǎng)皿定位；(3)用去頭的1ml槍頭取出確定的陽性雜交斑，放在1ml SM緩沖溶液中，加入50ul氯仿；(4)振蕩30秒，室溫放置1小時，離心，取上清；(5)取10-50ul上清再次鋪板，培養(yǎng)噬菌體進行二次篩選；(6)二次篩選的步驟同上轉(zhuǎn)膜、預(yù)雜交和雜交反應(yīng)、洗脫、壓X-光片，得到單個陽性噬菌斑。
四、得到TaDREB51、集群內(nèi)刪除(Mass excision)(1)制備XL1-Blue MRF’和XLOLR菌。用液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)XL1-Blue MRF’和XLOLR菌，30℃過夜，培養(yǎng)基中添加0.2％(w/v)麥芽糖、10mM MgSO4和抗生素，分別為12.5μg/ml四環(huán)素和50μg/ml卡那霉素；(2)第二天，1000×g離心10min收集菌體，用10mM MgSO4重懸，使OD600達到1.0；(2)在一個10ml的無菌離心管中加入1μl庫液(見cDNA文庫的構(gòu)建部分)(約含6.0×103噬菌體顆粒)XL1-Blue MRF’ 200μl(OD600為1.0)
ExAssist助手噬菌體 2μl(＞1×1010pfu/ml)(3)37℃溫育15min；(4)加入20ml液體NZY培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)2.5-3h；(5)65-70℃加熱20min；(6)1000×g離心10min，上清移至一個新管中；(7)在一個1.5ml的離心管中混合200μl XLOLR菌和1μl上清；(8)37℃溫育15min；(9)取10μl、100μl菌液分別涂于LB固體培養(yǎng)基(含氨芐50μg/ml)上，37℃培養(yǎng)過夜。
2、cDNA文庫插入片段的檢查(1)隨機挑取步驟1中集群內(nèi)刪除的單菌落，提取它們的質(zhì)粒DNA；(2)用限制內(nèi)切酶EcoR I(Takara)消化，反應(yīng)體系10μl10×緩沖液H 1μlEcoR I(12U/μl) 0.5μl質(zhì)粒DNA 2μlddH2O 6.5μl(3)37℃消化2h，0.8％瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)95％以上的載體有插入片段，說明95％以上的噬菌體含有重組子，因此文庫實際含有的重組子為2.85×106(cDNA文庫的滴度為3.0×106)。50％以上的重組子的插入片段在800bp-4Kb之間，說明構(gòu)建的文庫較完整。
3、單克隆內(nèi)刪除(Single-clone excision)(1)將得到單個陽性噬菌斑(見三、cDNA文庫的篩選部分的步驟6二次篩選cDNA文庫)從平板上摳下，放入到一個無菌的、已加有500μl SM緩沖液和20μl氯仿的離心管中，漩渦振蕩10sec，4℃儲存；(2)用液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)XL1-Blue MRF’和XLOLR菌，30℃過夜，培養(yǎng)基中添加0.2％(w/v)麥芽糖、10mM MgSO4和抗生素，分別為12.5μg/ml四環(huán)素和50μg/ml卡那霉素；(3)第二天，1000×g離心10min收集菌體，用10mM MgSO4重懸，使OD600達到1.0；(4)在一個10ml的無菌離心管中加入XL1-Blue MRF’ 200μl(OD600為1.0)噬菌體貯存液 250μl(至少含1×105噬菌體顆粒)
ExAssist助手噬菌體1μl(＞1×1010pfu/ml)(5)37℃溫育15min；(6)加入3ml液體NZY培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)2.5-3h；(7)于65-70℃水浴離心管20min，然后1000×g離心15min；(8)將上清移至一個新的離心管中，即為噬菌粒懸浮液；(9)在一個1.5ml的離心管中加入200μl步驟(3)制備好的XLOLR菌和步驟(8)制備好的噬菌粒懸浮液100μl，再加入300μl液體NZY培養(yǎng)基，37℃溫育45-60min；(10)取50μl菌液涂于LB固體培養(yǎng)基(含氨芐50μg/ml)上，37℃培養(yǎng)過夜；(11)第二天挑取陽性克隆，用液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，用EcoRI酶切，電泳檢測插入片段長度。
(12)選取插入片段大于800bp的克隆進行測序，在ABI733測序儀(GenecoreBiological Company)上，采用雙脫氧核苷酸鏈終止法測定序列，將得到的全序列與EMBL Bank以及GENEBANK等核苷酸數(shù)據(jù)庫比較，用DNASIS軟件進行分析。發(fā)現(xiàn)23號克隆有一個保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域。且基因結(jié)構(gòu)完整。
(13)分析23號克隆的核苷酸序列及對應(yīng)的氨基酸序列，結(jié)果得到具有序列表中序列1所示的核苷酸序列的TaDREB5，其開放閱讀框架為自5′端第135位-1319位堿基，共編碼394個氨基酸(序列表中的序列2)，序列2中的自氨基端第75位-81位氨基酸殘基序列和第111位-115位氨基酸殘基序列為兩個可能的核定位信號區(qū)，自氨基端第138位-195位氨基酸殘基序列為保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域。同源序列比對結(jié)果如圖1所示，表明TaDREB5與已報道的小麥TaDREB(AAL01124)只有30.2％的同源性，說明TaDREB5是一個新發(fā)現(xiàn)的小麥基因。圖1中，黑框表示一致的氨基酸部分。
實施例2、Northern雜交分析TaDREB5的表達特性苗齡為10天的小麥幼苗，進行以下處理(1)干旱處理將水培的小麥幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的濾紙上，干旱培養(yǎng)2小時、5小時、10小時后取出材料，用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)鹽漬處理將小麥幼苗置于2％的由NaCl和Na2SO4組成的鈉鹽溶液中(NaCl與Na2SO4的質(zhì)量百分比為3∶2)中，光照培養(yǎng)2小時、5小時、10小時后分別取出材料，用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> (3)ABA處理將小麥幼苗置于200μM的ABA溶液中，光照培養(yǎng)2小時、5小時、10小時后分別取出并用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> (4)白粉病處理將小麥幼苗接種白粉病菌株，光照培養(yǎng)24及48小時后，取出并用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> (5)冷害處理將小麥幼苗置于4℃培養(yǎng)箱，光照培養(yǎng)6小時、10小時、24小時后取出并用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> (6)對照的處理直接取未經(jīng)任何處理的小麥幼苗-80℃凍存作為對照。
2、轉(zhuǎn)膜(1)電泳及轉(zhuǎn)膜用具的處理0.1N NaOH/1mM EDTA浸泡1h以上，用清水沖洗干凈備用；(2)準備甲醛變性凝膠在一個三角燒瓶中加入10ml 10×MOPs，73ml DEPC處理的水和1g瓊脂糖，加熱融化；當冷卻到55℃左右時加入17ml甲醛，混勻，倒入RNA專用的膠槽中；(3)在DEPC處理的0.5ml離心管中加入RNA+DEPC處理水 4μl(RNA約為30μg，利用Promega公司的RNAgents Total RNA Isolation System kit提取的上述幼苗的總RNA)甲酰胺 12.5μl甲醛 4.0μl10×MOPs 2.5μl溴酚蘭(10×) 2.5μl(4)樣品在65℃水浴處理5min，然后點樣，開始電泳，緩沖液為1×MOPs。當溴酚蘭到達凝膠1/3-1/2位置時，停止電泳；(5)用蒸餾水沖洗凝膠，用20×SSC轉(zhuǎn)膜。將凝膠翻轉(zhuǎn)后放在濾紙橋上，放上一張與凝膠大小相當?shù)哪猃埬?Hybond-N+，Amarsharm)，趕除氣泡，在膜上放3層濾紙，與尼龍膜大小相同，趕除氣泡，將凝膠周圍用膠片封好，放上大小相當?shù)奈?，壓上約500g的重物，轉(zhuǎn)膜16-24h，其間更換吸水紙。轉(zhuǎn)膜完成后，用2×SSC洗膜10min，用濾紙吸干，保鮮膜包好，紫外燈照射3min，4℃存放至雜交；3、探針的制備在TaDREB5基因的3’設(shè)計特異引物DREB5F和DREB5R(避開AP2/EREBP區(qū)域)，以克隆的TaDREB5基因為模板進行PCR擴增，程序及體系如下引物序列DREB5F5’-GAT GGA AGC CGA CCC AAT TG-3’DREB5R5’-CCA CCT TCC AAA GAT CGT GAT G-3’反應(yīng)體系(50μl)模板(60ng/ul) 0.5μl
dNTP(10mM) 1μl引物(25μM)1μl10×buffer 5μlddh2O 42.1μlTaq(5U/μl)0.4μl擴增條件(PTC-200) 取擴增產(chǎn)物2ul在1.2％瓊脂糖凝膠中電泳檢測，溴化乙啶染色，紫外凝膠成像儀掃描，觀察在480bp左右的位置處是否有一條亮帶。
4、探針的回收采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.DV807A)回收純化探針(同三、cDNA文庫的篩選的探針的回收)。
5、探針標記探針標記為隨機六聚體引物法，每1-2張膜加入步驟4的探針DNA，約50-100ng和，加水至14.5μl，100℃煮沸變性5min后立即置于冰浴中5min，瞬時離心，然后加入下列成分，終體積25μl，于37℃反應(yīng)5h-8h。
5×Oligo緩沖液 5μlKlenow片段(5U/μl) 0.7μl10×緩沖液 2.5ulBSA(10mg/ml) 1μlα-32P-dCTP(10mCi/ml) 1.5μl其中，1ml 5×Oligo緩沖液中含有160μlH2O250μl1M Tris-HCl25μl 1M MgCl25μl 1M巰基乙醇500μl2M HEPES20μl 100mM dATP20μl 100mM dGTP
20μl 100mM dTTP4、預(yù)雜交和雜交反應(yīng)根據(jù)要雜交的膜的數(shù)量配制預(yù)雜交液，每10ml預(yù)雜交液的成分組成如下。
ddH2O 6.5ml5×HSB 2mlDenHardt’sIII 1ml*ssDNA(鮭魚精DNA，Sigma)(10mg/ml) 0.5ml*ssDNA加入之前需變性煮沸10min后立即放冰上10min。
其中，5×HSB(pH6.8)分子量(MW) g/200mlNaCl(3M)58.44 35.064PIPES(0.1M) 302.4 6.048EDTA(20mM) 372.24 1.488Denhardt’sIIIg/100ml2％明膠 22％Ficoll-40022％PVP-360 210％SDS 105％Na4P2O·10H2O 5將預(yù)雜交液混勻，于65℃預(yù)熱至澄清后放入尼龍膜，65℃預(yù)雜交5-6h(新膜)；探針標記完后，加入等體積的0.4N NaOH溶液，混勻后于室溫靜置10min使探針變性，然后加入到預(yù)雜交液中，65℃雜交過夜；5、洗脫將雜交完的膜從雜交管中取出放入洗脫盒中，加入少量洗液I(2×SSC/0.1％SDS)漂洗除去過量雜交液，然后用洗液I于45℃洗兩次，每次20min；再用洗液II(0.2×SSC/0.2％SDS)于45℃洗兩次，每次15min。洗液I洗過后，檢測雜交信號與背景情況，再決定是否繼續(xù)洗脫。用濾紙吸干洗好的膜，保鮮膜包好(注意除去氣泡)；6、放射自顯影在X-射線攝影暗盒中，將雜交膜置于增感屏上，在暗室中將X-光片放在雜交膜上，再放上另一張增感屏，壓緊X-射線攝影暗盒，-70℃冰箱曝光7-15天。
Northern分析結(jié)果如圖1a-1c所示，表明在干旱脅迫2小時后，以及在高鹽(2％(NaCl+NaSO4)脅迫2小時后TaEREB1基因開始表達。同樣，在白粉病菌誘導(dǎo)的條件下，TaEREB1基因表達增強，說明TaEREB1基因分別受干旱、高鹽和病原菌誘導(dǎo)表達。但是，在冷脅迫和ABA處理的條件下，TaEREB1基因沒有表達。說明該基因不受冷脅迫和ABA誘導(dǎo)。圖1a-1c中，CK為對照。
實施例3、TaDREB5的激活特性一、將TaDREB5基因構(gòu)建到表達載體YEP-GAP上1、獲得TaDREB5基因編碼氨基酸部分的全序列根據(jù)已克隆的TaDREB5基因的序列設(shè)計引物，引物末端分別加EcoRI和XhoI酶切位點，PCR擴增獲得編碼氨基酸部分的全序列，程序及體系如下引物序列TaDREB5-EI5’-GGGGAATTCATGACGGTAGATCGGAAGGACGC-3’TaDREB5-XI5’-GGGCTCGAGATGGTTTGGCCGCCGGTAG-3’反應(yīng)體系(50μl)模板(60ng/ul) 0.5μldNTP(10mM)1μl引物(25μM) 1μl10×buffer5μlddh2O42.1μlTaq(5U/μl) 0.4μl擴增條件(PTC-200) 取擴增產(chǎn)物2ul在1.2％瓊脂糖凝膠中電泳檢測，溴化乙啶染色，紫外凝膠成像儀掃描，觀察在1.2Kb左右的位置處是否有一條亮帶。
采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.DV807A)回收純化PCR產(chǎn)物(同三、cDNA文庫的篩選的探針的回收)。
2、將TaDREB5基因構(gòu)建到表達載體YEP-GAP上將步驟1中純化的PCR產(chǎn)物和表達載體YEP-GAP(Liu Q，Kasuga M，Sakuma Y，AbeH，Miura S，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.，1998)，用EcoRI(Takara)和XhoI(Takara)分別酶切4-6hr，反應(yīng)體系如下10×緩沖液H 5μlEcoR I(12U/μl) 2μlXhoI(12U/μl) 2μl
PCR產(chǎn)物/YEP-GAP 20μlddH2O 21μl采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.DV807A)回收純化酶切產(chǎn)物(同三、cDNA文庫的篩選的探針的回收)。
將純化的酶切PCR產(chǎn)物和酶切載體YEP-GAP連接4-8hr，反應(yīng)體系如下10×Ligase buffer 1μl酶切PCR產(chǎn)物 4μl酶切載體YEP-GAP 4μlT4DNA Ligase1μl取0.5μl連接產(chǎn)物，電擊轉(zhuǎn)化JM109菌株，37℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆，測序分析序列是否正確，得到含有TaDREB5基因的重組表達載體YER-GAP-TaDREB5。
二、TaDREB5的體內(nèi)結(jié)合特異性和激活特性的驗證1、酵母報道子的構(gòu)建將含有4個DRE元件的片段5’-GAATTC-DRE-DRE-DRE-DRE-GTCGAC-3’(DRE的核心序列TACCGACAT)分別構(gòu)建到pHis-1載體(MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)的PminHIS3啟動子和pLacZi載體(MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)PCYCI啟動子上游，分別得到重組載體pHis-1-DRE和pLacZi-DRE，用Xho I和Nco I內(nèi)切酶分別將pHis-1-DRE和pLacZi-DRE載體切成線狀。先將線狀pHis-1-DRE載體轉(zhuǎn)化到酵母細胞(YM4271株系，MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)內(nèi)，獲得能在SD/His-培養(yǎng)基上正常生長的酵母轉(zhuǎn)化子(Yeast transformant)。接著以這種酵母轉(zhuǎn)化子為寄主細胞，繼續(xù)轉(zhuǎn)化含有4個重復(fù)DRE元件的pLacZi-DRE載體。這樣在同時缺乏組氨酸和尿嘧啶的SD/His-/Ura-培養(yǎng)基上，選擇獲得含有pHis-1-DRE和pLacZi-DRE的正常雙重酵母報道子；將4個DRE元件的核心序列CCGAC突變成TTTTT(MDRE)，即5’-GAATTC-MDRE-MDRE-MDRE-MDRE-GTCGAC-3’，按正常的雙重酵母報道子構(gòu)建方法，再構(gòu)建一個含4個MDRE盒的突變體雙重酵母報道子。
2、PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化酵母及結(jié)果分析(1)接種酵母菌株(YM4271株系，MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)到1ml YPD液體培養(yǎng)基中，劇烈震蕩2分鐘，分散團塊后將懸浮液轉(zhuǎn)至含有50ml YPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃/250rpm搖過夜，測OD600＝1.7-1.8(計數(shù)約4×107個/mL)；(2)取30ml步驟(1)過夜培養(yǎng)物接到300ml新鮮的YPD培養(yǎng)基中，30℃/250rpm培養(yǎng)，約3小時至OD600＝0.5±0.1，室溫1000g離心5min，收集菌體，棄上清，用1/2體積1×TE懸浮，1000g/5min離心；(3)吸棄上清，用1.5ml新鮮配制的1×TE/LiAc溶液懸浮，振蕩混勻備用；(4)取出0.1ml酵母感受態(tài)進行轉(zhuǎn)化，依次加下列溶液0.1μg表達載體YEP-GAP-TaDREB5、0.1mg ssDNA(鮭魚精DNA，Sigma)、0.6mlPEG/LiAc高速振蕩1分鐘，30℃/200rpm振蕩培養(yǎng)30分鐘；(5)加入70ul DMSO(sigma#D8779)，輕輕倒置混勻，42℃熱激30分鐘，其間輕輕振蕩，冰浴2分鐘，室溫1000g離心5min；(6)吸棄上清，加入0.5ml 1×TE buffer懸浮細胞；(7)用接種環(huán)蘸取懸浮液，分別在含有0，15mmol/L 3-AT的SD/His-/Ura-/Trp-選擇性培養(yǎng)基上畫線培養(yǎng)。
(8)平板的一半培養(yǎng)步驟1構(gòu)建的正常雙重酵母報道子，另一半培養(yǎng)步驟1構(gòu)建的突變體雙重酵母報道子，以便做對照分析。
(9)顛倒放置于培養(yǎng)箱中，30℃培養(yǎng)3-4天。
(10)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0mmol/L 3-AT的SD/His-/Ura-/Trp-的培養(yǎng)基平板上正常的酵母報道子和突變的酵母報道子都有生長，但突變的酵母報道子的直徑明顯??；而在15mmol/L 3-AT的SD/His-/Ura-/Trp-的培養(yǎng)基平板上正常的酵母報道子能正常生長，但突變的酵母報道子被抑止沒有生長。
3、半乳糖苷酶活性檢測(1)從0mmol/L 3-AT的SD/His-/Ura-/Trp-的培養(yǎng)基平板上分別挑取正常的酵母報道子和突變的酵母報道子菌落。轉(zhuǎn)至YPD液體培養(yǎng)基中，于30℃振蕩培養(yǎng)，待長至對數(shù)生長后期，取1.5ml菌液，3000rpm離心30s；(2)棄上清，控干管中液體，將離心管置于液氮中速凍10min，取出使其自然融解，加50ul Z/X-gal溶液，30℃溫育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常的酵母報道子在6-8h內(nèi)變藍，而突變的酵母報道子在12h內(nèi)沒有變化，仍為白色。說明轉(zhuǎn)錄因子TaDREB5能與DRE順式作用元件結(jié)合，且具有激活功能，激活了Pmin啟動子(包括PminHIS3啟動子和PCYCI啟動子)，促使報道基因表達。從而證明了TaDREB5的體內(nèi)結(jié)合特異性和激活功能。
三、藥劑配制(1)YPD液體培養(yǎng)基細菌培養(yǎng)用酵母抽提物(Bacto-Yeast Extract) 10g/L細菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨(Bacto-Peptone) 20g/L調(diào)節(jié)pH至5.8，121℃/15min滅菌，降至60℃以后加入40％的Glucose，使其終濃度為20g/L。
(2)SD/His-/Ura-/Trp-選擇性培養(yǎng)基不含氨基酸的酵母氮源(Yeast nitrogen base) 6.7g/L營養(yǎng)缺陷型混合物(drop-out media without His/Ura/Trp) 100ml瓊脂粉(Bacteriological agar) 20g/L調(diào)節(jié)pH至5.8，121℃/15min滅菌，降至60℃后加入40％Glucose，使其終濃度為20g/L。
(3)營養(yǎng)缺陷型混合物(Drop-out mix)(10X)L-Isoleucine(異亮氨酸)300mg/LL-Valine(纈氨酸) 1500mg/LL-Adenine(腺嘌呤) 200mg/LL-Arginine(精氨酸)200mg/LL-Histidine Hcl monohydrate(組氨酸) 200mg/LL-Leucine(亮氨酸) 1000mg/LL-Lysine Hcl(賴氨酸) 300mg/LL-Methionine(甲硫氨酸)200mg/LL-Phenylalanine(苯丙氨酸) 500mg/LL-Threonine(蘇氨酸) 2000mg/LL-Tyrosine(酪氨酸)300mg/L(4)1×PEG/LiAc50％(w/v)PEG3350 8ml10×TE buffer 1ml10×LiAc 1ml(5)10×TE Buffer100mM Tris-Hcl10mM EDTA，pH＝7.5121℃高壓滅菌，室溫保存。
(6)1×TE/LiAc10×TE buffer 1ml10×LiAc 1mlddH2O8ml(7)Z BufferNa2HPO4·7H2O 16.1g/L
NaH2PO4·H2O 5.5g/LKCl0.75g/LMgSO4·7H2O 0.246g/L調(diào)節(jié)pH至7.0，121℃/15min滅菌，4℃保存。
(8)X-gal儲存液(X-gal Stock Solution)用N，N-dimethyl-formamide(DMF)溶解X-gal，使其終濃度為20mg/ml，-20℃貯存。
(9)含有X-gal的Z buffer緩沖液100ml(Z buffer with X-gal)，注意現(xiàn)用現(xiàn)配Z buffer 98mlβ-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)0.27mlX-gal儲存液(X-gal stock solution) 1.67ml
序列表<160>2<210>1<211>2354<212>DNA<213>小麥屬小麥(Triticum aestivum L.)<400>1aggggtttcc gacttttctt tctctcctcc tccacgcctc tccccaactc tctatccaag 60tccacgcggc gaagaaacca ggcgacaaga ttgcgaacgc tagatatctg gacccgatcc120ggatcgggcc ggccatgacg gtagatcgga aggacgccga ggcggcggcg gcggcggcga180cgcccttcga gatcccggcg ctccagcctg gaggaacttg tggagcagag gaaagtaccc240ggagtcatgt tctcgtcaaa ccaatagcag gaagcagtaa tcttccctgt aatgaatatg300cattcttggc gcggcaaaac cccaagggag atgcgctgcc agtggcatct attctgcgga360aaaagcgacc tcggagatca cgtgatgggc ctaattcagt ctctgaaacg atcaggcgat420ggaaagaagt gaaccaacaa ctggagcatg atccacaggg tgcaaagagg gcgaggaagc480cacctgcaaa gggttcgaag aagggctgta tgctggggaa aggaggacct gagaatacac540aatgtggatt ccgtggtgta aggcaacgta cttgggggaa gtgggttgct gaaattcggg600agccaaatcg ggtgagcagg ctctggctgg gaacgttccc cactgctgag gatgctgccc660gtgcttatga cgaggcagcc agagcaatgt atggcgcact ggctcgtacc aacttccctg720tgcatcctgc acaagctcct gctgtggctg taccagcggc aatcgaaggt gttgtacgtg780gtgcttcagc atcatgcgag tctactacaa cgtccaccaa ccactcagat gttgcttctt840ccttgccgag acaagctcaa gctcctgaga tttactccca gccagatgcg cttgagtcca900cagaatcagt tgtgctggag tctgtcgagc attacagcca tcaagacact gttcctgacg960ctggctcaag catttcaagg agcacatccg aagaggatgt gttcgagcca ttggagccta 1020tttccagttt gccggatgga gaagcagacg gttttgatat agaagaatta ttgagattga 1080tggaagccga cccaattgaa gtcgagctgg tcactggggg ctcctggaat ggtggagcca 1140acactggcgt ggagatgggc cagcaggaac ctctctacct ggatggcttg gaccaaggca 1200tgctggaggg catgctgcag tctgattatc cttacccaat gtggatatca gaggatcggg 1260ccatgcacaa ctctgccttc catgatgctg agatgagcga gttcttcgaa gggttgtgat 1320cccctaccgg cggccaaacc atgtctatgg tgtttggtcg gcttgccctt cggtgtccgc 1380tgctgcgctc caatgaagat caaatggtcg accggattgg attcctctgc agaactaata 1440agctcctaag ctagtttttt gtgcttcgtt tgtagttctg ttaggcatgg gaactcttct 1500ctgtttcgat gtttcttgtg ataagaaacc ttgattgtgc atcacgatct ttggaaggtg 1560gaaaaagaaa atgtgaaaat gcatttccct gtcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620aaaaaaaatt tcaaacaaac ccaagtccag ctttgtttat actccaattt acacaagaag 1680ccatacgtgt tacagagtca agtcaacagg acaagccgcg ccttaattaa caacaaaaaa 1740
aaggtgtggc tggctggcat ctctgtccgt gatgccatca agattcgtcc gtcgccggtg 1800gcggtaggtg tggtggggcg gttggtcagc tggtcggttg ccccggccgg tcacggtcag 1860tgggcggcga tggcgctgca gcgccgctgg cagaagttgg ggacgcggtc catgcactgg 1920tacacggccg ggtgcacggc gagggcggac ctgacgcagt cccggcacgc cgggtggcac 1980ccgccgggcg ccgcgtccat gcaccggcac tgcggcgtgt ccgacttggt gcacccgccg 2040cagctgtcgc agcacggcca cgcgctcccc ctcgccttcg ccgccgccgc cgccgaggac 2100gattgctccc cctctcctcc gtgccctctg ctttggacac gggagtgatg gccatggccg 2160tggtggtggt ggtggctgct gctggattcg gcgacgggcg caagagccgc gagcacgacg 2220gcgaggacgc caaagatcag cagcagcgac gccaggcttc ttcttcttcc catctctgtg 2280tgtgtcactc actatatctc tccctcttcg atttctttcc tctctcgcag gaacttgcta 2340cggcttctct ggta 2354<210>2<211>394<212>PRT<213>小麥屬小麥(Triticum aestivum L.)<400>2Met Thr Val Asp Arg Lys Asp Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr1 5 10 15Pro Phe Glu Ile Pro Ala Leu Gln Pro Gly Gly Thr Cys Gly Ala Glu20 25 30Glu Ser Thr Arg Ser His Val Leu Val Lys Pro Ile Ala Gly Ser Ser35 40 45Asn Leu Pro Cys Asn Glu Tyr Ala Phe Leu Ala Arg Gln Asn Pro Lys50 55 60Gly Asp Ala Leu Pro Val Ala Ser Ile Leu Arg Lys Lys Arg Pro Arg65 70 75 80Arg Ser Arg Asp Gly Pro Asn Ser Val Ser Glu Thr Ile Arg Arg Trp85 90 95Lys Glu Val Asn Gln Gln Leu Glu His Asp Pro Gln Gly Ala Lys Arg100 105 110Ala Arg Lys Pro Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly Cys Met Leu Gly115 120 125Lys Gly Gly Pro Glu Asn Thr Gln Cys Gly Phe Arg Gly Val Arg Gln130 135 140Arg Thr Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro Asn Arg Val145 150 155 160Ser Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Glu Asp Ala Ala Arg
165 170 175Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Arg Ala Met Tyr Gly Ala Leu Ala Arg Thr180 185 190Asn Phe Pro Val His Pro Ala Gln Ala Pro Ala Val Ala Val Pro Ala195 200 205Ala Ile Glu Gly Val Val Arg Gly Ala Ser Ala Ser Cys Glu Ser Thr210 215 220Thr Thr Ser Thr Asn His Ser Asp Val Ala Ser Ser Leu Pro Arg Gln225 230 235 240Ala Gln Ala Pro Glu Ile Tyr Ser Gln Pro Asp Ala Leu Glu Ser Thr245 250 255Glu Ser Val Val Leu Glu Ser Val Glu His Tyr Ser His Gln Asp Thr260 265 270Val Pro Asp Ala Gly Ser Ser Ile Ser Arg Ser Thr Ser Glu Glu Asp275 280 285Val Phe Glu Pro Leu Glu Pro Ile Ser Ser Leu Pro Asp Gly Glu Ala290 295 300Asp Gly Phe Asp Ile Glu Glu Leu Leu Arg Leu Met Glu Ala Asp Pro305 310 315 320Ile Glu Val Glu Leu Val Thr Gly Gly Ser Trp Asn Gly Gly Ala Asn325 330 335Thr Gly Val Glu Met Gly Gln Gln Glu Pro Leu Tyr Leu Asp Gly Leu340 345 350Asp Gln Gly Met Leu Glu Gly Met Leu Gln Ser Asp Tyr Pro Tyr Pro355 360 365Met Trp Ile Ser Glu Asp Arg Ala Met His Asn Ser Ala Phe His Asp370 375 380Ala Glu Met Ser Glu Phe Phe Glu Gly Leu385 390
權(quán)利要求
1.一種脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)具有序列表中SEQ ID№2的氨基酸殘基序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述SEQ ID №2的自氨基端第75位-81位氨基酸殘基序列和第111位-115位氨基酸殘基序列為兩個核定位信號區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述SEQ ID №2的自氨基端第138位-195位氨基酸殘基序列為保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域。
5.一種脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于所述基因具有序列表中序列1的DNA序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因，其特征在于所述基因的開放閱讀框架為自5′端第135位-1319位堿基。
8.含有權(quán)利要求5、6或7所述基因的表達載體。
9.含有權(quán)利要求5、6或7所述基因的細胞系。
10.擴增權(quán)利要求5、6或7所述基因的中任一片段的引物對。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白及其編碼基因。本發(fā)明的脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID№2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。實驗證明本發(fā)明的TaDREB5在干旱和高鹽的誘導(dǎo)下表達，并且可以特異的調(diào)控含有DRE/CRT順式元件(核心序列CCGAC)的基因的轉(zhuǎn)錄表達，本發(fā)明的TaDREB5為人為控制抗逆和耐逆相關(guān)基因的表達提供了基礎(chǔ)，將在培育抗逆性和耐逆性增強的植物育種中發(fā)揮重要的作用。
文檔編號C12N15/29GK1706948SQ20041004656
公開日2005年12月14日 申請日期2004年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月11日
發(fā)明者馬有志, 徐兆師, 程憲國, 張瑞越, 李連城, 陳明, 邱志剛 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所