專利名稱：一種植物乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物中一種與脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因，特別涉及一種植物乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白及其編碼基因。
背景技術(shù)：
干旱、高鹽及低溫等逆境脅迫是影響小麥生長、發(fā)育的障礙因子。因此，了解小麥對逆境條件的應(yīng)答與信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，提高小麥品種的抗逆性，成為小麥遺傳研究及小麥品種改良的重要任務(wù)之一。
在逆境脅迫下植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一系列應(yīng)答反應(yīng)，伴隨著許多生理生化及發(fā)育上的變化。明確植物對逆境的反應(yīng)機(jī)制，將為抗逆基因工程研究和應(yīng)用提供科學(xué)論據(jù)。目前，植物抗逆性研究已逐漸深入到細(xì)胞、分子水平，并與遺傳學(xué)和遺傳工程研究相結(jié)合，探索用生物技術(shù)來改進(jìn)植物生長特性，其目的是提高植物對逆境的適應(yīng)能力。
在干旱、高鹽和低溫等環(huán)境脅迫的逆境條件下，植物能夠在分子、細(xì)胞和整體水平上做出相應(yīng)的調(diào)整，以最大程度上減少環(huán)境所造成的傷害并得以生存。許多基因受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，這些基因的產(chǎn)物不僅能夠直接參與植物的脅迫應(yīng)答，而且能夠調(diào)節(jié)其它相關(guān)基因的表達(dá)或參與信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而使植物避免或減少傷害，增強(qiáng)對脅迫環(huán)境的抗性。與脅迫相關(guān)的基因產(chǎn)物可以分為兩大類第一類基因編碼的產(chǎn)物包括離子通道蛋白、水通道蛋白、滲透調(diào)節(jié)因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜堿等)合成酶等直接參與植物脅迫應(yīng)答的基因產(chǎn)物；第二類基因編碼的產(chǎn)物包括參與脅迫相關(guān)的信號(hào)傳遞和基因表達(dá)調(diào)節(jié)的蛋白因子，如蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等。其中，轉(zhuǎn)錄因子在植物脅迫應(yīng)答的基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用。
轉(zhuǎn)錄因子也稱為反式作用因子，是能夠與真核基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性作用的DNA結(jié)合蛋白，通過它們之間以及與其它相關(guān)蛋白之間的相互作用，激活或抑制轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)決定了它與順式作用元件結(jié)合的特異性，而轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)決定了它對基因表達(dá)起激活或是抑制作用。此外，其自身活性還受到核定位及寡聚化等作用的影響。
目前已知在植物中與脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子主要有具有AP2結(jié)構(gòu)域的AP2(APETALA2)/EREBP(乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，ethylene responsive element bindingprotein)轉(zhuǎn)錄因子家族、含有堿性區(qū)域和亮氨酸拉鏈的bZIP(basic region/leucine zipper motif transcription factors)類轉(zhuǎn)錄因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族、含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉鏈的MYC家族和具有色氨酸簇(Trp cluster)的MYB家族。這五個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，除WRKY家族不參與植物的水脅迫反應(yīng)外，其它四個(gè)家族均參與調(diào)節(jié)植物對干旱、高鹽和低溫等的逆境脅迫反應(yīng)。其中，AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子在高等植物中廣泛存在，它是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，近年來，在擬南芥、煙草、玉米、水稻、大豆和油菜中均有報(bào)道，這表明AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子在高等植物中普遍存在并具有重要作用。
DREB(DRE-binding protein)類轉(zhuǎn)錄因子是AP2家族中EREBP-like亞家族中的一個(gè)成員。DREB和EREBP類轉(zhuǎn)錄因子它們在氨基酸序列上沒有顯著的相同性，但都含有一段非常保守的由58個(gè)左右氨基酸組成的DNA結(jié)合區(qū)域(EREBP/AP2結(jié)構(gòu)域)。蛋白質(zhì)三維分析表明，該區(qū)域含有3個(gè)β-折疊，對識(shí)別各類順式作用元件起關(guān)鍵作用。其中位于第二個(gè)β-折疊中的第14、19位的兩個(gè)氨基酸殘基的差異，決定這類轉(zhuǎn)錄因子與不同順式作用元件的特異結(jié)合。DREB類轉(zhuǎn)錄因子第14位氨基酸是纈氨酸(V14)，第19位氨基酸是谷氨酸(E19)，其中第19位的氨基酸并不保守，例如水稻的OsDREB1轉(zhuǎn)錄因子的第19位氨基酸就是纈氨酸(Dubouzet J.G.，Sakuma Y.，Ito Y.，Kasuga M.，Dubouzet E.G.，Miura S.，Seki M.，Shinozaki K.，Yamaguchi-Shinozaki K.，OsDREB genes in RICE，Oryza sativa L.，encodetranscription activators that function in drought-，high-salt-andcold-responsive gene expression.The Plant Journal，2003，33751-763)。在DREB相關(guān)蛋白中決定DNA結(jié)合的特異性方面，V14的作用明顯要比E19重要(Sakuma Y.，Liu Q.，Dubouzet J.G.，Abe H.，Shinozaki K.andYamaguchi-Shinozaki K.，DNA-Binding specificity of the ERF/AP2 domain ofArabidopsis DREBs，transcription factors involved in dehydration-andcold-Inducible gene expression.Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，2002，290998-1009)；而ERF類轉(zhuǎn)錄因子第14位氨基酸是甘氨酸，第19位是天冬氨酸，因而DREB特異結(jié)合DRE/CRT順式元件，ERF特異結(jié)合GCC-盒。AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域的C-端區(qū)還包含1個(gè)由18個(gè)氨基酸殘基組成的核心序列，該序列形成雙親性的α-螺旋，該α-螺旋可能參與同其它轉(zhuǎn)錄因子及DNA間的相互作用。
目前，在許多植物中都發(fā)現(xiàn)這種含有EREBP/AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，并分別與抗病、抗逆等信號(hào)傳遞有關(guān)(劉強(qiáng)，趙南明，Yamaguchi-Shinozaki K.，ShinozakiK.，DREB轉(zhuǎn)錄因子在提高植物抗逆性中的作用.科學(xué)通報(bào)，2000，第45卷111-16)。劉強(qiáng)等認(rèn)為，一個(gè)DREB基因可以調(diào)控多個(gè)與植物干旱、高鹽及低溫耐性有關(guān)的功能基因的表達(dá)(劉強(qiáng)，趙南明，Yamaguchi-Shinozaki K.，Shinozaki K.，DREB轉(zhuǎn)錄因子在提高植物抗逆性中的作用.科學(xué)通報(bào)，2000，第45卷111-16)。Kasuga等的研究證實(shí)，導(dǎo)入到擬南芥的DREB1A基因可以同時(shí)促進(jìn)與逆境脅迫耐性有關(guān)的基因rd29、rd17、kin1、cor6.6、cor15a以及erd10的表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性大大增強(qiáng)(Kasuga M.，Liu Q.，Miura S.，Yamaguchi-Shinozaki K.，Shinozaki K.，Improving plant drought，salt，and freezing tolerance by gene transfer of asingle stress-inducible transcription factor.Nature Biotechnology，1999，17287-292)。同樣，低溫耐性轉(zhuǎn)錄因子CBF1的轉(zhuǎn)基因植株的耐低溫能力有顯著提高(Jaglo-Ottosen K.R.，Gilmour S.J.，Zarka D.G.，Schabenberger O.，Thomashow M.F.，Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes andenhances freezing tolerance.Science，1998 280(5360)104-106)。由于植物的逆境耐性是由多基因調(diào)控的復(fù)雜性狀，依靠導(dǎo)入單個(gè)功能性蛋白基因很難實(shí)現(xiàn)植物抗逆性的綜合提高。因此，利用一個(gè)關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)多個(gè)功能基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物的抗逆性，已經(jīng)成為植物抗逆基因工程的研究熱點(diǎn)。
根據(jù)含DNA結(jié)合區(qū)的數(shù)目，AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子分為AP2(APETALA2)和乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白EREBP(ethylene-responsive element binding protein)以及RAV三個(gè)大類型。AP2型轉(zhuǎn)錄因子包括擬南芥的AP2、ANT，玉米的Glossy、idsl等。這種類型的轉(zhuǎn)錄因子含有兩個(gè)AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長發(fā)育，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)14個(gè)AP2型轉(zhuǎn)錄因子基因；EREBP型轉(zhuǎn)錄因子僅含1個(gè)AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，調(diào)節(jié)植物對激素(乙烯)、病原、低溫、干旱及高鹽等地分子應(yīng)答反應(yīng)。EREBP型轉(zhuǎn)錄因子中，已發(fā)現(xiàn)有煙草EREBP1-4、番茄Pti4-6、擬南芥RAV1-2、AtEBP、AtERF1-5、DREB1A-C(CBF1-3)和DREB2A-B等許多成員，分別與細(xì)胞發(fā)育、激素、抗病、低溫及干旱、高鹽等信號(hào)傳遞有關(guān)。這些EREBP型轉(zhuǎn)錄因子又可以再分為EREBP(ethylene-responsive element binding protein，即ERF)亞組，包括煙草EREBP1-4、番茄Pti4-6、擬南芥AtEBP、AtERF1-5、這類轉(zhuǎn)錄因子與含核心序列AGCCGCC的GCC-盒特異結(jié)合，因此，它的DNA結(jié)合區(qū)又稱為GCC-盒結(jié)合域(GCC-boxbinding domain，GBD)，其中第2個(gè)G、第5個(gè)G、第7個(gè)C對ERF蛋白的識(shí)別有重要作用(Hao D.，Ohme-Takagi M.，Sarai A.，Unique mode of GCC box recognitionby the DNA-binding domain of ethylene responsive element-binding factor(ERFdomain)in plant.The Journal of Biological Chemistry，1998，27326857-26861)。用核磁共振對其三維空間結(jié)構(gòu)的研究表明，AtERF1的GBD通過形成3個(gè)反向的β-片層與其靶序列GCC-盒的大溝相結(jié)合；DREBP亞組，包括擬南芥DREB1A-C(CBF1-3)和DREB2A-B，這類轉(zhuǎn)錄因子在干旱、高鹽、低溫下特異結(jié)合干旱應(yīng)答元件DRE/CRT，在擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn)124個(gè)DREBP型轉(zhuǎn)錄因子基因；RAV型轉(zhuǎn)錄因子包括擬南芥RAV1、RAV2、含有兩個(gè)不同的DNA結(jié)合區(qū)-ERF/AP2和B3，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)6個(gè)RAV型轉(zhuǎn)錄因子基因。還有一類特殊的轉(zhuǎn)錄因子AL079349，它與以上的轉(zhuǎn)錄因子都不同，自成一類。
最近發(fā)現(xiàn)EREBPs蛋白參與了干旱、高鹽和低溫脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控。Mine等人從低溫儲(chǔ)藏的土豆塊莖中分離到了EREBP轉(zhuǎn)錄因子CIP353，受低溫脅迫誘導(dǎo)強(qiáng)烈表達(dá)(Mine T.，Hiyoshi T.，Kasaoka K.，Ohyama A.，2003.CIP353 Encodesan AP2/ERF-Domain Protein in Potato(Solanum tuberosum L.)and RespondsSlowly to Cold Stress.Plant Cell Physiol.，4410-15)，說明可能有EREBP蛋白參與了受低溫脅迫的基因表達(dá)調(diào)控。Park等利用西紅柿為材料，得到了受高鹽、乙烯或茉莉酸誘導(dǎo)表達(dá)的EREBP轉(zhuǎn)錄因子Tsi基因，EMSA(Electrophoretic mobilityshift assays)試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，Tsi蛋白與GCC-box和DRE/CRT順式元件都能結(jié)合(Park J.M.，Park C.J.，Lee S.B.，Ham B.K.，Shin R.，and Paek K.H.，Overexpression of the Tobacco Tsi1 gene encoding an EREBP/AP2-Type transcriptionfactor enhances resistance against pathogen attack and osmotic stress inTobacco.The Plant Cell，2001，131035-1046)，盡管前者結(jié)合能力大于后者，但說明，某些EREBP蛋白能激活受滲透脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因。在正常生長條件下，Tsi基因的超量表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因植株(35S::Tsi1)的耐鹽性、增強(qiáng)了抗病性(ParkJ.M.，Park C.J.，Lee S.B.，Ham B.K.，Shin R.，and Paek K.H.，Over expressionof the Tobacco Tsi1 gene encoding an EREBP/AP2-Type transcription factorenhances resistance against pathogen attack and osmotic stress in Tobacco.The Plant Cell，2001，131035-1046)，以上說明了Tsi基因可能參與了生物脅迫和非生物脅迫兩條信號(hào)傳導(dǎo)途徑。由高鹽脅迫激活的一條類MAPK信號(hào)傳遞模式(包括SIMKK和SIMK)，將脅迫信號(hào)傳遞給EIN2(在乙烯信號(hào)傳遞途徑的CTR1下游)(Guo H.W.and Ecker J.，The ethylene signaling pathwaynew insights.CurrentOpinion in Plant Biology，2004，740-49)，最后激活某些EREBPs轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控滲透脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，提高植物的耐鹽性。對于是否存在含GCC-box元件，且表達(dá)產(chǎn)物直接參與非生物脅迫響應(yīng)的基因，還有待作進(jìn)一步的證實(shí)。
綜合目前的研究結(jié)果，植物在逆境脅迫條件下的信號(hào)傳遞途徑至少有以下六條途徑(1)依賴于ABA的信號(hào)傳遞途徑有三條受干旱、高鹽誘導(dǎo)，激活MYB、MYC類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有MYBR或MYCR順式作用元件的靶基因；受干旱、高鹽誘導(dǎo)，激活A(yù)BF/AREB類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有ABRE順式作用元件的靶基因；受干旱、高鹽誘導(dǎo)，激活CBF4，DREB1類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有DRE/CRT順式作用元件的靶基因。(2)不依賴于ABA的信號(hào)傳遞途徑有三條受干旱、高鹽誘導(dǎo)，激活DREB2類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有DRE/CRT順式作用元件的靶基因；受低溫誘導(dǎo)，激活CBF1-3/DREB1A-C類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有DRE/CRT順式作用元件的靶基因；受干旱、高鹽或乙烯誘導(dǎo)，激活ERF類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有DRE/CRT或GCC順式作用元件的靶基因。
用酵母單雜交系統(tǒng)證明轉(zhuǎn)錄因子的激活特性的主要原理如圖2所示，將GCC-盒順式作用元件和突變體GCC-盒順式作用元件分別構(gòu)建到pHISi-1載體和pLacZi載體的基本啟動(dòng)子Pmin(minimal promoter)上游，Pmin啟動(dòng)子下游連接報(bào)道基因(His3、LacZ和URA3)。當(dāng)連接有編碼轉(zhuǎn)錄因子的目的基因的表達(dá)載體YEP-GAP(不含激活功能)分別轉(zhuǎn)化到連有GCC-盒順式作用元件和突變體GCC-盒順式作用元件的酵母細(xì)胞后，如果連有突變體GCC-盒順式作用元件的酵母細(xì)胞中的報(bào)道基因不能表達(dá)，而連有特定的GCC-盒順式作用元件的酵母細(xì)胞中的報(bào)道基因能夠表達(dá)，說明該轉(zhuǎn)錄因子能與GCC-盒順式作用元件結(jié)合，且具有激活功能，激活了Pmin啟動(dòng)子，促使報(bào)道基因表達(dá)。從而證明了目的轉(zhuǎn)錄因子的體內(nèi)結(jié)合特異性和激活功能。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種植物乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的植物乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，名稱為TaEREB2，來源于小麥屬小麥(Triticum aestivum L.)，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列2的氨基酸殘基序列是由296個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，自氨基端第39位-40位氨基酸殘基序列和第216位-218位氨基酸殘基序列為兩個(gè)可能的核定位信號(hào)區(qū)，自氨基端第76位-133位氨基酸殘基序列為保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域。
植物乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白編碼基因，名稱為TaEREB2，來源于小麥屬小麥(Triticum aestivum L.)，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列1中的cDNA序列由1794個(gè)堿基組成，該基因的開放閱讀框架為自5′端第415位-1305位堿基，共編碼296個(gè)氨基酸(序列表中的序列2)。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體及細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增TaEREB2中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的TaEREB2在干旱、高鹽和病原菌的誘導(dǎo)下表達(dá)，并且可以特異的調(diào)控含有GCC-盒順式元件(核心序列GCCGCC)的基因的表達(dá)，本發(fā)明的TaEREB2為人為控制抗逆和耐逆相關(guān)基因的表達(dá)提供了基礎(chǔ)，將在培育抗逆性和耐逆性增強(qiáng)的植物育種中發(fā)揮重要的作用。


圖1a-1c為TaEREB2受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的Nothern雜交圖譜圖2為用酵母單雜交系統(tǒng)證明轉(zhuǎn)錄因子的體內(nèi)結(jié)合特異性和激活特性的原理示意圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、TaEREB2的克隆一、mRNA的分離將水培生長10天左右的小麥三葉期幼苗按如下方法進(jìn)行干旱處理2小時(shí)將幼苗小心取出，注意不要傷根，用干凈的吸水紙將葉片及根部的水分吸干，再將幼苗放在干凈的吸水紙上，置于陰涼處2小時(shí)。然后用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩２捎肣uikprep Micro mRNA Purification Kit(Pharmacia)進(jìn)行mRNA的分離。
二、cDNA文庫的構(gòu)建及滴度測定1、cDNA文庫的構(gòu)建采用TimesaverTMcDNA Synthesis Kit(Pharmacia)將步驟一中分離得到的mRNA合成cDNA雙鏈，并加EcoRI/NotI adaptor；采用ZAP ExpressPredigestedGigapackIII Gold Cloning Kit(Stratagene)進(jìn)行cDNA文庫的構(gòu)建，共得到500ul庫液。
2、滴度的測定(1)取1ul庫液用SM Buffer稀釋1000倍；(2)分別取1ul，10ul，100ul稀釋液入三個(gè)10ml離心管中，分別加100ul感受態(tài)宿主菌XL1-Blue MRF’(OD600為1.0)，于37℃溫浴20min；(3)分別加入3ml頂膠(50℃)混勻，立即鋪于固體NZY平板上，凝固后倒置，37℃培養(yǎng)過夜；(4)根據(jù)平板噬菌斑數(shù)，求平均值，即為庫容量。
計(jì)算公式 經(jīng)計(jì)算，該cDNA文庫的滴度為3.0×106個(gè)噬菌斑。
三、cDNA文庫的篩選1、探針的準(zhǔn)備根據(jù)已克隆的DREB基因的AP2保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物WAPF和WAPR，以普通小麥的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序及體系如下引物序列WAPF5’ACC GCG GTG TGA GGC AGA GGA 3’WAPR5’TGA GAA GTT GAC ACG TGC TTT GGC 3’反應(yīng)體系(50μl)模板(60ng/ul) 0.5μldNTP(10mM)1μl引物(25μM) 1μl10×buffer5μlddh2O42.1μlTaq(5U/μl) 0.4μl擴(kuò)增條件(PTC-200) 取擴(kuò)增產(chǎn)物2ul在1.2％瓊脂糖凝膠中電泳檢測，溴化乙啶染色，紫外凝膠成像儀掃描觀察，在180bp的位置處是否有一條亮帶。
2、探針的回收采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.DV805A)回收純化探針。
(1)在紫外燈下迅速切下含有目的DNA片段的帶，大概在180bp的位置處，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎。計(jì)算凝膠重量(提前記錄1.5ml離心管重量)，該重量作為一個(gè)凝膠體積(如100mg＝100ul)；加入3個(gè)凝膠體積的DR-I溶液，混合均勻后于75℃加熱，間斷混合，直至凝膠塊完全熔化(約6-8min)；(2)加0.5個(gè)DR-I體積的DR-II溶液，再加入異丙醇至終濃度為20％，混合均勻；
(3)吸取步驟(2)中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管(置于2ml離心管中)，3600rpm離心1min，棄濾液；(4)將制備管置回離心管，加0.5ml RinseA溶液，3600rpm離心30s，棄濾液；(5)將制備管置回離心管，加0.7ml RinseB溶液，3600rpm離心30s，棄濾液。以同樣的方法再用0.7ml RinseB溶液洗滌一次；(6)將制備管置于離心管中，最高速度離心1min；(7)將制備管置于潔凈的1.5ml離心管中，在DNA制備膜正中央加25ul水，室溫靜置1min，最高速度離心1min洗脫DNA。
(8)洗脫出的即為目的DNA，保存?zhèn)溆谩?br> 其中，DR-I溶液凝膠熔化劑(含DNA保護(hù)劑，防止DNA在高溫下降解)。室溫密閉貯存(TaKaRa公司，Code No.DV805A)。
DR-II溶液高離液序列溶液(促使大于100bp的DNA片段選擇性結(jié)合到DNA制備膜上)。室溫密閉貯存。若出現(xiàn)沉淀，應(yīng)于70℃溫育溶解并冷卻至室溫后再使用(TaKaRa公司，Code No.DV805A)。
RinseA溶液洗滌液。室溫密閉貯存(TaKaRa公司，Code No.DV805A)。
RinseB溶液洗滌液。室溫密閉貯存(TaKaRa公司，Code No.DV805A)。
3、轉(zhuǎn)膜(1)取1ul庫液(見cDNA文庫的構(gòu)建部分)，在直徑150mm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)噬菌體，大概6.0×103pfu；(2)噬菌斑培養(yǎng)好后需要放在4℃冷卻，臨用時(shí)取出置于超凈臺(tái)吹干，防止轉(zhuǎn)膜時(shí)頂膠被膜粘起；(3)將Hybrond-N+膜剪成圓形，比直徑為150mm的培養(yǎng)皿稍小，用鉛筆在膜上表明編號(hào)及日期(與培養(yǎng)皿對應(yīng))；(4)用鑷子夾住膜兩邊，有字面朝上，中間先接觸平板，慢慢松開，不要移動(dòng)，不要有氣泡，使膜自然攤平，完全攤平后，計(jì)時(shí)；(5)用注射器針頭在膜上扎三個(gè)不對稱的孔，在培養(yǎng)皿背面對應(yīng)的位置用記號(hào)筆做好標(biāo)記；(6)3min后，用鑷子從一邊開始輕輕揭起膜，不要帶起頂膠；(7)將膜迅速放入盛有變性液的培養(yǎng)皿中(放一層濾紙及15ml變性液)變性7min，有字面朝下，注意避免溶液到達(dá)膜的上表面；(8)將膜轉(zhuǎn)移至盛有中和液的培養(yǎng)皿中(放一層濾紙及15ml中和液)中和兩次，每次3min；
(9)然后將膜轉(zhuǎn)入漂洗液中洗30min，可輕輕搖動(dòng)；(10)取出膜，在干凈的濾紙上吸干，有字面朝下；(11)用保鮮膜將膜包好，在紫外交聯(lián)儀上交聯(lián)1min，4℃存放備用；其中，變性液 NaCl1.5M (87.75g/1000ml)NaOH0.5M (20g/1000ml)中和液 NaCl1.5M (87.75g/1000ml)Tris0.5M (60.57g/1000ml)EDTA0.001M (2ml 0.5M貯存液/1000ml)加入700-800ml水溶解，用HCl調(diào)pH值至8.0，最后定容至1000ml。
漂洗液Tris-HCl(pH7.5) 0.2M(200ml 1.0M貯存液/1000ml)2×SSC(100ml 20×SSC/1000ml)4、預(yù)雜交和雜交反應(yīng)根據(jù)要雜交的膜的數(shù)量配制預(yù)雜交液，每10ml預(yù)雜交液的成分組成如下。
ddH2O 6.5ml5×HSB 2mlDenHardt’sIII 1ml*ssDNA(鮭魚精DNA，Sigma)(10mg/ml)0.5ml*ssDNA加入之前需變性煮沸10min后立即放冰上10min。
其中，5×HSB(pH6.8)分子量(MW) g/200mlNaCl(3M) 58.44 35.064PIPES(0.1M) 302.4 6.048EDTA(20mM) 372.24 1.488Denhardt’sIIIg/100ml2％Gelatin22％Ficoll-400 22％PVP-360210％SDS 105％Na4P2O·10H2O 5將預(yù)雜交液混勻，于65℃預(yù)熱至澄清后放入尼龍膜，65℃預(yù)雜交5-6h(新膜)；探針標(biāo)記完后，加入等體積的0.4N NaOH溶液，混勻后于室溫靜置10min使探針變性，然后加入到預(yù)雜交液中，65℃雜交過夜；
5、洗脫在55℃-65℃條件下洗膜。
I洗2×SSC/0.5％SDS，洗兩次，每次15min；II洗0.1×SSC/0.1％SDS，洗膜過程中檢測信號(hào)強(qiáng)度，確定洗脫時(shí)間。
用濾紙吸干洗好的膜，保鮮膜包好，壓X-光片。
6、陽性克隆的二輪篩選(1)將X光片與膜對齊，確定位置，描下膜上的三個(gè)不對稱點(diǎn)的位置；(2)在讀片機(jī)上放上X光片及相應(yīng)的培養(yǎng)皿，根據(jù)不對稱點(diǎn)使培養(yǎng)皿定位；(3)用去頭的1ml槍頭取出確定的陽性雜交斑，放在1ml SM緩沖溶液中，加入50ul氯仿；(4)振蕩30秒，室溫放置1小時(shí)，離心，取上清；(5)取10-50ul上清再次鋪板，培養(yǎng)噬菌體進(jìn)行二次篩選；(6)二次篩選的步驟同上轉(zhuǎn)膜、預(yù)雜交和雜交反應(yīng)、洗脫、壓X-光片，得到單個(gè)陽性噬菌斑。
四、得到TaEREB21、集群內(nèi)刪除(Mass excision)(1)制備XL1-Blue MRF’和XLOLR菌。用液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)XL1-Blue MRF’和XLOLR菌，30℃過夜，培養(yǎng)基中添加0.2％(w/v)麥芽糖、10mM MgSO4和抗生素，分別為12.5μg/ml四環(huán)素和50μg/ml卡那霉素；(2)第二天，1000×g離心10min收集菌體，用10mM MgSO4重懸，使OD600達(dá)到1.0；(2)在一個(gè)10ml的無菌離心管中加入1μl庫液(見cDNA文庫的構(gòu)建部分)(約含6.0×103噬菌體顆粒)XL1-Blue MRF’ 200μl(OD600為1.0)ExAssist助手噬菌體 2μl(＞1×1010pfu/ml)(3)37℃溫育15min；(4)加入20ml液體NZY培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)2.5-3h；(5)65-70℃加熱20min；(6)1000×g離心10min，上清移至一個(gè)新管中；(7)在一個(gè)1.5ml的離心管中混合200μl XLOLR菌和1μl上清；(8)37℃溫育15min；(9)取10μl、100μl菌液分別涂于LB固體培養(yǎng)基(含氨芐50μg/ml)上，37℃培養(yǎng)過夜。
2、cDNA文庫插入片段的檢查(1)隨機(jī)挑取步驟1中集群內(nèi)刪除的單菌落，提取它們的質(zhì)粒DNA；(2)用限制內(nèi)切酶EcoR I(Takara)消化，反應(yīng)體系10μl10×緩沖液H1μlEcoR I(12U/μl)0.5μl質(zhì)粒DNA2μlddH2O 6.5μl(3)37℃消化2h，0.8％瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)95％以上的載體有插入片段，說明95％以上的噬菌體含有重組子，因此文庫實(shí)際含有的重組子為2.85×106(cDNA文庫的滴度為3.0×106)。50％以上的重組子的插入片段在800bp-4Kb之間，說明構(gòu)建的文庫較完整。
3、單克隆內(nèi)刪除(Single-clone excision)(1)將得到單個(gè)陽性噬菌斑(見三、cDNA文庫的篩選部分的步驟6二次篩選cDNA文庫)從平板上摳下，放入到一個(gè)無菌的、已加有500μl SM緩沖液和20μl氯仿的離心管中，漩渦振蕩10sec，4℃儲(chǔ)存；(2)用液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)XL1-Blue MRF’和XLOLR菌，30℃過夜，培養(yǎng)基中添加0.2％(w/v)麥芽糖、10mM MgSO4和抗生素，分別為12.5μg/ml四環(huán)素和50μg/ml卡那霉素；(3)第二天，1000×g離心10min收集菌體，用10mM MgSO4重懸，使OD600達(dá)到1.0；(4)在一個(gè)10ml的無菌離心管中加入XL1-Blue MRF’ 200μl(OD600為1.0)噬菌體貯存液 250μl(至少含1×105噬菌體顆粒)ExAssist助手噬菌體 1μl(＞1×1010pfu/ml)(5)37℃溫育15min；(6)加入3ml液體NZY培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)2.5-3h；(7)于65-70℃水浴離心管20min，然后1000×g離心15min；(8)將上清移至一個(gè)新的離心管中，即為噬菌粒懸浮液；(9)在一個(gè)1.5ml的離心管中加入200μl步驟(3)制備好的XLOLR菌和步驟(8)制備好的噬菌粒懸浮液100μl，再加入300μl液體NZY培養(yǎng)基，37℃溫育45-60min；
(10)取50μl菌液涂于LB固體培養(yǎng)基(含氨芐50μg/ml)上，37℃培養(yǎng)過夜；(11)第二天挑取陽性克隆，用液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，用EcoRI酶切，電泳檢測插入片段長度。
(12)選取插入片段大于800bp的克隆進(jìn)行測序，在ABI733測序儀(GenecoreBiological Company)上，采用雙脫氧核苷酸鏈終止法測定序列，將得到的全序列與EMBL Bank以及GENEBANK等核苷酸數(shù)據(jù)庫比較，用DNASIS軟件進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)17號(hào)克隆有一個(gè)保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域。且基因結(jié)構(gòu)完整。
(13)分析17號(hào)克隆的核苷酸序列及對應(yīng)的氨基酸序列，結(jié)果得到具有序列表中序列1所示的核苷酸序列的TaEREB2，其開放閱讀框架為自5′端第415位-1305位堿基，共編碼296個(gè)氨基酸(序列表中的序列2)，序列2中的自氨基端第39位-40位氨基酸殘基序列和第216位-218位氨基酸殘基序列為兩個(gè)可能的核定位信號(hào)區(qū)，自氨基端第76位-133位氨基酸殘基序列為保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域。
實(shí)施例2、Northern雜交分析TaEREB2的表達(dá)特性1、植物材料的準(zhǔn)備苗齡為10天的小麥幼苗，進(jìn)行以下處理(1)干旱處理將水培的小麥幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的濾紙上，干旱培養(yǎng)2小時(shí)、5小時(shí)、10小時(shí)后取出材料，用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)鹽漬處理將小麥幼苗置于2％的由NaCl和Na2SO4組成的鈉鹽溶液中(NaCl與Na2SO4的質(zhì)量百分比為3∶2)中，光照培養(yǎng)2小時(shí)、5小時(shí)、10小時(shí)后分別取出材料，用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> (3)ABA處理將小麥幼苗置于200μM的ABA溶液中，光照培養(yǎng)2小時(shí)、5小時(shí)、10小時(shí)后分別取出并用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> (4)白粉病處理將小麥幼苗接種白粉病菌株，光照培養(yǎng)24及48小時(shí)后，取出并用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> (5)冷害處理將小麥幼苗置于4℃培養(yǎng)箱，光照培養(yǎng)6小時(shí)、10小時(shí)、24小時(shí)后取出并用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> (6)對照的處理直接取未經(jīng)任何處理的小麥幼苗-80℃凍存作為對照。
2、轉(zhuǎn)膜(1)電泳及轉(zhuǎn)膜用具的處理0.1N NaOH/1mM EDTA浸泡1h以上，用清水沖洗干凈備用；(2)準(zhǔn)備甲醛變性凝膠在一個(gè)三角燒瓶中加入10ml 10×MOPs，73ml DEPC處理的水和1g瓊脂糖，加熱融化；當(dāng)冷卻到55℃左右時(shí)加入17ml甲醛，混勻，倒入RNA專用的膠槽中；(3)在DEPC處理的0.5ml離心管中加入RNA+DEPC處理水4μl(RNA約為30μg，利用Promega公司的RNAgents Total RNA Isolation System kit提取的上述幼苗的總RNA)甲酰胺12.5μl甲醛 4.0μl10×MOPs 2.5μl溴酚蘭(10×) 2.5μl(4)樣品在65℃水浴處理5min，然后點(diǎn)樣，開始電泳，緩沖液為1×MOPs。當(dāng)溴酚蘭到達(dá)凝膠1/3-1/2位置時(shí)，停止電泳；(5)用蒸餾水沖洗凝膠，用20×SSC轉(zhuǎn)膜。將凝膠翻轉(zhuǎn)后放在濾紙橋上，放上一張與凝膠大小相當(dāng)?shù)哪猃埬?Hybond-N+，Amarsharm)，趕除氣泡，在膜上放3層濾紙，與尼龍膜大小相同，趕除氣泡，將凝膠周圍用膠片封好，放上大小相當(dāng)?shù)奈垼瑝荷霞s500g的重物，轉(zhuǎn)膜16-24h，其間更換吸水紙。轉(zhuǎn)膜完成后，用2×SSC洗膜10min，用濾紙吸干，保鮮膜包好，紫外燈照射3min，4℃存放至雜交；3、探針的制備在TaEREB2基因的3’設(shè)計(jì)特異引物EREB2F和EREB2R(避開AP2/EREBP區(qū)域)，以克隆的TaEREB2基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序及體系如下引物序列EREB2F5’-TCC ACG AGC GCA CCC AAG-3’EREB2R5’-ACA CTT GCG AGT GTC CTA TCC TAT CC-3’反應(yīng)體系(50μl)模板(60ng/ul) 0.5μldNTP(10mM) 1μl引物(25μM) 1μl10×buffer 5μlddh2O 42.1μlTaq(5U/μl) 0.4μl擴(kuò)增條件(PTC-200)
取擴(kuò)增產(chǎn)物2ul在1.2％瓊脂糖凝膠中電泳檢測，溴化乙啶染色，紫外凝膠成像儀掃描，觀察在540bp左右的位置處是否有一條亮帶。
4、探針的回收采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.DV807A)回收純化探針(同三、cDNA文庫的篩選的探針的回收)。
5、探針標(biāo)記探針標(biāo)記為隨機(jī)六聚體引物法，每1-2張膜加入步驟4的探針DNA，約50-100ng和，加水至14.5μl，100℃煮沸變性5min后立即置于冰浴中5min，瞬時(shí)離心，然后加入下列成分，終體積25μl，于37℃反應(yīng)5h-8h。
5×Oligo緩沖液 5μlKlenow片段(5U/μl) 0.7μl10×緩沖液 2.5ulBSA(10mg/ml)1μlα-32P-dCTP(10mCi/ml) 1.5μl其中，1ml 5×Oligo緩沖液中含有160μlH2O250μl1M Tris-HCl25μl 1M MgCl25μl 1M巰基乙醇500μl2M HEPES20μl 100mM dATP20μl 100mM dGTP20μl 100mM dTTP4、預(yù)雜交和雜交反應(yīng)根據(jù)要雜交的膜的數(shù)量配制預(yù)雜交液，每10ml預(yù)雜交液的成分組成如下。
ddH2O 6.5ml5×HSB 2mlDenHardt’sIII 1ml*ssDNA(鮭魚精DNA，Sigma)(10mg/ml) 0.5ml*ssDNA加入之前需變性煮沸10min后立即放冰上10min。
其中，5×HSB(pH6.8)分子量(MW) g/200mlNaCl(3M) 58.44 35.064
PIPES(0.1M) 302.4 6.048EDTA(20mM) 372.24 1.488Denhardt’sIIIg/100ml2％明膠 22％Ficoll-40022％PVP-360 210％SDS 105％Na4P2O·10H2O 5將預(yù)雜交液混勻，于65℃預(yù)熱至澄清后放入尼龍膜，65℃預(yù)雜交5-6h(新膜)；探針標(biāo)記完后，加入等體積的0.4N NaOH溶液，混勻后于室溫靜置10min使探針變性，然后加入到預(yù)雜交液中，65℃雜交過夜；5、洗脫將雜交完的膜從雜交管中取出放入洗脫盒中，加入少量洗液I(2×SSC/0.1％SDS)漂洗除去過量雜交液，然后用洗液I于45℃洗兩次，每次20min；再用洗液II(0.2×SSC/0.2％SDS)于45℃洗兩次，每次15min。洗液I洗過后，檢測雜交信號(hào)與背景情況，再?zèng)Q定是否繼續(xù)洗脫。用濾紙吸干洗好的膜，保鮮膜包好(注意除去氣泡)；6、放射自顯影在X-射線攝影暗盒中，將雜交膜置于增感屏上，在暗室中將X-光片放在雜交膜上，再放上另一張?jiān)龈衅?，壓緊X-射線攝影暗盒，-70℃冰箱曝光7-15天。
Northern分析結(jié)果如圖1a-1c所示，表明在干旱脅迫2小時(shí)后，以及在高鹽(2％(NaCl+NaSO4)脅迫2小時(shí)后TaEREB1基因開始表達(dá)。同樣，在白粉病菌誘導(dǎo)的條件下，TaEREB1基因表達(dá)增強(qiáng)，說明TaEREB1基因分別受干旱、高鹽和病原菌誘導(dǎo)表達(dá)。但是，在冷脅迫和ABA處理的條件下，TaEREB1基因沒有表達(dá)。說明該基因不受冷脅迫和ABA誘導(dǎo)。圖1a-1c中，CK為對照。
實(shí)施例3、TaEREB2的激活特性一、將TaEREB2基因構(gòu)建到表達(dá)載體YEP-GAP上1、獲得TaEREB2基因編碼氨基酸部分的全序列根據(jù)已克隆的TaEREB2基因的序列設(shè)計(jì)引物，引物末端分別加EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增獲得編碼氨基酸部分的全序列，程序及體系如下引物序列TaEREB2-EI5’-TTATGAATTCGCAAAGATGTGCGGCGGTG-3’
TaEREB2-XI5’-TTTTCTCGAGTTGCGAGTGTCCTATCCTATCCTGTTG-3’反應(yīng)體系(50μl)模板(60ng/ul) 0.5μldNTP(10mM) 1μl引物(25μM)1μl10×buffer 5μlddh2O 42.1μlTaq(5U/μl)0.4μl擴(kuò)增條件(PTC-200) 取擴(kuò)增產(chǎn)物2ul在1.2％瓊脂糖凝膠中電泳檢測，溴化乙啶染色，紫外凝膠成像儀掃描，觀察在1.1Kb左右的位置處是否有一條亮帶。
采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.DV807A)回收純化PCR產(chǎn)物方法同實(shí)施例1的三、cDNA文庫的篩選中的步驟2、探針的回收)。
2、將TaEREB2基因構(gòu)建到表達(dá)載體YEP-GAP上將步驟1中純化的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體YEP-GAP Liu Q，Kasuga M，Sakuma Y，AbeH，Miura S，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.，1998)，用EcoRI(Takara)和XhoI(Takara)分別酶切4-6hr，反應(yīng)體系如下10×緩沖液H5μlEcoR I(12U/μl)2μlXhoI(12U/μl) 2μlPCR產(chǎn)物/YEP-GAP20μlddH2O 21μl采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.DV807A)回收純化酶切產(chǎn)物(方法同實(shí)施例1的三、cDNA文庫的篩選中的步驟2、探針的回收)。
將純化的酶切PCR產(chǎn)物和酶切載體YEP-GAP連接4-8hr，反應(yīng)體系如下10×Ligase buffer 1μl酶切PCR產(chǎn)物 4μl酶切載體YEP-GAP 4μlT4DNA Ligase 1μl
取0.5μl連接產(chǎn)物，電擊轉(zhuǎn)化JM109菌株，37℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆，測序分析序列是否正確，得到含有TaEREB2基因的重組表達(dá)載體YEP-GAP-TaEREB2。
二、TaEREB2的體內(nèi)結(jié)合特異性和激活特性的驗(yàn)證1、酵母報(bào)道子的構(gòu)建將含有4個(gè)GCC-盒元件的串聯(lián)序列5’-GAATTC-GAGCCGCCAC-GAGCCGCCAC-GAGCCGCCAC-GAGCCGCCAC-GTCGAC-3’(GCC-盒的核心序列是GCCGCC)分別構(gòu)建到pHis-1載體(MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)的PminHIS3啟動(dòng)子和pLacZi載體(MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)PCYCI啟動(dòng)子上游，分別得到重組載體pHis-1-GC和pLacZi-GC，用Xho I和Nco I內(nèi)切酶分別將pHis-1-GC和pLacZi-GC切成線狀。先將線狀pHis-1-GC轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞(YM4271株系，MATCHMAKEROne-Hybrid System，Clontech公司)內(nèi)，獲得能在SD/His-培養(yǎng)基上正常生長的酵母轉(zhuǎn)化子(Yeast transformant)。接著以這種酵母轉(zhuǎn)化子為寄主細(xì)胞，繼續(xù)轉(zhuǎn)化含有4個(gè)重復(fù)GCC-盒元件的pLacZi-GC載體。這樣在同時(shí)缺乏組氨酸和尿嘧啶的SD/His-/Ura-培養(yǎng)基上，選擇獲得含有pHis-1-GC和pLacZi-GC的正常雙重酵母報(bào)道子；將4個(gè)GCC-盒元件的核心序列GCCGCC突變成TTTTTT(MGCC盒)，即5’-GAATTC-GATTTTTTAC-GATTTTTTAC-GATTTTTTAC-GATTTTTTAC-GTCGAC-3’，按正常的雙重酵母報(bào)道子構(gòu)建方法，再構(gòu)建一個(gè)含4個(gè)MGCC盒的突變體雙重酵母報(bào)道子。
2、PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化酵母及結(jié)果分析(1)接種酵母菌株(YM4271株系，MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)到1ml YPD液體培養(yǎng)基中，劇烈震蕩2分鐘，分散團(tuán)塊后將懸浮液轉(zhuǎn)至含有50ml YPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃/250rpm搖過夜，測OD600＝1.7-1.8(計(jì)數(shù)約4×107個(gè)/mL)；(2)取30ml步驟(1)過夜培養(yǎng)物接到300ml新鮮的YPD培養(yǎng)基中，30℃/250rpm培養(yǎng)，約3小時(shí)至OD600＝0.5±0.1，室溫1000g離心5min，收集菌體，棄上清，用1/2體積1×TE懸浮，1000g/5min離心；(3)吸棄上清，用1.5ml新鮮配制的1×TE/LiAc溶液懸浮，振蕩混勻備用；(4)取出0.1ml酵母感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，依次加下列溶液0.1μg表達(dá)載體YEP-GAP-TaEREB2、0.1mg ssDNA(鮭魚精DNA，Sigma)、0.6mlPEG/LiAc高速振蕩1分鐘，30℃/200rpm振蕩培養(yǎng)30分鐘；(5)加入70ul DMSO(sigma#D8779)，輕輕倒置混勻，42℃熱激30分鐘，其間輕輕振蕩，冰浴2分鐘，室溫1000g離心5min；(6)吸棄上清，加入0.5ml 1×TE buffer懸浮細(xì)胞；(7)用接種環(huán)蘸取懸浮液，分別在含有0，15mmol/L 3-AT的SD/His-/Ura-/Trp-選擇性培養(yǎng)基上畫線培養(yǎng)。
(8)平板的一半培養(yǎng)步驟1構(gòu)建的正常雙重酵母報(bào)道子，另一半培養(yǎng)步驟1構(gòu)建的突變體雙重酵母報(bào)道子，以便做對照分析。
(9)顛倒放置于培養(yǎng)箱中，30℃培養(yǎng)3-4天。
(10)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0mmol/L 3-AT的SD/His-/Ura-/Trp-的培養(yǎng)基平板上正常的酵母報(bào)道子和突變的酵母報(bào)道子都有生長，但突變的酵母報(bào)道子的直徑明顯??；而在15mmol/L 3-AT的SD/His-/Ura-/Trp-的培養(yǎng)基平板上正常的酵母報(bào)道子能正常生長，但突變的酵母報(bào)道子被抑止沒有生長。
3、半乳糖苷酶活性檢測(1)從0mmol/L 3-AT的SD/His-/Ura-/Trp-的培養(yǎng)基平板上分別挑取正常的酵母報(bào)道子和突變的酵母報(bào)道子菌落。轉(zhuǎn)至YPD液體培養(yǎng)基中，于30℃振蕩培養(yǎng)，待長至對數(shù)生長后期，取1.5ml菌液，3000rpm離心30s；(2)棄上清，控干管中液體，將離心管置于液氮中速凍10min，取出使其自然融解，加50ul Z/X-gal溶液，30℃溫育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常的酵母報(bào)道子在6-8h內(nèi)變藍(lán)，而突變的酵母報(bào)道子在12h內(nèi)沒有變化，仍為白色。說明轉(zhuǎn)錄因子TaEREB2能與GCC-盒順式作用元件結(jié)合，且具有激活功能，激活了Pmin啟動(dòng)子(包括PminHIS3啟動(dòng)子和PCYCI啟動(dòng)子)，促使報(bào)道基因表達(dá)。從而證明了TaEREB2的體內(nèi)結(jié)合特異性和激活功能。
三、藥劑配制(1)YPD液體培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)用酵母抽提物(Bacto-Yeast Extract) 10g/L細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨(Bacto-Peptone)20g/L調(diào)節(jié)pH至5.8，121℃/15min滅菌，降至60℃以后加入40％的Glucose，使其終濃度為20g/L。
(2)SD/His-/Ura-/Trp-選擇性培養(yǎng)基不含氨基酸的酵母氮源(Yeast nitrogen base) 6.7g/L營養(yǎng)缺陷型混合物(drop-out media without Leu/Ura/Trp) 100ml瓊脂粉(Bacteriological agar) 20g/L調(diào)節(jié)pH至5.8，121℃/15min滅菌，降至60℃后加入40％Glucose，使其終濃度為20g/L。
(3)營養(yǎng)缺陷型混合物(Drop-out mix)(10X)L-Isoleucine(異亮氨酸) 300mg/LL-Valine(纈氨酸) 1500mg/LL-Adenine(腺嘌呤)200mg/L
L-Arginine(精氨酸) 200mg/LL-Histidine Hcl monohydrate(組氨酸)200mg/LL-Leucine(亮氨酸) 1000mg/LL-Lysine Hcl(賴氨酸) 300mg/LL-Methionine(甲硫氨酸) 200mg/LL-Phenylalanine(苯丙氨酸) 500mg/LL-Threonine(蘇氨酸)2000mg/LL-Tyrosine(酪氨酸) 300mg/L(4)1×PEG/LiAc50％(w/v)PEG3350 8ml10×TE buffer1ml10×LiAc 1ml(5)10×TE Buffer100mM Tris-Hcl10mM EDTA，pH＝7.5121℃高壓滅菌，室溫保存。
(6)1×TE/LiAc10×TE buffer1ml10×LiAc 1mlddH2O 8ml(7)Z BufferNa2HPO4·7H2O16.1g/LNaH2PO4·H2O 5.5g/LKCl 0.75g/LMgSO4·7H2O 0.246g/L調(diào)節(jié)pH至7.0，121℃/15min滅菌，4℃保存。
(8)X-gal儲(chǔ)存液(X-gal Stock Solution)用N，N-dimethyl-formamide(DMF)溶解X-gal，使其終濃度為20mg/ml，-20℃貯存。
(9)含有X-gal的Z buffer緩沖液100ml(Z buffer with X-gal)，注意現(xiàn)用現(xiàn)配Z buffer 98mlβ-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)0.27mlX-gal儲(chǔ)存液(X-gal stock solution) 1.67ml
序列表<160>2<210>1<211>1794<212>DNA<213>小麥屬小麥(Triticum aestivum L.)<400>1tttttttttt tgactaataa tgtttgctac aggttgcgct taaaacactg atagtgatac 60ataggttact gagagaaggc gacgggtcat tcaaagatga cttcctgagc tattcgtaca120gaggaaacat tttgcagctt ccaaatttca gggatgactc gagcccatta ggtttgttct180atcgcgcatc attctgaact gcagcaacca acggaagctc ccgctcttct gtttcggtac240ctgacgcgac gctctcctcc accccctttt gtcagcatgg gattccgcac caccttgatc300agcctgccct gagttcatca ctcaaagtaa gaaagagggt agcgacggac aagcagaggg360acgcaggcac gtactatacc ttagtcacgt acacacagcg agaagtgagc aaagatgtgc420ggcggtgcca tcctcgccga gctcatgccg agcgcgccgc ccaggagcgt cacggcggtc480cacctcttgc ccaagcggca gagggtcgac gacttcgagg ttgctttcaa gcgcttcgac540gaggaccccg aggaggagga ggaggtgcgc cagtgcgcgg gcttcgagtt tggcgcccgc600gggcagccgg cagcgaggcg cggcggcggt aggccggcaa agtacagagg cgtccggcgc660aggccttggg gcaaatgggc ggcagagatc cgcgaccccg tcaagggcgt ccgggtctgg720ctcggaacct tcccctccgc cgaggccgcc gcgcacgcct acgacgacgc cgcacgcggc780ttccgcggcg ccaacgccag gctcaacttc ccctcctcgt ccacgagcgc acccaagtgc840cgcgtagccg aaaaaccgac accgttcgtt gttattgacc tcgacgacga caaagagggt900gatgccggag cagcggatgc cggcgggata agctccgaat ccagcggcgc cctgccggac960ttctcgtggc agggcatgtc cgcgtccgac gaggtcacgg cgcaatctgt ccatgctgaa 1020gtggagtccg gccagtccgt cgtcgacctg ggcagcgcca agaagcggcc ccggatcgaa 1080gccgacgagg ttctgccggc agcgtccgac gactccgcca accaactgtt agatcctttc 1140atgttcgatg acgaactcgg tttcttggac agcagctcgt acgagtggct ggatggcctg 1200ttcggcgccg atgctgagaa gatcgacggc agtcagctgg ggctctggag ctttggcgac 1260gatgactgtc tcgccgagga cagcgcgtgc gtgcaagtag agtagcagta ttgtagtatc 1320
atcaaagaca acaggatagg ataggacact cgcaagtgtt tgacgccctc ccacaccttg 1380tttttctttt gaggataccc ccacaccttg ttgatgatat ctctttcatc aaagaaataa 1440aaaaacaccc tgttaatgat gtaaaaaaaa aaaaaaaagt ttgcgccgcc gccgcctcga 1500ggacaatggg acgcacggtg gtttccgacg aggaagagga cgacttcatc gaggccgagg 1560aagaggacga gccgcggccg tcgcggaggg ccagggatga cgacgacgag caggacgacg 1620atgaggagga ggaggatgat gaagatgagg gacagaatga gtacgagaag gatggcttca 1680tagtggatga tgcggatgaa gacgaggagg aggaggagga ggaggcgaga gctagtgatg 1740at gaaagacg caagaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1794<210>2<211>296<212>PRT<213>小麥屬小麥(Triticum aestivum L.)<400>2Met Cys Gly Gly Ala Ile Leu Ala Glu Leu Met Pro Ser Ala Pro Pro1 5 10 15Arg Ser Val Thr Ala Val His Leu Leu Pro Lys Arg Gln Arg Val Asp20 25 30Asp Phe Glu Val Ala Phe Lys Arg Phe Asp Glu Asp Pro Glu Glu Glu35 40 45Glu Glu Val Arg Gln Cys Ala Gly Phe Glu Phe Gly Ala Arg Gly Gln50 55 60Pro Ala Ala Arg Arg Gly Gly Gly Arg Pro Ala Lys Tyr Arg Gly Val65 70 75 80Arg Arg Arg Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro Val85 90 95Lys Gly Val Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Pro Ser Ala Glu Ala Ala100 105 110Ala His Ala Tyr Asp Asp Ala Ala Arg Gly Phe Arg Gly Ala Asn Ala115 120 125Arg Leu Asn Phe Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ala Pro Lys Cys Arg Val
130 135 140Ala Glu Lys Pro Thr Pro Phe Val Val Ile Asp Leu Asp Asp Asp Lys145 150 155 160Glu Gly Asp Ala Gly Ala Ala Asp Ala Gly Gly Ile Ser Ser Glu Ser165 170 175Ser Gly Ala Leu Pro Asp Phe Ser Trp Gln Gly Met Ser Ala Ser Asp180 185 190Glu Val Thr Ala Gln Ser Val His Ala Glu Val Glu Ser Gly Gln Ser195 200 205Val Val Asp Leu Gly Ser Ala Lys Lys Arg Pro Arg Ile Glu Ala Asp210 215 220Glu Val Leu Pro Ala Ala Ser Asp Asp Ser Ala Asn Gln Leu Leu Asp225 230 235 240Pro Phe Met Phe Asp Asp Glu Leu Gly Phe Leu Asp Ser Ser Ser Tyr245 250 255Glu Trp Leu Asp Gly Leu Phe Gly Ala Asp Ala Glu Lys Ile Asp Gly260 265 270Ser Gln Leu Gly Leu Trp Ser Phe Gly Asp Asp Asp Cys Leu Ala Glu275 280 285Asp Ser Ala Cys Val Gln Val Glu290 29權(quán)利要求
1.一種植物乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID№2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)具有序列表中SEQ ID№2的氨基酸殘基序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述SEQ ID №2的自氨基端第39位-40位氨基酸殘基序列和第216位-218位氨基酸殘基序列為兩個(gè)核定位信號(hào)區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述SEQ ID №2的自氨基端第76位-133位氨基酸殘基序列為保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域。
5.一種植物乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于所述基因具有序列表中序列1的DNA序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因，其特征在于所述基因的開放閱讀框架為自5′端第415位-1305位堿基。
8.含有權(quán)利要求5、6或7所述基因的表達(dá)載體。
9.含有權(quán)利要求5、6或7所述基因的細(xì)胞系。
10.擴(kuò)增權(quán)利要求5、6或7所述基因的中任一片段的引物對。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白及其編碼基因。本發(fā)明的植物乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的TaEREB2在干旱、高鹽和病原菌的誘導(dǎo)下表達(dá)，并且可以特異的調(diào)控含有GCC－盒順式元件(核心序列GCCGCC)的基因的表達(dá)，本發(fā)明的TaEREB2為人為控制抗逆和耐逆相關(guān)基因的表達(dá)提供了基礎(chǔ)，將在培育抗逆性和耐逆性增強(qiáng)的植物育種中發(fā)揮重要的作用。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1706949SQ20041004656
公開日2005年12月14日 申請日期2004年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月11日
發(fā)明者馬有志, 徐兆師, 程憲國, 張瑞越, 李連城, 陳明, 邱志剛 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所