專利名稱：一種atp、nad及相關酶和底物的分析方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到生物化學領域中的檢測方法，具體涉及一種輔酶及相關酶和底物的分析方法。
背景技術：
NAD作為目前已知的300多種脫氫酶的輔酶，存在于一切動物、植物和微生物的細胞中，是生物發(fā)酵、生命和生理過程參與能量代謝的一種重要物質(zhì)。建立快速、靈敏和準確的分析方法不僅有助于推動生命過程的研究，同時對于醫(yī)學臨床診斷、藥物分析等領域也有著重要的實際意義。
目前NAD、NADH的檢測包括其相關酶的分析方法大都利用一些酶將NAD轉(zhuǎn)化為NADH，然后利用NADH在360nm紫外光區(qū)有最大吸收建立了其紫外吸收光度法或利用NADH的熒光進行直接熒光測定，還有電化學方法、高效毛細管電泳法及高效毛細管電泳-電化學方法聯(lián)用，但是文獻報道的方法NAD的檢測限一般僅為10-7M-10-8M，最近報道發(fā)展了NAD(H)流動注射分析方法，檢測限才達1pmol，上述方法的檢測線性范圍一般在兩個數(shù)量級左右。上述方法靈敏度不夠，使得對微小體系及極微量體系的分析受到了限制；同時容易受其它物質(zhì)的干擾，不利于生物活體分析。
三磷酸腺苷(ATP)是生物體內(nèi)高能量化合物，它儲存能量，供細胞生命活動需要，是生物細胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)移的中轉(zhuǎn)站；ATP含量的多少，可以直接反映細胞活性，細胞死亡后由于細胞內(nèi)有ATP酶的存在，ATP迅速水解，因此測定內(nèi)源性ATP的含量可以反映活細胞的數(shù)量；在體外測定經(jīng)不同濃度化療藥物直接殺傷的培養(yǎng)腫瘤細胞中的ATP含量，即可判斷該腫瘤細胞對化療藥物的敏感程度。在環(huán)境分析方面，ATP含量的多少還可反映微生物的數(shù)量即污泥活性，檢測微生物代謝產(chǎn)生的ATP已經(jīng)成為化妝品、食品、藥品等許多行業(yè)中生產(chǎn)商關注的焦點；另外細胞內(nèi)的ATP還可作為上皮細胞的一個信號分子，在細胞死亡模式(凋亡或壞死)的辨別過程中起著非常重要的作用。目前ATP檢測大都采用熒光素法，最低可檢測到10-12-10-14M，但同時存在首期投入大(需要購買相關儀器)以及操作和結(jié)果分析較傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法復雜等缺點。
因此，建立快速、靈敏和準確的ATP與NAD分析方法不僅有助于推動生命過程的研究，同時對于臨床診斷、藥物分析等領域也有著重要的實際意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在發(fā)展一種快速高靈敏的ATP、NAD及相關酶和底物的分析方法，以解決當前分析方法存在的靈敏度不高及操作復雜等問題。為它們的分析及應用提供一種全新的途徑。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)發(fā)明目的的。本發(fā)明分析方法使用的核酸連接系統(tǒng)由環(huán)部與核酸片段序列相匹配、尾部一端帶有熒光標記、另一端帶有熒光標記或者熒光熄滅基團的分子信標核酸探針，與分子信標環(huán)部配對的兩個或兩個以上核酸片段以及以NAD為輔酶的DNA或RNA核酸連接酶在相應的無NAD或無ATP的連接系統(tǒng)緩沖溶液中組成；NAD分析方法為在無NAD的連接體系緩沖液中加入分子信標、連接酶和兩條或兩條以上配對的核酸鏈，在37℃溫育，同時監(jiān)測熒光強度，待熒光穩(wěn)定后分別加入不同濃度的NAD，觀察并記錄熒光強度的變化；ATP分析方法為在無ATP的連接體系緩沖液中加入分子信標、連接酶和兩條或兩條以上配對的核酸鏈，在37℃溫育，同時監(jiān)測熒光強度，待熒光穩(wěn)定后加入ATP，觀察并記錄熒光強度的變化；相關酶分析方法為在無NAD的連接體系緩沖液中加入分子信標、連接酶、兩條或兩條以上配對的核酸鏈、酶反應底物和NADH，在37℃溫育，同時監(jiān)測熒光強度，待熒光穩(wěn)定后加入相關酶，觀察并記錄熒光強度的變化；底物的分析方法為在無NAD的連接體體系加入分子信標，連接酶、兩條或兩條以上配對的核酸鏈、NADH和相關酶，在37℃溫育，同時監(jiān)測熒光強度，等熒光穩(wěn)定后加入酶反應底物，觀察并紀錄樣品熒光強度的變化。
上述分析方法中的熒光檢測所用波長根據(jù)分子信標修飾的熒光染料來選擇，激發(fā)波長為338-560mm，發(fā)射波長為505-660mm。
下面結(jié)合附圖詳述本發(fā)明。


圖1為本發(fā)明的分析方法原理2為NAD分析的實驗結(jié)果圖3為NAD分析選擇性的實驗結(jié)果圖4為ATP分析的實驗結(jié)果圖5為對相關酶(GLDH)分析的實驗結(jié)果圖6為對相關底物(α-KG)分析的實驗結(jié)果如圖1(上)所示意，本發(fā)明的檢測體系由分子信標、核酸片段1、2以及核酸連接酶所組成，其中核酸片段1、2分別與分子信標環(huán)狀部分的一半雜交。當NAD或ATP存在時，核酸連接酶將核酸片段1、2連接形成一長鏈的連接產(chǎn)物，該連接產(chǎn)物與分子信標環(huán)部的雜交將分子信標打開，產(chǎn)生明顯的熒光信號，這樣就實現(xiàn)了對NAD或ATP高靈敏的檢測分析。
如圖1(下)所示的體系中，如果NAD是由谷氨酸脫氫酶(Glutamate Dehydrogenase，GLDH)催化的反應產(chǎn)生的，此時就可對GLDH的活性進行實時分析。同理，如果NAD是由其它酶催化的反應產(chǎn)生的，也可對其它酶活性進行實時分析。同理利用本發(fā)明可建立起對酶作用底物(α-酮戊二酸)的分析方法。本方法可對NAD、ATP、相關酶及底物進行快速、靈敏和準確的測定，操作簡單、投入少，這種全新的分析途徑在生物分析、醫(yī)學臨床診斷、病理研究等領域有廣闊的應用前景。
具體實施例方式
實施例1(NAD分析)在100μL反應緩沖液(30mM Tris-HCl(PH8.0)、2.5mM CaCl2、5mM DTT、10mM MgCl2、1.2mM EDTA和0.05％BSA)中加入300nM分子信標5’-(TAMRA)-CCTCTC CGT GTC TG TACTTC CCG TCA GAGAGG-(DABCYL)-3’、6.0U的E.coli DNA連接酶，300nM核酸片段5’-GAC GGG AAG-3’和300nM另一核酸片段5’-TAC AAG ACA C-3’，在37℃溫育，同時用熒光儀F-2500監(jiān)測熒光強度，激發(fā)波長521nm，發(fā)射波長578nm，待熒光穩(wěn)定后加入不同濃度的NAD，得到熒光強度實時掃描曲線如圖2(左)所示。
圖2(左)是不同濃度NAD所對應核酸連接的實時監(jiān)測曲線，可以看出，隨著NAD濃度的提高，反應的初速度越來越大，將連接初速度對NAD濃度作圖得到圖2(右)。從圖中數(shù)據(jù)得到NAD最低檢測濃度為3×10-10M(S/N＝3)，與文獻比較提高2-3個數(shù)量級；最低檢測量為3×10-14mol，有兩個檢測線性范圍，分別為0.3-40nM以及40-300nM。
在上述緩沖液中分別加入300nM的NAD、NADH、NADP、NADPH、dATP、ATP、ADP和AMP，記錄樣品的熒光強度變化，分別求得各個樣品的熒光增強初速度，再以NAD樣品為基準作歸一化處理，結(jié)果如圖3所示，除加入NADH有少量熒光增強外，NADP、NADPH、dATP、ATP、ADP和AMP等都沒有明顯熒光增強信號，說明該方法具有很高的選擇性。
熒光檢測所用波長根據(jù)分子信標修飾的熒光染料來選擇(見表1)。
表1.常用熒光染料及其最大吸收和發(fā)射波長

注為避免激發(fā)光對發(fā)射光的影響，在具體測量時根據(jù)實際情況適當調(diào)整。
實施例2(ATP分析)在100μL反應緩沖液(66mM Tris-HCl(PH8.0)、6.6mM MgCl2、10mM DTT)中加入400nM分子信標5’-(TAMRA)-CCTCTC CGT GTC TG TAC TTC CCG TCA GAGAGG-(DABCYL)-3’、1.4U的T4 DNA連接酶，400nM核酸片段5’-GAC GGG AAG-3’和400nM另一核酸片段5’-TAC AAG ACA C-3’，在37℃溫育，同時用熒光儀F-2500監(jiān)測熒光強度，激發(fā)波長521nm，發(fā)射波長578nm，待熒光穩(wěn)定后加入不同濃度的ATP，得到熒光強度實時掃描曲線如圖4(左)所示。
圖4(左)是不同濃度ATP所對應核酸連接的實時監(jiān)測曲線，可以看出，隨著ATP濃度的提高，反應的初速度越來越大。將連接初速度對ATP濃度作圖得到圖4(右)，其檢測下限為2nM，線性分析范圍為2-300nM。
實施例3(谷氨酸脫氫酶分析)在100μL反應緩沖液(30mM Tris-HCl(PH8.0)、5mM DTT、2.5mM CaCl2、10mM MgCl2、1.2mM EDTA和0.05％BSA)中加入5mM NH4Cl、0.5mM α-Ketoglutarate(α-KG)、300μMNADH、300nM分子信標5’-(TAMRA)-CCTCTC CGT GTC TG TAC TTC CCG TCA GAGAGG-(DABCYL)-3’、0.48U的E.coli DNA連接酶，300nM核酸片段5’-GAC GGG AAG-3’和300nM另一核酸片段5’-TAC AAG ACA C-3’，在37℃溫育，同時用熒光儀F-2500監(jiān)測熒光強度，激發(fā)波長521nm，發(fā)射波長578nm，待熒光穩(wěn)定后加入0.34U谷氨酸脫氫酶，觀察并記錄熒光強度的變化。
實驗結(jié)果如圖5所示，可以看到在谷氨酸脫氫酶加入后，樣品的熒光強度迅速增強，實驗結(jié)果證明該方法能實現(xiàn)對谷氨酸脫氫酶的檢測。
實施例4(α-酮戊二酸分析)在100μL反應緩沖液(30mM Tris-HCl(PH8.0)、5mM DTT、2.5mM CaCl2、10mM MgCl2、1.2mM EDTA和0.05％BSA)中加入5mM NH4Cl、0.34 Unit谷氨酸脫氫酶、300μM NADH、300nM分子信標5’-(TAMRA)-CCTCTC CGT GTC TG TAC TTC CCG TCA GAGAGG-(DABCYL)-3’、0.48U的E.coli DNA連接酶，300nM核酸片段5’-GAC GGG AAG-3’和300nM另一核酸片段5’-TAC AAG ACA C-3’，在37℃溫育，同時用熒光儀F-2500監(jiān)測熒光強度，激發(fā)波長521nm，發(fā)射波長578nm，待熒光穩(wěn)定后加入0.5mM α-Ketoglutarate(α-KG)，觀察并記錄熒光強度的變化。
實驗結(jié)果如圖6所示，可以看到在α-Ketoglutarate加入后，樣品的熒光強度迅速增強，證明該方法能實現(xiàn)對α-Ketoglutarate的檢測。
權(quán)利要求
1.一種ATP、NAD及相關酶和底物的分析方法，其特征在于該方法使用的核酸連接系統(tǒng)由環(huán)部與核酸片段序列相匹配、尾部一端帶有熒光標記另一端帶有熒光標記或者熒光熄滅基團的分子信標核酸探針，與分子信標環(huán)部配對的兩個或兩個以上核酸片段以及以NAD為輔酶的DNA或RNA核酸連接酶在相應的無NAD或無ATP的連接體系緩沖溶液中組成，(1)NAD分析方法為在無NAD的連接體系緩沖液中加入分子信標、連接酶和兩條或兩條以上配對的核酸鏈，在37℃溫育，同時監(jiān)測熒光強度，待熒光穩(wěn)定后分別加入NAD樣品，觀察并記錄熒光強度的變化，(2)ATP分析方法為在無ATP的連接體系緩沖液中加入分子信標、連接酶和兩條或兩條以上配對的核酸鏈，在37℃溫育，同時監(jiān)測熒光強度，待熒光穩(wěn)定后加入ATP，觀察并記錄熒光強度的變化，(3)相關酶分析方法為在無NAD的連接體系緩沖液中加入分子信標、連接酶、兩條或兩條以上配對的核酸鏈、NADH和酶反應底物，在37℃溫育，同時監(jiān)測熒光強度，待熒光穩(wěn)定后加入相關酶，觀察并記錄樣品熒光強度的變化，(4)底物的分析方法為在無NAD的連接體系緩沖液中加入分子信標、連接酶、兩條或兩條以上配對的核酸鏈、NADH和相關酶，在37℃溫育，同時監(jiān)測熒光強度，等熒光穩(wěn)定后加入酶反應底物，觀察并紀錄樣品熒光強度的變化。
2.按權(quán)利要求1所述的ATP、NAD及相關酶和底物分析方法，其特征在于熒光檢測所用波長根據(jù)分子信標修飾的熒光染料來選擇，激發(fā)波長為338～560mm，發(fā)射波長為505～660mm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種輔酶和輔酶相關酶及底物的分析技術。分析使用的核酸連接系統(tǒng)由分子信標核酸探針，核酸片段以及以NAD為輔酶的核酸連接酶在相應的緩沖溶液中組成；NAD、相關酶及底物的分析在無NAD的緩沖液中進行，ATP的分析在無ATP的緩沖液中進行，分析在相應的連接體系緩沖液中加入分子信標、連接酶和兩條或兩條以上配對的核酸鏈，在37℃溫育，監(jiān)測熒光強度，得熒光穩(wěn)定后加入待測的NAD、ATP、相關酶或底物，記錄熒光強度的變化。本發(fā)明對輔酶ATP、NAD、相關酶和底物的檢測分析快速、靈敏、準確、操作簡單、投入少，具有重要的科學價值和廣闊的市場前景，有較大的社會效益和經(jīng)濟效益。
文檔編號C12Q1/68GK1632134SQ200410046659
公開日2005年6月29日 申請日期2004年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月13日
發(fā)明者王柯敏, 唐志文, 譚蔚泓, 馬昌杯 申請人:湖南大學