專利名稱：一種快速質(zhì)粒抽提純化試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速質(zhì)粒抽提純化試劑盒及其應(yīng)用，尤其是涉及一種細(xì)菌質(zhì)粒抽提純化試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)菌的質(zhì)粒是DNA重組的重要載體和工具，分離純化質(zhì)粒是現(xiàn)代分子生物技術(shù)必不可少的手段?，F(xiàn)有質(zhì)粒的分離主要有兩個(gè)方法一是由Birnbiom和Doly創(chuàng)造的堿裂解法，二是由Holmes和Quigley發(fā)明的煮沸法，還有一些在此基礎(chǔ)上發(fā)展而來的其它方法如PEG法、氯化銫密度梯度離心法等。目前普遍使用的質(zhì)粒抽提方法是以堿裂解方法為基礎(chǔ)結(jié)合二氧化硅DNA親和性質(zhì)，加清洗液用離心或真空抽提的方法得到純化的質(zhì)粒，此方法創(chuàng)造性地改進(jìn)了質(zhì)粒的抽提純化過程，它已廣泛地應(yīng)用于當(dāng)前醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)及其它分子生物學(xué)研究領(lǐng)域。目前市場上所流行的各種“miniprep”、“midiprep”、“maxiprep”都是商家所提供的各種質(zhì)粒純化試劑盒，其中以Qiagen公司的最為經(jīng)典，其試劑盒包括七種獨(dú)立存在的不同液體試劑，用它進(jìn)行質(zhì)粒純化，具體包括以下步驟收集菌體、重懸、堿裂解、中性化、長時(shí)間離心除雜質(zhì)、DNA結(jié)合、洗凈、洗脫等。這一方法縮短了抽提純化質(zhì)粒的時(shí)間，使質(zhì)粒純化的方法相對以往的方法簡單而有效，一般所花抽提純化時(shí)間約為30分鐘，因此為科研人員提供了更多的方便，節(jié)約了時(shí)間。然而，這一方法需要進(jìn)行菌體的重懸、中性化和長時(shí)間的離心等繁雜步驟，花費(fèi)的時(shí)間仍然較長，所花成本也較高，不太適合大量樣品的抽提，也限制了其自動化的進(jìn)程。CN1546516A公開了一種質(zhì)粒DNA提取和純化方法，提取和純化時(shí)間也很長，效率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有質(zhì)粒抽提純化方法存在的缺陷，提供一種構(gòu)成簡單，抽提純化操作簡便，效率更高的質(zhì)粒抽提純化試劑盒及質(zhì)粒抽提純化方法。
本發(fā)明的目的是采用以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明試劑盒至少包括下列四種獨(dú)立存在的液體菌體裂解液，DNA結(jié)合柱前處理液，DNA質(zhì)粒結(jié)合液，清洗液；優(yōu)選方案是還配置有洗脫液。
所述菌體裂解液配方葡萄糖10mM-1M，三氨基甲烷鹽酸20mM-1M，乙二胺四乙酸10mM-500mM，碳酸氫鈉100mM-500mM，曲拉通1％-50％(體積/體積)，十二烷基磺酸鈉1％-25％(重量/體積)，溶菌酶2mg/ml-1g/ml，核糖核酸酶5-50mg/ml。
所述DNA結(jié)合柱前處理液配方氯化鋰或氯化鈉10mM-5M，氫氧化鉀或氫氧化鈉100mM-2M，十二烷基磺酸鈉5％-20％(重量/體積)，鹽酸0.01M-2.5M。
所述DNA質(zhì)粒結(jié)合液的配方鹽酸胍1M-6M，氯化鈉10mM-100mM，嗎啉代乙烷磺酸10mM-100mM，異丙醇；四者體積配比40∶40∶10∶10。
所述清洗液配方三氨基甲烷鹽酸1-50mM，乙醇70-85％(體積)。
所述洗脫液為pH8-9濃度8-12mM的三氨基甲烷鹽酸；當(dāng)試劑盒中沒有配備此種洗脫液時(shí)，可以純水代替此種洗脫液進(jìn)行洗脫。
將各原料按配比混合，即可制備成所述各種溶液。
使用本試劑盒進(jìn)行細(xì)菌質(zhì)粒抽提純化的方法如下裂解菌體將40-100μl裂解溶液加入300-1000μl(OD600＞2)培養(yǎng)菌液，混合放置40-80秒鐘；前處理DNA結(jié)合柱將150-300μl DNA結(jié)合柱前處理溶液加入DNA結(jié)合柱中，以10000-15000轉(zhuǎn)離心8-20秒，棄除溶液；結(jié)合質(zhì)粒DNA將200-400μl DNA質(zhì)粒結(jié)合溶液加入裂解菌液之中，上下翻倒離心小管8-12次，混合，加入已經(jīng)處理過的DNA結(jié)合柱之中，以10000-15000轉(zhuǎn)離心10-30秒；清洗加入清洗溶液700-900μl，以10000-15000轉(zhuǎn)離心8-20秒，棄除離心液，再離心50-80秒鐘。
洗脫加入30-40μl洗脫液于DNA結(jié)合柱中心，以10000-15000轉(zhuǎn)離心20-40秒，即可得到高純度質(zhì)粒DNA。
使用本發(fā)明試劑盒及質(zhì)粒抽提純化方法得到的質(zhì)粒DNA，經(jīng)使用分光光度計(jì)檢測，A260/A280值為1.7-2.0。
使用本發(fā)明試劑盒及質(zhì)粒抽提純化方法從培養(yǎng)的菌體中提取高純度的質(zhì)粒，可用于下列各種實(shí)驗(yàn)，如酶切重組、測序、PCR等等。
本發(fā)明摒棄了以往質(zhì)粒抽提所用堿裂解法，采用溫和變性劑及酶裂解法，不必離心收集菌體，直接利用高濃度(OD600＞2)培養(yǎng)菌液(如大腸桿菌DH5α、XL1-Blue等)進(jìn)行裂解；采用全新溶液配方前處理二氧化硅纖維膜，使蛋白、RNA細(xì)菌膜片等雜質(zhì)更易清除，而且質(zhì)粒DNA更易結(jié)合；還省去了現(xiàn)有廣泛使用的經(jīng)典方法中的重懸、中性化等步驟；正是由于上述原因，使用本發(fā)明之試劑盒及質(zhì)粒抽提純化方法，可在3-5分鐘內(nèi)快速有效地完成質(zhì)粒抽提純化工作，大大縮短抽提時(shí)間，從而可為研究人員節(jié)省大量實(shí)驗(yàn)時(shí)間；還可以用于大批量樣品抽提，在緊急情況下抽提純化質(zhì)粒；此法還為質(zhì)粒抽提的自動化和大規(guī)?；於思夹g(shù)基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1裂解液的配方為葡萄糖10mM，三氨基甲烷鹽酸20mM，乙二胺四乙酸10mM，碳酸氫鈉100mM，曲拉通1％(體積/體積)，十二烷基磺酸鈉1％(重量/體積百分比)，溶菌酶2mg/ml，核糖核酸酶5mg/ml。做每個(gè)樣品需取60μl放入離心小管內(nèi)。
DNA結(jié)合柱前處理液的配方為氯化鋰10mM，氫氧化鈉0.001M，十二烷基磺酸鈉5％，鹽酸0.01M。做每個(gè)樣品取250μl放入結(jié)合柱中。
DNA質(zhì)粒結(jié)合液的配方為鹽酸胍6M，氯化鈉100mM，嗎啉代乙烷磺酸100mM，異丙醇，四者體積之比為40∶40∶10∶10。做每個(gè)樣品取350μl放入結(jié)合柱中。
清洗液的配方為三氨基甲烷鹽酸1mM，再加入無水乙醇80％(體積)。做每個(gè)樣品取750μl放入結(jié)合柱中。
洗脫液為三氨基甲烷鹽酸8mM，pH8。每個(gè)樣品取量為40μl。
使用本試劑盒，進(jìn)行質(zhì)粒抽提純化的步驟如下(1)將裂解溶液60μl加入800μl(OD600＞2)大腸桿菌DH5α培養(yǎng)液，混合放置80秒鐘，同時(shí)進(jìn)行第二步；(2)將250μl前處理溶液加入DNA結(jié)合柱中，10000轉(zhuǎn)離心20秒，棄除溶液；(3)將350μ1 DNA結(jié)合溶液加入裂解菌液之中，上下翻倒離心小管12次，混合，加入已經(jīng)處理過的DNA結(jié)合柱之中，離心30秒(15000轉(zhuǎn))；(4)加入清洗溶液750μl，15000轉(zhuǎn)離心20秒，棄除離心液，再離心80秒鐘；(5)加入40μl洗脫液于結(jié)合柱中心，15000轉(zhuǎn)離心40秒，得到高純度質(zhì)粒DNA。
經(jīng)使用分光光度計(jì)對抽提純化所得質(zhì)粒DNA進(jìn)行檢測，A260/A280值為1.7。
實(shí)施例2裂解液的配方為葡萄糖500mM，三氨基甲烷鹽酸200mM，乙二胺四乙酸100mM，碳酸氫鈉200mM，曲拉通10％(體積/體積百分比)，十二烷基磺酸鈉10％(重量/體積百分比)，溶菌酶20mg/ml，核糖核酸酶0.5mg/ml。做每個(gè)樣品取50μl放入離心小管內(nèi)。
DNA結(jié)合柱前處理液的配方為氯化鈉2M，氫氧化鉀0.1M，十二烷基磺酸鈉10％(重量/體積百分比)，鹽酸0.5M。做每個(gè)樣品取200μl放入結(jié)合柱中。
DNA質(zhì)粒結(jié)合液的配方為鹽酸胍2.5M，氯化鈉3mM，嗎啉代乙烷磺酸50mM，異丙醇100％(體積)，四者體積比例40∶40∶10∶10。做每個(gè)樣品取300μl放入結(jié)合柱中。
清洗液的配方為三氨基甲烷鹽酸10mM，加入無水乙醇80％(體積)。做每個(gè)樣品取600μl放入結(jié)合柱中。
洗脫液為pH8.5濃度10mM的氨基甲烷鹽酸。每個(gè)樣品取量為35μl。
使用本試劑盒，進(jìn)行質(zhì)粒抽提純化的步驟如下(1)將50μl裂解溶液加入500μl(OD600＞2)大腸桿菌DH5α培養(yǎng)液，混合，放置60秒鐘，同時(shí)進(jìn)行第二步；(2)將200μl前處理溶液加入DNA結(jié)合柱中，12000轉(zhuǎn)離心10秒，棄除溶液；(3)將300μl結(jié)合溶液加入裂解菌液之中，上下翻倒離心小管10次，混合，加入已經(jīng)處理過的DNA結(jié)合柱之中，12000轉(zhuǎn)離心10秒；(4)加入清洗溶液600μl，12000轉(zhuǎn)離心10秒，棄除離心液，再離心60秒鐘；(5)加入35μl洗脫液于結(jié)合柱中心，12000轉(zhuǎn)離心30秒，即得到高純度質(zhì)粒DNA。
經(jīng)使用分光光度計(jì)對抽提純化所得質(zhì)粒DNA進(jìn)行檢測，A260/A280值為2.0。
實(shí)施例3裂解液的配方為葡萄糖1M，三氨基甲烷鹽酸1M，乙二胺四乙酸500mM，碳酸氫鈉500mM，曲拉通50％(體積/體積)，十二烷基磺酸鈉25％(重量/體積)，溶菌酶1mg/ml，核糖核酸酶50mg/ml。做每個(gè)樣品取40μl放入離心小管內(nèi)。
DNA結(jié)合柱前處理液的配方為氯化鋰5M，氫氧化鉀2M，十二烷基磺酸鈉20％(重量/體積)，鹽酸2.5M。做每個(gè)樣品取150μl放入結(jié)合柱內(nèi)。
DNA質(zhì)粒結(jié)合液的配方為鹽酸胍1M，氯化鈉10mM，嗎啉代乙烷磺酸10mM，異丙醇，四者體積比例為40∶40∶10∶10。做每個(gè)樣品取250μl放入結(jié)合柱內(nèi)。
清洗液的配方比為三氨基甲烷鹽酸50mM，再加入乙醇85％(體積)。做每個(gè)樣品取500μl放入結(jié)合柱內(nèi)。
洗脫液為純凈水。每個(gè)樣品取量為30μl。
使用本試劑盒，進(jìn)行質(zhì)粒抽提純化的步驟如下(1)將40μl裂解溶液加入300μl(OD600＞2)XL1-Blue培養(yǎng)液，混合放置40秒鐘，同時(shí)進(jìn)行第二步。
(2)將150μl前處理溶液加入DNA結(jié)合柱中，10000轉(zhuǎn)離心8秒，棄除溶液。
(3)將250μl結(jié)合溶液加入裂解菌液之中，上下翻倒離心小管8次，混合，加入已經(jīng)處理過的DNA結(jié)合柱之中，離心10秒(10000轉(zhuǎn))。
(4)加入清洗溶液500μl，10000轉(zhuǎn)離心8秒，棄除離心液，再離心50秒鐘。
(5)加入30μl純凈水于結(jié)合柱中心，10000轉(zhuǎn)離心20秒，即得到高純度質(zhì)粒DNA。
經(jīng)使用分光光度計(jì)對抽提純化所得質(zhì)粒DNA進(jìn)行檢測，A260/A280值為1.8。
上述實(shí)施例中所使用的DNA結(jié)合柱為長沙安比奧生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Miniprep DNA結(jié)合柱。
權(quán)利要求
1.一種質(zhì)粒抽提純化試劑盒，其特征在于，至少包括下列四種獨(dú)立存在的液體菌體裂解液，DNA結(jié)合柱前處理液，DNA質(zhì)粒結(jié)合液，清洗液；所述菌體裂解液配方葡萄糖10mM-1M，三氨基甲烷鹽酸20mM-1M，乙二胺四乙酸10mM-500mM，碳酸氫鈉100mM-500mM，曲拉通1％-50％(體積/體積)，十二烷基磺酸鈉1％-25％(重量/體積)，溶菌酶2mg/ml-1000mg/ml，核糖核酸酶5-50mg/ml；所述DNA結(jié)合柱前處理液配方氯化鋰或氯化鈉10mM-5M，氫氧化鉀或氫氧化鈉100mM-2M，十二烷基磺酸鈉5％-20％(重量/體積)，鹽酸0.01M-2.5M；所述DNA質(zhì)粒結(jié)合液的配方鹽酸胍1M-6M，氯化鈉10mM-100mM，嗎啉代乙烷磺酸10mM-100mM，異丙醇；四者體積配比40∶40∶10∶10所述清洗液配方三氨基甲烷鹽酸1-50mM，再加入乙醇70-85％(體積)。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒抽提純化試劑盒，其特征在于，還配置有洗脫液，所述洗脫液為pH7.5-8.5濃度8-12mM的三氨基甲烷鹽酸。
3.一種質(zhì)粒抽提純化方法，其特征在于，包括以下步驟裂解菌體將40-100μl裂解溶液加入300-1000μl(OD600＞2)培養(yǎng)菌液，混合放置40-80秒鐘；前處理DNA結(jié)合柱將150-300μl DNA結(jié)合柱前處理溶液加入DNA結(jié)合柱中，以10000-15000轉(zhuǎn)離心8-20秒，棄除溶液；結(jié)合質(zhì)粒DNA將200-400μl DNA質(zhì)粒結(jié)合溶液加入裂解菌液之中，上下翻倒離心小管8-12次，混合，加入已經(jīng)處理過的DNA結(jié)合柱之中，以10000-15000轉(zhuǎn)離心10-30秒；清洗加入清洗溶液700-900μl，以10000-15000轉(zhuǎn)離心8-20秒，棄除離心液，再離心50-80秒鐘；洗脫加入30-40μl洗脫液于DNA結(jié)合柱中心，以10000-15000轉(zhuǎn)離心20-40秒，即可得到高純度質(zhì)粒DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒抽提純化方法，其特征在于包括以下步驟裂解菌體將50μl裂解溶液加入500μl(OD600＞2)培養(yǎng)菌液，混合放置60秒鐘；前處理DNA結(jié)合柱將200μl DNA結(jié)合柱前處理溶液加入DNA結(jié)合柱中，以12000轉(zhuǎn)離心10秒，棄除溶液；結(jié)合質(zhì)粒DNA將300μl DNA質(zhì)粒結(jié)合溶液加入裂解菌液之中，上下翻倒離心小管10次，混合，加入已經(jīng)處理過的DNA結(jié)合柱之中，以12000轉(zhuǎn)離心20秒；清洗加入清洗溶液780μl，以12000轉(zhuǎn)離心10秒，棄除離心液，再離心60秒鐘。洗脫加入35μl洗脫液于DNA結(jié)合柱中心，以12000離心30秒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速質(zhì)粒抽提純化試劑盒及進(jìn)行細(xì)菌質(zhì)粒抽提純化的方法，其試劑盒包括下列獨(dú)立存在的液體無堿含酶菌體裂解液，DNA結(jié)合柱前處理液，DNA質(zhì)粒結(jié)合液，清洗液，洗脫液。使用本試劑盒進(jìn)行細(xì)菌質(zhì)粒抽提純化的方法包括如下步驟裂解菌體；前處理DNA結(jié)合柱；結(jié)合質(zhì)粒DNA；清洗；洗脫。使用本發(fā)明試劑盒及質(zhì)粒抽提純化方法，可在3－5分鐘內(nèi)快速有效地完成質(zhì)粒抽提純化工作，大大縮短抽提時(shí)間；所得到的質(zhì)粒DNA，經(jīng)使用分光光度計(jì)檢測，A
文檔編號C12N15/63GK1654660SQ20041004713
公開日2005年8月17日 申請日期2004年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月31日
發(fā)明者李樂攻, 李東屏, 黃詠 申請人:李樂攻, 李東屏, 黃詠