專(zhuān)利名稱(chēng)：中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子及其克隆和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因的調(diào)控序列，具體地說(shuō)是中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子及其克隆和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中國(guó)對(duì)蝦是中國(guó)近海地方特有種，主要分布于黃渤海和東海北部，朝鮮西海岸；其中，黃海北部與渤海種群巨大，是我國(guó)最重要的海洋生物資源之一，具有分布緯度高，集群、長(zhǎng)距離洄游習(xí)性等特點(diǎn)(劉瑞玉.″對(duì)蝦″.中國(guó)大百科全書(shū)，生物卷(I)1990，205-206)。隨著市場(chǎng)對(duì)優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)品需求量的不斷增長(zhǎng)，蝦類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)在世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)越來(lái)越重要的地位。在我國(guó)，80年代以來(lái)，對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)成為我國(guó)沿海地區(qū)的一項(xiàng)重要產(chǎn)業(yè)。近年來(lái)，對(duì)蝦養(yǎng)殖出現(xiàn)了種質(zhì)退化、抗病力下降等問(wèn)題。為了培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病力強(qiáng)的對(duì)蝦品種，必須利用現(xiàn)代生物技術(shù)改良對(duì)蝦種質(zhì)和提高對(duì)蝦抗病能力。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育新品種是遺傳改良的重要途徑之一。
自1974年美國(guó)學(xué)者Jaenisch首次應(yīng)用顯微注射法獲得轉(zhuǎn)基因小鼠以來(lái)，轉(zhuǎn)基因生物已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、畜牧、醫(yī)藥、生物學(xué)基礎(chǔ)研究等各個(gè)領(lǐng)域，其商業(yè)化發(fā)展極為迅猛。作為主要海水養(yǎng)殖對(duì)象的對(duì)蝦類(lèi)，由于繁殖和發(fā)育生物學(xué)的特殊性，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因遺傳操作難度很大，近年來(lái)才有少量的研究報(bào)道，成功的例子不多。對(duì)蝦轉(zhuǎn)基因存在的主要問(wèn)題是缺乏對(duì)蝦自源的啟動(dòng)子；基因表達(dá)效率低；缺乏生物安全性措施等。
對(duì)蝦轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。在對(duì)蝦遺傳改良方面，可以將抗病基因轉(zhuǎn)移到對(duì)蝦中，提高抗病力，得到抗病抗逆能力強(qiáng)的新品系，有可能解決對(duì)蝦養(yǎng)殖受病害嚴(yán)重困擾的問(wèn)題；如果將促進(jìn)生長(zhǎng)的基因轉(zhuǎn)移到對(duì)蝦中，可以得到生產(chǎn)周期短的對(duì)蝦新品種，年產(chǎn)量將大幅度提高。轉(zhuǎn)基因?qū)ξr研究，還可以建立一種以海水養(yǎng)殖生物作為海洋藥物基因表達(dá)系統(tǒng)的模型，生產(chǎn)質(zhì)優(yōu)、廉價(jià)的大量海洋天然產(chǎn)物。在基礎(chǔ)理論方面，轉(zhuǎn)基因研究有助于對(duì)蝦功能基因的篩選、結(jié)構(gòu)、表達(dá)等分子生物學(xué)理論研究，為對(duì)蝦基因的功能鑒定提供一條更為有效的途徑。
因此對(duì)蝦的轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究具有重要的理論意義和應(yīng)用潛力，是當(dāng)今海洋生物技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一。
對(duì)蝦生產(chǎn)對(duì)于解決高品質(zhì)蛋白質(zhì)問(wèn)題具有十分重要的意義。近十幾年來(lái)，病害暴發(fā)以及品質(zhì)下降等問(wèn)題，嚴(yán)重制約了對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。培育和利用抗病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)品種是解決上述問(wèn)題經(jīng)濟(jì)而有效的方法。由于馴化程度低，品種選育周期較長(zhǎng)，抗性親本缺乏等原因，通過(guò)常規(guī)育種手段獲得優(yōu)質(zhì)抗病對(duì)蝦品種相當(dāng)困難。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以向?qū)ξr中導(dǎo)入與產(chǎn)量和抗性相關(guān)基因或其基因庫(kù)中不具有的基因，實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)育種方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)的基因重組，快速培育高產(chǎn)抗病的對(duì)蝦新品種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克隆中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子和構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的目的是要建立和完善對(duì)蝦的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，實(shí)現(xiàn)外源基因在對(duì)蝦細(xì)胞中的高效表達(dá)。
本發(fā)明利用染色體步移(genome walking)技術(shù)、基因克隆技術(shù)、DNA測(cè)序技術(shù)克隆了中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子；在此基礎(chǔ)上利用載體構(gòu)建技術(shù)將所克隆的啟動(dòng)子與攜帶加強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced GreenFluorescent Protein，EGFP)的質(zhì)粒結(jié)合，構(gòu)建了攜帶中國(guó)對(duì)蝦自源啟動(dòng)子和EGFP報(bào)告基因的表達(dá)載體，為轉(zhuǎn)基因?qū)ξr的應(yīng)用以及海洋生物基因工程發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)保障。
本發(fā)明從中國(guó)對(duì)蝦基因組中克隆到了一段動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子序列，具有序列表中SEQ ID NO.1堿基序列；SEQ ID NO.1的信息(a)序列特征*長(zhǎng)度440堿基對(duì)*類(lèi)型核苷酸*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(b)分子類(lèi)型DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來(lái)源中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)(f)序列描述SEQ ID NO.11 TAGAGTAACACAGATCCTAAGCCACGCATTCACTAATATAATCAGTACTGTTGCCATTGC 6061 AATACTTTACGTTATTGTTATAACAGTTATCCTTAGCGTGGCTTAGGTTCTGTGTTACTC 120121 TAGTTATCCATAGAAAATAGGTATGAAGGGGAATTTGTTTATAGTTTTTATGCTGTTGTC 180181 GTTTTTATCGAAGTGTACGAATAAAGGATGGAACTCATCATAGAAGCTTGTTGTTGATAT 240241 TACCATTACCATTTCCATTTCCATTACTATCAATTTCCATTATCATCATTGTCAACCTTC 300301 TCTCAGTAAGTCTTCAGTCATCATAATCATGTTATTAGTTATCGTTAGAAGTGATATACA 360361 TGTTTGCTGAAAAAAAATCTTCATTTTCTAGTTTTGACAACATCCACCATGTGTGACGAC 420421 GACACCACTGCGCTTGTCTG 440本發(fā)明構(gòu)建中國(guó)對(duì)蝦轉(zhuǎn)EGFP基因表達(dá)載體的步驟包括(1)從中國(guó)對(duì)蝦的肌肉中提取基因組DNA；(2)限制性?xún)?nèi)切酶消化DNA和構(gòu)建以pGEM-3zf(+)為載體的基因組文庫(kù)；(3)在分析中國(guó)對(duì)蝦EST數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)4條反向引物，以染色體步移技術(shù)擴(kuò)增中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子；反向引物ap15′-agg tct cga aca tga tct g-3′反向引物ap25′-gga tct tca tca ggt agt c-3′
反向引物ap35′-gca cag ctt ctc ctt gat-3′反向引物ap45′-tcc acc ttc cag cag atg-3′正向引物使用分別位于質(zhì)粒pGEM-3zf(+)多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)上的啟動(dòng)子引物T7和Sp6T7Promotor Primer5′-taa tac gac tca cta tag gg-3′Sp6Promotor Primer5′-aat tta ggt gac act ata g-3′(4)克隆中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子到pDM18-T測(cè)序載體上；(5)測(cè)序分析確定肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子；(6)將測(cè)序載體上的中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子用限制酶雙酶切，回收；(7)將該片段與經(jīng)同樣雙酶切的pEGFP-1連接；(8)轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株，卡那霉素篩選重組子；(9)經(jīng)PCR擴(kuò)增和酶切驗(yàn)證，該載體命名為pACT1-EGFP。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明獲得中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子，其采用染色體步移(genome walking)技術(shù)加以改進(jìn)，可以得到較好的結(jié)果。
2.本發(fā)明將中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子用于轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建的優(yōu)勢(shì)在于1)由于對(duì)蝦類(lèi)的肌肉非常發(fā)達(dá)，占體重的70-80％；而肌動(dòng)蛋白是肌肉主要成分，其基因啟動(dòng)子必定為一個(gè)高效表達(dá)的調(diào)控元件；用肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體，所攜帶的外源基因表達(dá)效率很可能會(huì)大大提高。
2)在對(duì)蝦轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中使用對(duì)蝦自身啟動(dòng)子，不會(huì)帶入病毒等其他生物的核酸序列，具有更高的生物安全性，有利于將來(lái)轉(zhuǎn)基因?qū)ξr進(jìn)入市場(chǎng)。
3使用用EGFP基因?yàn)閳?bào)告基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體的優(yōu)點(diǎn)在于EGFP是加強(qiáng)型綠色熒光蛋白，容易觀察和檢測(cè)，能極大地提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的篩選效率，有利于對(duì)蝦轉(zhuǎn)基因技術(shù)的建立。


圖1為中國(guó)對(duì)蝦轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pACT1-EGFP構(gòu)建示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.一種中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子(特征關(guān)鍵詞名稱(chēng)Promoter)，具有如下序列(g)序列特征*長(zhǎng)度440堿基對(duì)*類(lèi)型核苷酸*鏈型單鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(h)分子類(lèi)型DNA(i)假設(shè)否(j)反義否(k)最初來(lái)源中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)
1 TAGAGTAACACAGATCCTAAGCCACGCATTCACTAATATAATCAGTACTGTTGCCATTGC 6061 AATACTTTACGTTATTGTTATAACAGTTATCCTTAGCGTGGCTTAGGTTCTGTGTTACTC 120121 TAGTTATCCATAGAAAATAGGTATGAAGGGGAATTTGTTTATAGTTTTTATGCTGTTGTC 180181 GTTTTTATCGAAGTGTACGAATAAAGGATGGAACTCATCATAGAAGCTTGTTGTTGATAT 240241 TACCATTACCATTTCCATTTCCATTACTATCAATTTCCATTATCATCATTGTCAACCTTC 300301 TCTCAGTAAGTCTTCAGTCATCATAATCATGTTATTAGTTATCGTTAGAAGTGATATACA 360361 TGTTTGCTGAAAAAAAATCTTCATTTTCTAGTTTTGACAACATCCACCATGTGTGACGAC 420421 GACACCACTGCGCTTGTCTG 440具體操作條件如下1.中國(guó)對(duì)蝦基因組DNA提取(1)剪取中國(guó)對(duì)蝦腹部肌肉約100mg，切碎，加入到1.5ml離心管中，每只離心管中加入500μl裂解液，裂解液組成如下(0.5M EDTA100μl，1MTris(PH8.0)5μl，10％ SDS 25μl，H2O 370μl)；(2)每只離心管中加入蛋白酶K(20mg/ml)2.5μl；(3)將上述樣品于55℃水浴3h；(4)將溶液冷至室溫，加入等體積的飽和酚，緩慢地來(lái)回顛倒離心管10min，以小心地混合兩相。4℃12000g離心15min；(5)離心后取上清液，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，小心地混合兩相，4℃12000g離心15min；(6)取上清液，加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，小心地混合兩相，4℃12000g離心15min；(7)上清液加入等體積冷異丙醇，冰凍1h以上，4℃12000g離心15min；(8)沉淀用70％乙醇清洗2遍，每次12000g離心10min；(9)涼干沉淀，用50μlTE(0.1mol/L Tris-HCl，0.05mol/L EDTA，pH＝8.0)溶解，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 2.限制性?xún)?nèi)切酶消化DNA和構(gòu)建以pGEM-3zf(+)為載體的基因組文庫(kù)用EcoRI酶切中國(guó)對(duì)蝦基因組DNA和pGEM-3zf(+)質(zhì)粒(購(gòu)自Promega公司)，按TAKARA公司的使用說(shuō)明進(jìn)行。反應(yīng)條件如下


兩個(gè)反應(yīng)都在37℃溫度下進(jìn)行3h。以1.0％瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物，在紫外燈下切下觀察酶切效果。確認(rèn)兩種DNA被完全酶切后，向反應(yīng)產(chǎn)物中加入1/10體積的醋酸鈉溶液(3mol/L，pH＝5.2)和2倍體積的無(wú)水乙醇，置于-20℃冰箱中1小時(shí)沉淀DNA，12000rpm離心10分鐘，傾去液體，加70％乙醇洗滌沉淀兩次，晾干沉淀，適量超純水溶解DNA，-20℃?zhèn)溆谩?br> 酶切后的pGEM-3zf(+)質(zhì)粒用堿性磷酸酶CIAP(購(gòu)自TAKARA公司)37℃處理30min，反應(yīng)條件如下

對(duì)蝦DNA與pGEM-3zf(+)載體的連接反應(yīng)按TAKARA公司的T4連接酶(T4Ligase)使用說(shuō)明進(jìn)行，采用20μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件如下

其中載體和小片段基因組DNA的比例大約為1∶3(摩爾比)，連接反應(yīng)于16℃進(jìn)行，過(guò)夜。
3.設(shè)計(jì)引物，以染色體步移技術(shù)括增中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子(1)在中國(guó)對(duì)蝦EST數(shù)據(jù)庫(kù)中找到25個(gè)肌動(dòng)蛋白的EST，在對(duì)其序列分析的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)4條反向引物反向引物ap15′-agg tct cga aca tga tct g-3′反向引物ap25′-gga tct tca tca ggt agt c-3′反向引物ap35′-gca cag ctt ctc ctt gat-3′反向引物ap45′-tcc acc ttc cag cag atg-3′正向引物使用分別位于質(zhì)粒pGEM-3zf(+)多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)上的啟動(dòng)子引物T7和Sp6。引物均購(gòu)自Sangon公司T7Promotor Primer5′-taa tac gac tca cta tag gg-3′Sp6Promotor Primer5′-aat tta ggt gac act ata g-3′用上述引物正反向組合，以連接產(chǎn)物(文庫(kù))為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，反應(yīng)體系如下模板(連接產(chǎn)物) 1μl正相引物(10pmol/μl) 1μl反向引物(10pmol/μl) 1μl10xTaq DNA聚合酶緩沖液 2μl
MgCl2(2.5μmol/L) 1.6μl脫氧核苷酸混合物dNTP(10mmol/L) 0.4μlTaq DNA聚合酶0.2μl滅菌水 12.8μl總體積 20μlPCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)入下列循環(huán)94℃ 40s，60.1℃ 60s，72℃ 90s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
4.克隆中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子到pDM18-T載體上取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行制備電泳，用Millipore公司的膠純化試劑盒DNAGel Extraction Kit進(jìn)行DNA回收，再與pDM18-T載體(購(gòu)自TAKARA公司，按照其使用說(shuō)明操作)連接，轉(zhuǎn)化，所用空白菌株為E.coli DH5α(購(gòu)自Promega公司)。轉(zhuǎn)化步驟按照《分子克隆》(薩姆布魯克J，弗里奇EF等，金冬雁，黎孟楓等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版).1996，北京科學(xué)出版社，55-56)進(jìn)行，首先涂布含有X-gal和IPTG的青霉素(60ng/ml)平板，37℃培養(yǎng)16h，平板上出現(xiàn)蘭色和白色菌落，根據(jù)白蘭斑比例判斷連接效率高低，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取單克隆白斑擴(kuò)增培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，用對(duì)應(yīng)的正反向引物做PCR檢測(cè)，確認(rèn)插入片段大小后進(jìn)行測(cè)序。
5.測(cè)序分析確定肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子采用ABI PRISMTM310 Genetic Analyzer進(jìn)行測(cè)序，反應(yīng)試劑為PERKIN ELMER公司的ABI PRISMRBigDyeTMTerminator Cycle測(cè)序試劑盒。序列測(cè)定后，通過(guò)網(wǎng)上相似性和同源性檢索，其一端300bp序列與斑節(jié)對(duì)蝦、凡那濱對(duì)蝦、果蠅等的肌動(dòng)蛋白基因5’端部分核酸相似性分別為87.2％、87.2％、88.6％，提示該基因?qū)儆诩?dòng)蛋白基因啟動(dòng)子。
實(shí)施例2中國(guó)對(duì)蝦轉(zhuǎn)EGFP基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法1.中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子的雙酶切將重組中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子的質(zhì)粒pDM18-T-ACT1用限制酶PstI、BamHI(購(gòu)自TAKARA公司)消化，37℃處理2h，反應(yīng)條件如下

以1.0％瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物，在紫外燈下切下約500bp的酶切片段，用Millipore公司的膠純化試劑盒DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行DNA回收，-20℃?zhèn)溆?。該片段包括中?guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子和pDM18-T質(zhì)粒兩側(cè)的多克隆位點(diǎn)。
2.將中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子片段與經(jīng)同樣雙酶切的pEGFP-1連接質(zhì)粒pEGFP-1(購(gòu)自BD Clontech公司)具有的編碼加強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)序列，提取pEGFP-1質(zhì)粒DNA，同樣用限制酶Pst I、BamHI消化，操作步驟如上。將其與經(jīng)同樣酶切的包括中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子的片段連接。反應(yīng)條件如下

反應(yīng)于16℃進(jìn)行，過(guò)夜(載體構(gòu)建的流程如附圖1所示)。
3.轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株，卡那霉素篩選重組子；轉(zhuǎn)化步驟按照《分子克隆》進(jìn)行，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布含有X-gal和IPTG的卡那霉素(50ng/ml)平板上，37℃培養(yǎng)16h，平板上出現(xiàn)蘭色和白色菌落，根據(jù)白蘭斑比例判斷連接效率高低，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取單克隆白斑擴(kuò)增培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒DNA。
4.對(duì)質(zhì)粒DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增和酶切驗(yàn)證。
設(shè)計(jì)中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子上的引物Acta15’-cac gca ttc actaat ata atc ag-3’和EGFP基因上的引物egfp25’-cat ggt cct gct gga gtt cgtg-3’，對(duì)所獲得的重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 90s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。通過(guò)電泳檢測(cè)，比較擴(kuò)增片段的大小，驗(yàn)證是否插入和插入方向。
同時(shí)利用啟動(dòng)子前端的pstI位點(diǎn)和EGFP后的NotI位點(diǎn)，用這兩種限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切，37℃處理2h，反應(yīng)條件如下

電泳結(jié)果與預(yù)期一致，插入方向正確，該質(zhì)粒命名為pACT1-EGFP。
中國(guó)對(duì)蝦SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)科學(xué)院海洋研究所<120>中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子及其克隆和應(yīng)用<130>
<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>440<212>DNA<213>中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)<220>
<221>promoter<222>(1)..(440)<223>
<40O>1tagagtaaca cagatcctaa gccacgcatt cactaatata atcagtactg ttgccattgc60aatactttac gttattgtta taacagttat ccttagcgtg gcttaggttc tgtgttactc 120tagttatcca tagaaaatag gtatgaaggg gaatttgttt atagttttta tgctgttgtc 180gtttttatcg aagtgtacga ataaaggatg gaactcatca tagaagcttg ttgttgatat 240taccattacc atttccattt ccattactat caatttccat tatcatcatt gtcaaccttc 300tctcagtaag tcttcagtca tcataatcat gttattagtt atcgttagaa gtgatataca 360tgtttgctga aaaaaaatct tcattttcta gttttgacaa catccaccat gtgtgacgac 420gacaccactg cgcttgtctg 440
權(quán)利要求
1.一種中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子，其特征在于具有序列表中SEQID NO.1堿基序列。
2.一種權(quán)利要求1所述中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子的克隆方法，其特征在于(1)從中國(guó)對(duì)蝦的肌肉中提取基因組DNA；(2)限制性?xún)?nèi)切酶消化DNA，構(gòu)建以pGEM-3zf(+)為載體的基因組文庫(kù)；(3)在分析中國(guó)對(duì)蝦EST數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)4條反向引物，反向引物ap15′-agg tct cga aca tga tct g-3′反向引物ap25′-gga tct tca tca ggt agt c-3′反向引物ap35′-gca cag ctt ctc ctt gat-3′反向引物ap45′-tcc acc ttc cag cag atg-3′正向引物使用分別位于質(zhì)粒pGEM-3zf(+)多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)上的啟動(dòng)子引物T7和SP6T7 Promotor Primer5′-taa tac gac tca cta tag gg-3′Sp6 Promotor Primer5′-aat tta ggt gac act ata g-3′以染色體步移技術(shù)擴(kuò)增中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子。
3.一種權(quán)利要求1所述中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子的應(yīng)用，其特征在于，將中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子用于構(gòu)建中國(guó)對(duì)蝦轉(zhuǎn)基因載體，步驟如下(1)克隆中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子到pDM18-T測(cè)序載體上；(2)將重組中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子用限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切，回收；(3)將該片段與經(jīng)同樣雙酶切的pEGFP-1連接；(4)轉(zhuǎn)化菌株，篩選重組子；(5)經(jīng)PCR擴(kuò)增和酶切驗(yàn)證，該載體命名為pACT1-EGFP。
全文摘要
本發(fā)明涉及中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因的調(diào)控序列，具體地說(shuō)是中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子及其克隆和應(yīng)用；采用染色體步移、基因克隆、DNA測(cè)序等技術(shù)得到中國(guó)對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子，具有序列表中SEQ ID NO.1堿基序列；在此基礎(chǔ)上用所克隆的啟動(dòng)子與攜帶加強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的質(zhì)粒結(jié)合，構(gòu)建了中國(guó)對(duì)蝦自源啟動(dòng)子的EGFP基因表達(dá)載體。該技術(shù)可以提高對(duì)蝦轉(zhuǎn)基因效率和生物安全性，為轉(zhuǎn)基因技術(shù)在對(duì)蝦中的應(yīng)用以及海洋生物基因工程發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1740318SQ200410050328
公開(kāi)日2006年3月1日 申請(qǐng)日期2004年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月27日
發(fā)明者相建海, 張曉軍, 李富花 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所