專利名稱：一種改良棒酸生產(chǎn)菌的新方法及高產(chǎn)棒酸生產(chǎn)菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供了一種提高棒酸生產(chǎn)菌生產(chǎn)棒酸能力的新方法和獲得的高產(chǎn)棒酸生產(chǎn)菌。本發(fā)明是利用途徑工程的方法，通過中斷或者敲除頭霉素C代謝途徑中的lat基因，或者切除棒酸合成途徑的分支途徑的相關cvm基因簇，或者增加棒酸合成的正調控基因CcaR、ClaR和棒酸合成途徑中的關鍵酶基因Cas2拷貝數(shù)，從而使菌株不含有完整的頭霉素C的代謝途徑，或不合成或者合成很少種類的棒烷酸類代謝物，或調控蛋白和棒酸合成代謝中的重要酶能夠大量產(chǎn)生，從而提高棒酸菌株的產(chǎn)量，獲取高產(chǎn)棒酸生產(chǎn)菌株。
背景技術：
目前，細菌對廣泛使用抗生素的耐藥性已成為臨床治療的一大威脅。耐藥機制之一是細菌產(chǎn)生的β-內酰胺酶破壞β-內酰胺類抗生素的β-內酰胺環(huán)而使其失活。棒酸最早是由葛蘭素史克公司研究開發(fā)，是一種超廣譜β-內酰胺酶抑制劑，它可與β-內酰胺酶不可逆結合，從而保護抗生素活性。它的使用主要是和阿莫西林等抗生素復配使用。到目前為止，它仍為一種重要的臨床抗感染藥。我國使用的棒酸原料都由國外進口，其無法生產(chǎn)的主要原因是菌種產(chǎn)量較低。
使生物具有所期望的遺傳特性是人類一直在努力的工作。菌種選育主要是利用傳統(tǒng)的紫外誘變和化學誘變方法，這種方法耗時長，隨機性大，工作繁重。而且很多的具有遺傳和代謝優(yōu)勢的生物突變種群仍然由于突變的隨機性而難以鑒定和分離。
隨著分子生物學、遺傳學、基因工程技術以及代謝工程等多學科的發(fā)展及交互滲透，第三代基因工程技術“途徑工程”應運而生。途徑工程是利用分子生物學原理系統(tǒng)分析細胞代謝網(wǎng)絡，并通過DNA重組技術合理設計細胞代謝途徑及遺傳修飾，進而完成細胞特性改造的應用性新學科或新技術。它針對細胞代謝途徑各所屬反應在基因水平上的表達與調控性質，利用DNA重組技術擴增、刪除、植入、轉移和調控編碼途徑相關基因，進而篩選出優(yōu)良遺傳特性的工程菌。這種選育高產(chǎn)菌種的方法針對性強，省時省力，但對菌株的背景研究基礎有一定的要求。
在本研究中所選用的棒酸生產(chǎn)菌就是一種遺傳背景清楚的菌株。棒酸的代謝途徑、競爭性代謝途徑、相關的結構基因和調控基因及其調控模式都很清楚。因此，利用途徑工程對其進行定向改造，篩選高產(chǎn)生產(chǎn)菌是非常可行且有前途的。利用途徑工程選育高產(chǎn)菌，具有巨大的應用前景。在國外已經(jīng)有成功的范例，而在我國尚屬于起步階段。此技術的突破，將會極大推動我國傳統(tǒng)藥業(yè)的發(fā)展，并帶來巨大的經(jīng)濟利潤。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種提高棒酸生產(chǎn)菌生產(chǎn)棒酸能力的新方法和獲得的高產(chǎn)棒酸生產(chǎn)菌。本發(fā)明是利用途徑工程的方法，通過中斷或者敲除頭霉素C代謝途徑中的lat基因，或者切除棒酸合成途徑的分支途徑的相關cvm基因簇，同時增加棒酸合成的正調控基因CcaR、ClaR和棒酸合成途徑中的關鍵酶基因Cas2拷貝數(shù)，從而使菌株不含有完整的頭霉素C的代謝途徑，或不合成或者合成很少種類的棒烷酸類代謝物，或調控蛋白和棒酸合成代謝中的重要酶能夠大量產(chǎn)生，從而提高棒酸菌株的產(chǎn)量，獲取高產(chǎn)棒酸生產(chǎn)菌株。
本發(fā)明利用途徑工程技術來改造棒酸生產(chǎn)菌的方法，不僅在菌種改造中是一項新的技術，而且有非常重要的商業(yè)化利用價值。棒酸生產(chǎn)菌的改造和利用一直以來是我國發(fā)展支持的重點，曾經(jīng)被列為國家“七五”和“八五”重點項目。但對于棒酸生產(chǎn)菌的改造技術一直都局限于紫外誘變和化學誘變等傳統(tǒng)技術。這種傳統(tǒng)的誘變方法具有突變方向的不定向性，從而造成工作耗時長，隨機性大，任務繁重。而且很多的具有遺傳和代謝優(yōu)勢的生物突變種群仍然由于突變的隨機性而難以鑒定和分離。利用途徑工程技術來改造棒酸生產(chǎn)菌的方法具有突變的定向性，從而減少了工作量，可省時省力地達到改造菌株的目的，獲取目的高產(chǎn)的棒酸生產(chǎn)菌。
本發(fā)明在已有的棒酸菌株的研究背景的基礎上，利用途徑工程技術改造棒酸生產(chǎn)菌。途徑工程是利用分子生物學原理系統(tǒng)分析細胞代謝網(wǎng)絡，并通過DNA重組技術合理設計細胞代謝途徑及遺傳修飾，進而完成細胞特性改造的應用性新學科或新技術。它針對細胞代謝途徑各所屬反應在基因水平上的表達與調控性質，利用DNA重組技術擴增、刪除、植入、轉移和調控編碼途徑相關基因，進而篩選出優(yōu)良遺傳特性的工程菌。
本發(fā)明通過基因插入或者敲除的方法中斷頭霉素C代謝途徑中的lat基因，使賴氨酸氨酰基轉移酶不能表達，從而不能催化頭霉素C的前體物質賴氨酸向下轉化，阻斷了頭霉素C的代謝合成，解除了頭霉素C代謝途徑對棒酸生產(chǎn)的競爭作用。(頭霉素C代謝圖如附圖1所示)本發(fā)明通過基因插入或者敲除的方法中斷棒烷類代謝途徑中的cvm基因簇中的一個或者多個，從而不再產(chǎn)生2-羧基棒烷、2-羥甲基棒烷、2-甲酰甲氧基棒烷、羥乙基棒烷、丙氨酰棒烷等中的一個或多個，從而切除或減少棒烷酸代謝流向棒烷類物質，使大量的物質和能量都向棒酸生產(chǎn)積累。(棒酸和棒烷類物質的代謝圖如附圖2所示)。
本發(fā)明還涉及到棒酸生產(chǎn)菌中調控基因CcaR和ClaR的高表達。從棒酸生產(chǎn)菌基因組中釣取CcaR和ClaR基因，插入到穩(wěn)定的高拷貝質粒中，或者把CcaR和ClaR基因插入到帶有λ噬菌體接合點attB位點的載體中，通過原生質體轉化法進入棒酸生產(chǎn)菌，使調控基因高表達，從而促進棒酸的大量生產(chǎn)。(CcaR和ClaR調控基因所在基因簇的位置及調控機制見附圖3所示)。
本發(fā)明還包含棒酸生產(chǎn)代謝途徑中限速步驟酶Cas2的高表達。從棒酸生產(chǎn)菌基因組中釣取Cas2基因，插入到穩(wěn)定的高拷貝質粒中，或者把Cas2基因插入到帶有λ噬菌體接合點attB位點的載體中，通過原生質體轉化法進入棒酸生產(chǎn)菌，使調控基因高表達，從而促進棒酸的大量生產(chǎn)。
本發(fā)明首次把途徑工程技術應用于棒酸生產(chǎn)菌株的改造，具有非常重要的科學與應用價值。此技術使分子生物學、遺傳學、基因工程技術和代謝工程等多學科的發(fā)展交互滲透，通過運用分子生物學原理系統(tǒng)分析細胞代謝網(wǎng)絡，運用基因工程技術設計合理的細胞代謝途徑，針對細胞代謝途徑各所屬反應在基因水平上的表達與調控性質，利用DNA重組技術擴增、刪除、植入、轉移和調控編碼途徑相關基因，從而完成細胞特性的改造，提高菌株生產(chǎn)棒酸的能力。途徑工程為第三代基因工程，與第一和第二代基因工程相比，具有更為重要的科學與應用價值。最初的基因工程技術的開發(fā)和利用只是局限于在大腸桿菌、酵母菌以及哺乳動物細胞等生物體內表達特定的蛋白或者多肽，即比較簡單地表達外源基因產(chǎn)物，如人生長激素、人胰島素原、人組織血纖維蛋白溶酶原激活因子、一些毒素多肽等有應用價值的物質。在微生物和動植物細胞中表達外源基因的最大特點是外源基因的表達是獨立的，并沒有作用于或參與或者調節(jié)目的產(chǎn)物生物合成途徑或相關途徑。而第三代基因工程是一種多學科交叉技術，它可以利用重組DNA技術來改造目的產(chǎn)物生物合成途徑或者相關途徑，從而提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，最終獲得高產(chǎn)的工業(yè)生產(chǎn)菌株。
本發(fā)明之所以具有非常重要的工業(yè)應用價值，不僅是因為它可將最新的途徑工程技術應用于棒酸生產(chǎn)菌的改造來提高棒酸的產(chǎn)量，而且因為棒酸是解決臨床上細菌耐藥問題的最好的藥物。在我國，棒酸全部依靠進口，不能自己生產(chǎn)，這主要是因為生產(chǎn)菌種產(chǎn)棒酸的能力太低，無法和國外競爭。因此，本發(fā)明涉及改造棒酸生產(chǎn)菌的新方法。本發(fā)明提供的這種方法，可以中斷與棒酸合成途徑相關的競爭代謝途徑的一個或多個基因，可以增加棒酸合成的調控基因的拷貝數(shù)，同時可增加棒酸合成代謝途徑中限速步驟酶的基因拷貝數(shù)，從而使棒酸生物合成途徑得到更為有效的能量運轉。
本發(fā)明還提供了有關中斷棒酸基因所用的篩選標記、重組DNA克隆載體、以及利用途徑工程技術獲取的高產(chǎn)的棒酸生產(chǎn)菌。


附圖1為頭霉素C代謝途徑。
附圖2為棒酸和棒烷類物質的合成代謝途徑。
附圖3為CcaR和ClaR調控基因所在基因簇的位置及調控機制。
附圖4為重組載體的構建及其對S.clavuligerus菌株的lat基因的中斷。
附圖5為對篩選得到S.c XAL 863菌株進行PCR驗證，以原始菌株為對照菌株。以lat-up和lat-down為上下游引物，進行PCR擴增，原始菌株所擴增出的基因片斷大小約為1.8kb，S.cXAL 863擴增出的基因片斷大小約為3.7kb左右，這是由于在lat基因片斷中的KpnI酶切位點加入一個1.9kb的apr抗性基因的緣故。從右向左依次為1.Marker，2.原始菌株，3.發(fā)生雙交換菌株。
附圖6為Southern雜交分析lat:apr中斷菌株。1和2分別為S.clavuligerus和S.c XAL863的基因組DNA用BamHI消化，雜交帶大小由λDNA Marker確定(沒有給出)。
附圖7為S.clavuligerus野生菌和S.c XAL 863改造菌在不同培養(yǎng)時間合成棒酸能力的比較。1，2為S.clavuligerus野生菌；3，4為S.c XAL 863改造菌。
附圖8為Cvm1中斷流程圖。
附圖9為CcaR、ClaR調控基因和Cas2酶基因質粒構建圖。
附圖10為HPLC檢測改造后菌株S.c XAL 863-2發(fā)酵液中棒酸含量。
附圖11為HPLC檢測原始菌株發(fā)酵樣品中棒酸含量。
具體實施例方式
以下實施例將有助于本領域的普通技術人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實施例1PCR克隆lat基因相關片斷及中斷載體構建以S.clavuligerus的總DNA為模板，lat-up和lat-down為引物，擴增出lat基因相關片斷，然后用EcorI和BamHI雙酶切，并插入用同樣兩種酶切的PIJ2925質粒中，再從篩選到的陽性克隆中提取質粒PIJ2926，進行EcorI和BamHI雙酶切，電泳檢測其雙酶切產(chǎn)物片斷大小為所期望的1.8kb左右。用KpnI酶切質粒PHP45Ωaacc4，回收apr抗性基因片斷，然后插入到PIJ2926質粒中l(wèi)at片斷的KpnI位點，得到質粒PIJ2927，從篩選得到的陽性克隆中，提取質粒PIJ2927，檢測到的質粒大小與預期的大小相符，并用BglII酶切鑒定，得到一條3.7kb左右和2.7kb左右的條帶，與預期結果相一致。用BglII酶切質粒PIJ2927，回收3.7kb左右的基因片斷，插入到PSET151質粒的BamHI位點，得到構建好的中斷載體PXAL1，約為10kb左右(附圖4)?；蛘哌x取pHJL401，在EcoRI和Xbal位點插入帶有apr的lat片斷。
實施例2lat基因雙交換菌株篩選將質粒PXAL1轉化大腸桿菌ET12567(pUZ8002)，然后通過屬間親本接合轉移到原始出發(fā)菌株S.clavuligerus中，挑取接合子，轉接到含有20ul/ml的萘啶酮酸培養(yǎng)基上進行鏈霉菌接合子的純化。使純化后的接合子再在無抗生素MM培養(yǎng)基上進行松弛培養(yǎng)，促使中斷載體和原始菌株的基因組的同源區(qū)域發(fā)生交換，并促使未發(fā)生交換的外源質粒丟失。收集孢子，然后分別用apr和str抗生素篩選雙交換菌株。選擇合適濃度的孢子涂布在含有20ul/ml apr抗生素的YD培養(yǎng)基上，然后影印到含有str抗生素的培養(yǎng)基上，篩選到aprRtsrS菌株，即為基因發(fā)生雙交換的菌株。這是因為中斷載體PXAL1中的帶有apr抗性基因片斷的lat基因與原始出發(fā)菌的染色體同源區(qū)域發(fā)生同源雙交換的緣故(附圖4)。最后，篩選得到一株雙交換菌株S.c XAL 863。
實施例3lat雙交換菌株驗證1)對篩選得到S.c XAL 863菌株進行PCR驗證，以原始菌株為對照菌株。以lat-up和lat-down為上下游引物，進行PCR擴增，原始菌株所擴增出的基因片斷大小約為1.8kb，S.cXAL 863擴增出的基因片斷大小約為3.7kb左右(附圖5)，主要是在lat基因片斷中的KpnI酶切位點加入一個1.9kb的apr抗性基因的緣故。
2)按照文獻(K.Madduri et al，1989，299-302，Journal of Bacteriology)提供的方法檢測賴氨酸氨酰基轉移酶活性，發(fā)現(xiàn)原始野生菌株在發(fā)酵過程中有賴氨酸氨?；D移酶活性，而S.cXAL 863菌株則沒有檢測到此酶活性，表明lat基因被中斷。
3)Southern雜交驗證。用Southern雜交技術來驗證篩選得到的菌株S.c XAL 863是否發(fā)生基因置換。采用雙探針進行雜交，兩個探針的差別是一個不含有apr片斷，一個含有apr片斷。結果如附圖6所示。S.clavuligerus和S.c XAL 863的基因組經(jīng)BamHI酶切后，用雙探針雜交后，前者雜出一條約9kb的條帶，后者雜出約4.7kb和1.8kb的兩條帶，這與預期的的結果是相符的，表明S.c XAL 863為lat基因中斷菌株。
從以上三種方法，可以證實菌株為lat中斷菌株。
實施例4原始菌株和S.c XAL 863菌株的發(fā)酵試驗對篩選到的雙交換菌株S.c XAL 863進行發(fā)酵研究，探討菌株合成棒酸的能力。選用大豆培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，以原始菌株S clavuligerus為對照菌株，于28℃，200rpm培養(yǎng)，分別在不同的時間取樣，檢測棒酸含量。接種量為5％，搖瓶裝液量為1∶10。每組試驗分別有兩個平行樣。
從附圖7圖中可見到，改造后的菌株S.c XAL 863與原始菌株S.clavuligerus相比，其產(chǎn)量大幅度提高，在54h，棒酸含量提高了3.6倍，66h提高了2.1倍，72h提高了1.8倍。表明在改造后的菌株與原始菌株相比，其代謝途徑或者代謝途流中的物質含量已經(jīng)發(fā)生了變化。
實施例5PCR克隆cvm1、cvm2、cvm3、cvm4、cvm5基因相關片斷及中斷載體構建以S.clavuligerus的總基因組為模板，利用Pcr技術分別釣取cvm1、cvm2、cvm3、cvm4、cvm5基因，并分別連接到pBLKS的EcoRI和BamHI位點。然后分別在EoRV和BamHI位點酶切，連接到同樣酶切位點的pOJ466，分別得到質粒cvm1X、cvm2X、cvm3X、cvm4X、cvm5X，然后分別在不同的質粒cvm1X、cvm2X、cvm3X、cvm4X、cvm5X的不同酶切位點SalI、NocI、BsaBI位點插入抗性基因neo、hyg、str、tsr、kana。分別得到質粒cvm11X、cvm22X、cvm33X、cvm44X、cvm55X。
以S.clavuligerus的總基因組為模板，分別釣取cvm123(包括cvm1和cvm2和cvm3全長基因)以及cvm45(包括cvm4和cvm5全長基因)，分別連接到pBLKS質粒上，分別得到質粒pcvm123和pcvm45，用NocI和BsaBI酶切pcvm123質粒，電泳取較大的片斷，并在NocI和BsaBI位點插入neo抗性片斷，得到質粒pcvm123X。用NocI酶切質粒pcvm45，電泳回收較大的片斷，插入hyg抗性基因，得到質粒pcvm45X。(附圖8只列出cvm1中斷圖)實施例6cvm簇基因雙交換菌株篩選及驗證按照和實例2-4相似的方法，根據(jù)插入的不同抗性基因篩選雙交換菌株。并用檢測不同棒烷類的產(chǎn)量，來考察cvm簇基因的中斷情況。cvm簇中的一個或者多個被中斷的菌株，用HPLC檢測不到菌株產(chǎn)2-羧基棒烷、2-羥甲基棒烷、2-甲酰甲氧基棒烷、羥乙基棒烷、丙氨酰棒烷等中的一個或多個，而野生菌株仍然能夠檢測到棒烷類物質。
實施例7調控基因CcaR、ClaR、和限速步驟酶基因cas2載體構建以S.clavuligerus的總基因組為模板，利用Pcr技術釣取調控基因CcaR、ClaR和限速步驟酶基因Cas2，然后把三個基因都同時連接到pIg699質粒上(附圖9)?；蛘甙讶齻€基因連接到pSET152質粒上。
實施例8原生質體篩選轉化菌株在裝有不銹鋼彈簧的三角瓶中加入YEME+TSBY(1∶1)，并加入0.2％的甘氨酸，接種100ul的孢子懸液體，于30℃，200rpm培養(yǎng)36h-40h。然后收集菌絲體，并用10.3％的蔗糖溶液洗滌收集的菌絲體，共洗滌三次，并于3000rpm離心10min收集菌絲體。取菌絲體，加入溶菌酶的P buffer(Hooper，Practical Streptomyces Genetics)，在30℃水浴30-60min，至上清呈乳狀。用裝有脫脂棉的試管過濾，濾液轉入無菌的universal中，并于3000rpm離心7min，收集原生質體沉淀，此為黃色。輕柔打散原生質體，再用P buffer洗滌去除溶菌酶，同樣條件下離心，收集原生質體，去上清，用槍打散原生質體，分裝，于-70℃保存。
取5ul的DNA，加入到50ul的原生質體管中，吸取200ul的25％的PEG4000，將DNA沖入原生質體中，小心抽吸幾次，混合均勻。然后將混合物涂布于R5平板(不含抗生素)，于30℃培養(yǎng)14-20h后，加入20ul/ml的抗生素(str)，再繼續(xù)培養(yǎng)，可看到較小的轉化子。此轉化子即為已經(jīng)轉入質粒的菌株。
實施例9按照例1-8的方法，獲得lat中斷、cvm1和cvm4、cvm5中斷，并有高拷貝CcaR、ClaR和Cas2基因的菌株。發(fā)酵研究表明，改造后菌株(S.c XAL 863-2)的棒酸產(chǎn)量(附圖10)比原始菌株產(chǎn)量(附圖11)提高了4倍。
權利要求
1.高產(chǎn)棒酸(clavulanic acid)生產(chǎn)菌株細胞，不含有完整的頭霉素C的代謝途徑，或不合成或者合成很少種類的棒烷酸類代謝物，同時調控蛋白和棒酸合成代謝中的重要酶能夠大量產(chǎn)生；即高產(chǎn)棒酸生產(chǎn)菌株細胞，是通過中斷或者敲除頭霉素C代謝途徑中的lat基因，或者切除棒酸合成途徑的分支途徑的相關cvm基因簇，或者增加棒酸合成的正調控基因CcaR、ClaR和棒酸合成途徑中的關鍵酶基因Cas2拷貝數(shù)，從而改變原始棒酸菌的能量代謝流向，使棒酸大量積累。
2.按照權利要求1的高產(chǎn)棒酸生產(chǎn)菌細胞，能夠產(chǎn)生高產(chǎn)量的棒酸。
3.按照權利1至2之一的高產(chǎn)棒酸生產(chǎn)菌的制備方法，包括a)中斷基因lat、cvm1、cvm2、cvm3、cvm4、cvm5中的一個或多個，連接到接合載體上。b)增加Cas2、CcaR、ClaR中一個或多個基因的拷貝數(shù)，連接到鏈霉菌-大腸桿菌穿梭載體上。c)按a)所獲得的載體，與被改造菌株進行接合培養(yǎng)，選取接合子d)按b)所獲得的載體，通過原生質體轉化進入被改造菌株，選取轉化子。
4.按照權利要求4的方法，其中中斷l(xiāng)at基因的抗性片斷為apr、hyg、neo、str、tsr中的一種。
5.按照權利要求4的方法，中斷cvml、cvm2、cvm3、cvm4、cvm5基因的抗性片斷為apr、hyg、neo、str、tsr中的一種或者多種。
6.按照權利要求4的方法，所選取的載體為pIg2925、pSET151、pOJ446、pHJL401。
7.按照權利要求2，高產(chǎn)棒酸生產(chǎn)菌的棒酸產(chǎn)量不低于2500ug/ml。
8.按照權利要求2，高產(chǎn)棒酸生產(chǎn)菌的棒酸產(chǎn)量不低于3500ug/ml。
9.按照權利要求2，高產(chǎn)棒酸生產(chǎn)菌的棒酸產(chǎn)量不低于5000ug/ml。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種提高棒酸生產(chǎn)菌生產(chǎn)棒酸能力的新方法和獲得的高產(chǎn)棒酸生產(chǎn)菌。本發(fā)明是利用途徑工程的方法，通過中斷或者敲除頭霉素C代謝途徑中的lat基因，或者切除棒酸合成途徑的分支途徑的相關cvm基因簇，同時增加棒酸合成的正調控基因CcaR、ClaR和棒酸合成途徑中的關鍵酶基因Cas2拷貝數(shù)，從而使菌株不含有完整的頭霉素C的代謝途徑，或不合成或者合成很少種類的棒烷酸類代謝物，使調控蛋白和棒酸合成代謝中的重要酶能夠大量產(chǎn)生，從而提高棒酸菌株的產(chǎn)量，獲取高產(chǎn)棒酸生產(chǎn)菌株。
文檔編號C12N15/70GK1587383SQ20041005103
公開日2005年3月2日 申請日期2004年8月10日 優(yōu)先權日2004年8月10日
發(fā)明者徐安龍, 王永華, 荊琛峰, 梁東 申請人:中山大學