專利名稱：一種具有轉(zhuǎn)化黃曲霉毒素活性的解毒酶及編碼該酶的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有轉(zhuǎn)化黃曲霉毒素活性的解毒酶及編碼該酶的基因。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)是一類毒性很強(qiáng)的真菌毒素，包括致毒基團(tuán)相同、結(jié)構(gòu)類似的黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)、黃曲霉毒素M1(Aflatoxin M1，AFM1)黃曲霉毒素G1(Aflatoxin G1，AFG1)等，它可以由有毒菌株黃曲霉和寄生曲霉，以及其他一些霉菌(如溫特曲霉)等所產(chǎn)生。黃曲霉毒素廣泛存在于谷物、飼料、食品中，對人類的主要危害是(1)污染了AFT的食品在食用前如果未能去除AFT，將使進(jìn)食者直接受害，或者，AFT通過污染的飼料經(jīng)食物鏈?zhǔn)惯M(jìn)食禽畜肉、奶制品等的人間接受害，直接或間接地引起急性中毒或誘發(fā)人類的癌癥；(2)禽畜攝入污染的飼料，輕則中毒，直接的后果是引起動物體重下降或引發(fā)其他疾病，間接的后果是通過食物鏈引起人類的慢性中毒，誘發(fā)癌癥，嚴(yán)重的引起死亡；(3)污染AFT的糧食谷物不能食用或者飼用，因而報(bào)廢。
由于黃曲霉毒素的危害性，AFT的解毒技術(shù)長期以來受到人們的重視，人們已經(jīng)知道了一些轉(zhuǎn)化AFT的方法，如(1)氨化法。該法用于含水飼料，因處理后食品中含大量的氨，美國FDA規(guī)定此法不能用于食品加工，也因飼料中含有大量的氨而影響了使用。(2)NaOH法(用于植物油粗煉去AFT)。因設(shè)備投資大、油耗大、成本高，現(xiàn)已逐漸被淘汰。(3)白土吸附法。因操作勞動強(qiáng)度大及白土塵埃和油耗以及對環(huán)境污染等問題，現(xiàn)已基本被淘汰。(4)混合溶劑萃取法，該方法用于如花生粉，棉籽等固態(tài)食品的AFT去除，但在萃取、溶劑回收和處理時花費(fèi)昂貴，無推廣應(yīng)用價值。(5)高溫法。該法是通過對被處理的樣品加熱到268℃以上來破壞AFT，因該法通常的加熱法較難達(dá)到此溫度，而過高溫度會破壞食品中的其他營養(yǎng)成分，故實(shí)際應(yīng)用很少。(6)生物學(xué)法。利用活菌或固定化菌分解AFT，因活菌會分解原料的營養(yǎng)而且對分解后的新產(chǎn)物不清楚，對新產(chǎn)物的毒性情況不了解，此方法只用于極少數(shù)的飼料和花生油的解毒。如1996年廣東微生物所報(bào)道用Aspergillusniger菌固態(tài)發(fā)酵后制備BDA生物制劑用于解毒。(7)紫外線照射法。利用紫外線的強(qiáng)氧化作用來破壞AFT，效果不穩(wěn)定，且能耗大。(8)超濾-滲濾法，這種方法只能用于非均相，對于均相、酸化牛奶無效，更因工藝要求苛刻，設(shè)備十分昂貴，至今無實(shí)際應(yīng)用價值。(9)生物酶法，有學(xué)者報(bào)道(Brown DW，etc.Proc.Natl.Acad.Sc.USA.1996)在大腸桿菌中克隆表達(dá)肝細(xì)胞色素氧化酶P450，以期通過增強(qiáng)黃曲霉毒素代謝的氧化酶用于對進(jìn)入體內(nèi)的被活化的AFT的轉(zhuǎn)化解毒，來達(dá)到降低進(jìn)入體內(nèi)的AFB1的目的。
上述處理方法中，由于使用物理化學(xué)的手段轉(zhuǎn)化AFT的方法通常比較強(qiáng)烈，經(jīng)處理后的谷物、飼料、食品等其利用價值大大降低，而且效率也相對較低，從成本方面考慮并不是工業(yè)應(yīng)用的理想方法，另外，體內(nèi)提高P450氧化酶的方法雖然能增強(qiáng)AFB1的代謝，但也增強(qiáng)了AFB1的對人的危險性。而生物酶催化方法，由于其具有專一性更強(qiáng)、轉(zhuǎn)化效率高的特點(diǎn)，人們正在進(jìn)行研究開發(fā)可以直接轉(zhuǎn)化AFT的生物酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有轉(zhuǎn)化黃曲霉毒素活性的解毒酶及編碼該酶的基因。
為了得到這種酶，發(fā)明人從篩選得到的一株產(chǎn)酶菌中純化出能轉(zhuǎn)化AFB1的生物酶，并在一種轉(zhuǎn)化體中借助重組DNA技術(shù)生產(chǎn)了具有轉(zhuǎn)化AFB1活性的蛋白。由此，發(fā)明人首先分離并純化出了具有該活性的新型蛋白，命名為黃曲霉毒素解毒酶(Aflatoxin-detofizyme，ADTZ)。
本發(fā)明通過純化和測序獲得黃曲霉毒素解毒酶(aflatoxin-detoxifizyme，ADTZ)的基因特異性引物，從假蜜環(huán)菌(Armillariella tabescens)的總RNA出發(fā)，克隆得到編碼ADTZ的基因，該基因是從未報(bào)道過的新基因；并利用基因工程的方法，在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并純化出重組ADTZ蛋白。所選擇的真菌是Armillariella tabescens，采自中國普通微生物菌種保蕆管理中心。
ADTZ的純化首先通過菌體破碎，硫酸銨沉淀法進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀，沉淀樣品通過快速蛋白質(zhì)液相色譜層析得到目的峰。ADTZ短肽N末端氨基酸序列的獲得將目的峰進(jìn)行質(zhì)譜分析獲得短肽N末端氨基酸序列。
本發(fā)明對假蜜環(huán)菌的總RNA的進(jìn)行提取。根據(jù)所獲得的短肽N末端氨基酸序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR和SMART RACE，得到ADTZ基因的序列長約2.3kb，經(jīng)分析序列含有完整的開放閱讀框，3’端和5’端的非翻譯區(qū)。編碼ADTZ成熟肽的全長cDNA 2088個核苷酸堿基，編碼695個氨基酸，分子量約為73～77kDa(SDS-PAGE電泳)，等電點(diǎn)pI在5.3～6.8之間(等電聚焦電泳)。氨基酸及DNA序列如序列表所示。其修飾產(chǎn)物，例如部分氨基酸發(fā)生去除、取代、修飾或加成后所產(chǎn)生的產(chǎn)物，也包括在本發(fā)明所述的蛋白范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一目的是提供包含所述基因的表達(dá)載體，以及用所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞所得的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種制備黃曲霉毒素解毒酶的方法，包括以下步驟培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體，回收所表達(dá)的黃曲霉毒素解毒酶。
本發(fā)明通過設(shè)計(jì)一對引物，將編碼ADTZ成熟肽的基因從假蜜環(huán)菌的cDNA中擴(kuò)增出來，克隆到真核整合型分泌表達(dá)載體，如pHIL-S1上，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pHIL-S1-ADTZ，并將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115。此表達(dá)載體以AOX為啟動子。通過對培養(yǎng)時間和誘導(dǎo)時間的摸索，ADTZ的表達(dá)量占培養(yǎng)基總蛋白的25％以上，并且處于可溶狀態(tài)。
本發(fā)明所用的真核表達(dá)載體還可選用胞內(nèi)型載體PAO815、PPIC3K、PPICZ、PHWO10、PGAPZ，或者分泌型載體PPIC9K、PPICZα、PGAPZα，或者市面上銷售的同類載體。所用的真核表達(dá)菌株也可以選用畢赤酵母菌KM71、MC100-3、SMD1168、SMD1165、SMD1163等作為宿主細(xì)胞。
本發(fā)明也可用原核表達(dá)體系來實(shí)現(xiàn)，選用表達(dá)載體pET、pUCH33等，或者市面上銷售的同類載體；選用原核表達(dá)菌株大腸桿菌BL21、大腸桿菌JM109等作為宿主細(xì)胞。
表達(dá)載體的復(fù)制方法參照Sambrook等的方法(Sambrook，et al.2002，Molecularcloning.Cold Spring Harbor Laboratory Press.USA)，按CaCl2法制備并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.Coli.DH5α，用含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌，堿法提取質(zhì)粒。
本發(fā)明還摸索了重組ADTZ的純化條件，發(fā)酵液經(jīng)硫酸氨沉淀后采用疏水色譜層析和金屬親和色譜層析兩步純化法得到重組ADTZ，重組蛋白純度達(dá)95％以上。
本發(fā)明的另一目的是提供將所述的具有轉(zhuǎn)化黃曲霉毒素活性的解毒酶在制備飼料或食品中黃曲霉毒素除毒產(chǎn)品的應(yīng)用。結(jié)合目前的飼料和食品的加工工藝，可將本發(fā)明所述的具有轉(zhuǎn)化黃曲霉毒素活性的解毒酶，作為脫毒劑添加到飼料中進(jìn)行飼料脫毒，或者制成固定化酶用于如花生油的脫毒。
本發(fā)明的另一目的是提供將所述的具有轉(zhuǎn)化黃曲霉毒素活性的解毒酶在制備預(yù)防和治療由黃曲霉毒素誘發(fā)的腫瘤的藥物的應(yīng)用。結(jié)合目前的抗腫瘤藥物的制備工藝，可添加本發(fā)明所述的具有轉(zhuǎn)化黃曲霉毒素活性的解毒酶，得到用于預(yù)防和治療由黃曲霉毒素誘發(fā)的腫瘤的藥物。
發(fā)明人首次分離和離析出了編碼該蛋白的基因。另外，發(fā)明人還將所述基因整合到一種表達(dá)載體中以產(chǎn)生一種轉(zhuǎn)化體，并且借助于該轉(zhuǎn)化體成功地實(shí)現(xiàn)了ADTZ蛋白的生產(chǎn)。通過活性鑒定實(shí)驗(yàn)，證明重組ADTZ具有與天然ADTZ相似的轉(zhuǎn)化AFB1的生物活性。通過重組ADTZ對AFB1解毒生物學(xué)活性的鑒定實(shí)驗(yàn)，證明重組ADTZ能降低AFB1的致畸變作用，具有抗AFB1引起突變的生物活性作用。本發(fā)明為今后在飼料加工、食品加工以及抗腫瘤藥物開發(fā)打下了良好的基礎(chǔ)。


圖1為純化的ADTZ PAGE電泳結(jié)果。M是標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；1、2是BSA(小牛血清白蛋白)；3是硫酸氨沉淀的粗酶組分；4是純化的ADTZ。
圖2為純化的ADTZ轉(zhuǎn)化AFB1作用的薄層色譜檢測結(jié)果。1是AFB1標(biāo)準(zhǔn)品；2、3是PBS緩沖液對照組；4是滅活A(yù)DTZ處理AFB1對照組；5ADTZ處理AFB1組；6是AFB1標(biāo)準(zhǔn)品。
圖3為假蜜環(huán)菌總RNA電泳結(jié)果。
圖4為RT-PCR產(chǎn)物電泳。M為DNA Marker；E1為RT-PCR產(chǎn)物。
圖5為重組載體pTE1的酶切鑒定。MDNA Marker；1為Pte1/HindIII+EcoRI2為pTE1/EcoRI；3為pTE1/HindIII。
圖6為3’RACE產(chǎn)物的電泳檢測。M為DNA Marker；E2為3’RANCE產(chǎn)物。
圖7為重組載體pTE2的酶切鑒定。M為DNA Marker；1為pTE2/HindIII+EcoRI；2為pTE2/EcoRI；3為pTE2/HindIII。
圖8為5’RACE產(chǎn)物的電泳檢測。M為DNA Marker；E3為5’RACE產(chǎn)物。
圖9為重組載體pTE3的酶切鑒定。M為DNA Marker；1為pTE3/HindIII+EcoRI；2為pTE3/EcoRI；3為pTE3/HindIII。
圖10為End to end PCR產(chǎn)物電泳檢測。M為DNA Marker；ADTZ’為PCR產(chǎn)物。
圖11為重組載體pSA的酶切鑒定。M為DNA Marker；1為pSA/BamHI+EcoRI；2為pSA/HindIII；3為pSA/SacI。
圖12為表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果。1為誘導(dǎo)96小時的陰性對照菌；2為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；3為BSA(小牛血清白蛋白)；4為誘導(dǎo)24小時的重組菌；5為誘導(dǎo)48小時的重組菌；6為誘導(dǎo)72小時的重組菌；7為誘導(dǎo)96小時的重組菌。
圖13為重組ADTZ轉(zhuǎn)化AFB1活性TLC檢測。1為AFB1標(biāo)準(zhǔn)品對照；2為重組ADTZ處理AFB1組樣品；3為滅活的重組ADTZ處理AFB1組照樣品。4緩沖液對照。
圖14為ADTZ重組子的構(gòu)建及其與畢赤酵母菌同源重組的流程圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一、ADTZ的獲得與純化一、菌體的發(fā)酵培養(yǎng)1、菌種Armillariella tabescens。
2、將上述菌種于液體培養(yǎng)基(馬鈴薯提取液1升、葡萄糖20.0克、KH2PO43.0克、MgSO4·7H2O 1.5克、維生素微量，pH6.6)中培養(yǎng)共25天，一級至三級分別培養(yǎng)6天、4天、4天，四級培養(yǎng)11天，培養(yǎng)溫度為24-28℃，收集菌體。
二、黃曲霉毒素解毒酶(ADTZ)的提取新鮮菌體液氮冰凍后敲成小塊，1∶1(W/V)加入磷酸鹽緩沖液，冰浴中勻漿，超聲破碎細(xì)胞，11000-12000g離心去沉淀物，以20-80％飽和的硫酸銨分級沉淀，取沉淀。以pH6.0，0.02mol/L磷酸緩沖液溶解懸浮，定蛋白(Bradford法)，用AFB1ELISA試劑盒檢測蛋白組分的酶活力，得含黃曲霉毒素解毒酶(ADTZ)酶液。
三、ADTZ的純化(一)酶樣品的準(zhǔn)備粗酶液用40倍體積的磷酸緩沖液(pH6.0，0.02mol/L)透析脫鹽，聚乙二醇-20000透析濃縮，0.45μm微膜過濾，定蛋白(Bradford法)。
(二)快速蛋白質(zhì)液相色譜(FPLC)純化酶根據(jù)文獻(xiàn)(Ion Exchange Chromatography principles and methods.Pharmacia Co.Edited，Pharmacia Co.，1984，pp.29～31；和Chromatofocusing with PolybufferTMand PBETM，6.Experimental.Pharmacia Co.Edited，Pharmacia Co.，1984，pp.11～24)報(bào)道方法選擇離子交換色譜和等電聚焦色譜柱填料及緩沖液，按操作要求離子交換色譜以及聚焦色譜均在FPLCSystem(Pharmacia Biotech Co.美國)上進(jìn)行。具體做法如下1.陰離子交換色譜(1)試劑pH6.0，0.2mol/L磷酸鹽儲存緩沖液。
A液pH6.0，0.02mol/L的磷酸緩沖液。
B液pH6.0，0.02mol/L+1N NaCl的磷酸緩沖液。
(2)柱子的準(zhǔn)備DEAE-Sephadex 50ml，以2倍體積磷酸鹽緩沖液充分?jǐn)嚢柘礈旌?，靜置20分鐘，以微型真空泵抽去上清，同樣操作，反復(fù)洗滌，再以同樣條件反復(fù)洗滌5次，以0.6ml/min的流速裝柱。柱規(guī)格20×30cm.
以A液平衡該柱至基線穩(wěn)定在零附近。酶樣品20ml(含蛋白2mg/ml)，上預(yù)柱，過DEAE-Sephadex離子交換柱。氯化鈉梯度洗脫以A液洗脫2小時，A液及0-80％的B液洗脫5小時，100％B液洗脫2小時。流速0.6ml/min。以分部收集器收集。紫外O.D.280nm監(jiān)測。聚乙二醇-20000透析濃縮，脫鹽后，定蛋白(Bradford法)，分別測定各蛋白組分轉(zhuǎn)化AFB1活性，收取活性組分。重復(fù)以上操作，收集活性組分。
2.聚焦層析(1)試劑洗脫液PolybufferTM74(Pharmacia Co.產(chǎn)品)，250ml裝。取100ml加純水稀釋至1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 起始緩沖液pH7.4，0.025mol/L咪唑-HCl緩沖液。
(2)柱子Mono-pTMPBE 94，5×20cm預(yù)裝柱(Pharmacia Co.產(chǎn)品)。
經(jīng)上述離子交換色譜純化后的酶液6mL(含蛋白3mg/mL)，以Polybuffer 74平衡該酶液(平衡后為6.5ml)。以起始緩沖液平衡Mono-p柱2小時，以Polybuffer 74洗脫液過柱，上2ml酶液樣品，以Polybuffer 74洗脫液洗脫10小時。流速0.2ml/min。紫外O.D.280nm監(jiān)測并記錄色譜圖，以分部收集器接收，設(shè)定2ml/管，即10分鐘/管。定蛋白(Bradford法)，分別測定各蛋白組分轉(zhuǎn)化AFB1活性。收集活性組分。
以0.1mol/L鹽酸洗柱子至AU值回零，再以1mol/L NaCl洗柱子至AU值回零，以起始緩沖液平衡柱子過夜。同上條件重復(fù)聚焦色譜操作，收集活性組分。
3、用ELISA法檢測活性組分將收集到的各組分分別處理AFB1，用ELISA檢測處理后樣品中AFB1的量，用100℃煮沸10分鐘的相同組分作對照，能使AFB1減少的組分為活性的組分。具體做法如下(1)樣品的制備滅活酶液組AFB1200ul(濃度2.5ng/ml甲醇)+滅活酶液200ul(1.2mg/ml)活性酶液組AFB1200ul(濃度2.5ng/ml甲醇)+活性酶液200ul(1.2mg/ml)質(zhì)控組AFB1200ul(濃度2.5ng/ml甲醇)+緩沖液200ul(1.2mg/ml)滅活酶液的制備組分在100℃煮沸10分鐘。
混勻，30℃反應(yīng)30min，100℃煮沸15min，3000g離心5min去沉淀，制備好樣品后按ELISA試劑盒(AgraQuantTM Total Aflatoxin Assay 4/40，ROMER公司產(chǎn)品，美國)操作說明書操作，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算處理后產(chǎn)物中含有的AFB1。檢測收集的各組分，能使樣品中AFB1減少的組分為有活性的組分。檢測結(jié)果有活性組分的活性酶液處理的樣品中AFB1為1.230±0.508ng/ml，有活性組分的滅活性酶液處理的樣品中AFB1為2.436±0.326ng/ml，質(zhì)控組為2.508±0.203ng/ml。
活性峰在非還原性條件下進(jìn)行電泳(PAGE)表明它為單一譜帶。結(jié)果如圖1。
所得蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分析分子量約為73～76kDa；等電聚焦電泳分析等電點(diǎn)pl約為5.3～6.8。
實(shí)施例二純化的ADTZ活性鑒定一、ADTZ轉(zhuǎn)化AFB1活性的鑒定依據(jù)中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院標(biāo)準(zhǔn)處(食品衛(wèi)生國家標(biāo)準(zhǔn)匯編 中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院標(biāo)準(zhǔn)處編，北京，中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1998年版，pp410～415)和翟永信(薄層色譜在食品分析中的應(yīng)用，翟永信、陸冰真編，北京大學(xué)出版社，1991年版，pp118～123)報(bào)道的方法，用薄層色譜法對由ADTZ處理的AFB1進(jìn)行檢測，鑒定純化到的ADTZ活性。具體做法如下1、實(shí)驗(yàn)組取1支1.5ml的離心管，加入1μL AFB1溶液(AFB1甲醇溶液0.5μg/μL，黃曲霉毒素B1，Alexis Biochemicals Inc.，Switzerland)，氮?dú)鈸]干。分別加入ADTZ酶液(蛋白含量0.1mg/mL)300μL、MgSO40.5μL、PEG200 10μL，充分混勻。30℃水浴，反應(yīng)1小時，以后每小時向各加入0.5μL AFB1溶液，直至管內(nèi)AFB1總量為2μg。加畢后，再繼續(xù)反應(yīng)2小時。
2、對照組取1支1.5ml的離心管，標(biāo)記對照組1加入1μL AFB1溶液，氮?dú)鈸]干，分別加入300μL酶液(預(yù)先以100℃水浴5分鐘滅活)、MgSO40.5μL、PEG200 10μL，充分混勻。另取1支1.5ml的離心管，標(biāo)記對照組2加入1μL AFB1溶液，氮?dú)鈸]干，分別加入PBS緩沖液(0.1M pH6.6)300μL、MgSO40.5μL、PEG200 10μL，充分混勻。后續(xù)操作與實(shí)驗(yàn)組相同。
以上實(shí)驗(yàn)組和對照組用反應(yīng)后，各加入2倍體積的氯仿進(jìn)行萃取2次，于45℃，氮?dú)庀聯(lián)]干萃取物，加入1ml的甲醇充分溶解萃取物，得實(shí)驗(yàn)組樣品(活性酶組)、對照組1(滅活酶組)和對照組2(緩沖液對照組)。
3、薄層色譜(TLC)檢測反應(yīng)產(chǎn)物取新活化(100℃ 2小時)的預(yù)制硅膠薄層板(10×10cm，60，Whatman，USA)，在薄層板上點(diǎn)樣點(diǎn)距邊緣1cm，點(diǎn)間距1cm。從左到右第1點(diǎn)10μL 25μg/ml的AFB1氯仿溶液；第2、3點(diǎn)各為10μL對照組2；第4點(diǎn)10μL 2號對照組1；第5點(diǎn)10μL實(shí)驗(yàn)組；第6點(diǎn)10μL 25μg/ml的AFB1氯仿溶液。
展開在展開槽內(nèi)加10ml無水乙醚展開，取出揮干。
觀察在365nm波長紫外光下觀察熒光，拍照，結(jié)果如圖2所示。
結(jié)果顯示AFB1標(biāo)準(zhǔn)品(1、6)以及酶的滅活對照(4)和PBS緩沖液對照(2、3)，乙醚展開時都只發(fā)生微小的遷移，而用ADTZ處理后的AFB1產(chǎn)物Rf值則接近1(＝0.95)，表明解毒處理后的AFB1其極性顯著減小，與AFB1明顯不同，說明純化得到的ADTZ具有轉(zhuǎn)化AFB1的活性。
二、ADTZ對AFB1解毒生物學(xué)活性的鑒定微生物回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)(Ames實(shí)驗(yàn))參照中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局頒布的方法[中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局編，新藥(西藥)臨床研究指導(dǎo)匯編(藥學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué))，1993年7月]進(jìn)行。具體做法如下1.測試菌株為組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌株TAg8(引自衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所)，-85℃(零下85℃)低溫冰箱保存，測試前對采用的菌株進(jìn)行基因型鑒定及自發(fā)回變數(shù)測定，生物學(xué)鑒定合格，符合實(shí)驗(yàn)要求。
2.肝S9的制備(1)SD大鼠誘導(dǎo)SD大鼠檢疫一周確定無病，用多氯聯(lián)苯混懸于玉米油，腹腔注射(500mg/kg體重)，5天后處死，處死前12小時禁食。
(2)S9組分的制備經(jīng)上述誘導(dǎo)的SD大鼠斷頭放血，無菌下取肝，稱重，肝臟用冷0.15mol/L(下同)KCl漂洗。以1g肝臟加3ml的比例在均漿器中均漿，每份組織的均漿時間保持一致。將均漿液在0℃，經(jīng)9000g離心20分鐘，取上清液，經(jīng)證明無菌后，存-85℃冰箱備用。
3.S9混合液的制備將下列A、B、C液和S9組分混合，保存4℃下4小時內(nèi)使用。
A液(0.2mol/L輔酶II，過濾滅菌)0.2ml。
B液(0.2mol/L 6-磷酸葡萄糖過濾滅菌)0.25ml。
C液8.55ml。
C液組成(0.4mol/L MgCl2，20ml 1.65mol/L KCl 20ml，0.2mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)500ml，蒸餾水315ml，混和后過濾滅菌)。
S9組分1.00ml。
4.受試樣品的制備在反應(yīng)體系為30ml的系統(tǒng)中，ADTZ濃度為0.2mg/ml，AFB1的濃度為0.2μg/ml，pH值6.0，于28℃下反應(yīng)120min，體系放大10倍。反應(yīng)后，以等體積氯仿萃取黃曲霉毒素B1后產(chǎn)物及未反應(yīng)的殘留底物3次，合并有機(jī)相，40℃減壓揮干氯仿，分別以3.75和3mlDMSO洗出提取物(活性酶處理反應(yīng)組)；以預(yù)先用氯仿滅活的ADTZ代替活性ADTZ，在同條件下處理黃曲霉毒素B1(滅活酶處理對照組)；以緩沖液代替活性ADTZ酶液，在同條件下處理黃曲霉毒素B1(緩沖液處理對照組)。以上樣品均在-15℃下保存?zhèn)溆谩?br> 5.回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)將受試樣品的DMSO溶液與培養(yǎng)過夜的菌液及S9一起加入上層軟瓊脂培養(yǎng)基中，混勻，在40℃下倒在底層Vogel選擇培養(yǎng)基上，待凝固后于37℃溫箱中培養(yǎng)72小時，計(jì)算每個培養(yǎng)皿出現(xiàn)的回復(fù)突變菌落數(shù)。
每批測試時每組提取液及陰陽性對照均設(shè)3個平皿，并重復(fù)1次，各組提取液結(jié)果為2次6組平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以回復(fù)菌落數(shù)、突變率(MR＝樣品回變菌落數(shù)/陰性對照回變菌落數(shù))和抑制率(％)[＝{1-(被試物回變菌落數(shù)-陰性對照組回變菌落數(shù))/(AFB1對照組回變菌落數(shù)-陰性對照組回變菌落數(shù))}×100％]表示。
6.結(jié)果評價標(biāo)準(zhǔn)若溶劑對照組在正常范圍內(nèi)，受檢物在3個濃度以上有陽性劑量反應(yīng)，最大增加值為溶劑對照值的兩倍(即MR≥2)，可考慮為致突變陽性。
7.結(jié)果活性ADTZ處理反應(yīng)組的細(xì)菌回復(fù)突變菌落數(shù)與陰性對照組(DMSO對照組)相近(MR值均小于2)。緩沖液處理對照組和滅活A(yù)DTZ處理對照組的細(xì)菌回復(fù)突變菌落數(shù)明顯高于陰性對照組(MR值均大于2)，與陽性對照(黃曲霉毒素B1對照)的細(xì)菌回復(fù)突變數(shù)無顯著性差異。表明活性ADTZ處理反應(yīng)組受試物無誘發(fā)基因突變作用。說明ADTZ具有抗AFB1引起突變的生物活性作用。結(jié)果如下表。
黃曲霉毒素B1經(jīng)酶處理后的細(xì)菌突變回復(fù)試驗(yàn)

上表說明誘變實(shí)驗(yàn)以含有大鼠肝S-9混合物的Salmonella typhimuriurmn TA98為供試菌進(jìn)行。用于誘變實(shí)驗(yàn)的AFB1對照組的濃度為0.8μg/50μl DMSO/平板。而AFB1酶處理后的樣品每板也以相當(dāng)于同樣量的AFB1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并保持同樣量的DMSO。平板培養(yǎng)28hr后，計(jì)數(shù)，結(jié)果以四個平板的平均值±SD表示。
實(shí)施例三 ADTZ短肽氨基酸序列的獲得收集實(shí)施例一純化所得的活性組分的峰尖，或?qū)⒒钚越M分用PAGE電泳收集目的帶，采用Q-TOF2(電噴霧—四極桿飛行時間—串聯(lián)質(zhì)譜)儀(英國Micromass公司，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院儀器測試分析中心提供)進(jìn)行ADTZ短肽N末端的氨基酸序列檢測。所測得的氨基酸序列如下M1EAWEGFTALVDK M2NKLLQDANGELENLYVR本發(fā)明的ADTZ短肽氨基酸序列不限于上述所列，它還包含其他短肽氨基酸順序片段，只要該片段是用MALDI-MS-TOF或其他化學(xué)方法等檢測ADTZ而獲得。
實(shí)施例四產(chǎn)酶菌總RNA的提取將產(chǎn)酶菌菌體組織放入預(yù)冷過的研缽中，加入液氮研磨，至樣品為粉末狀，取100mg左右樣品轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中，加入1ml的Trizol，振蕩混勻，室溫靜置5分鐘，加入200μl氯仿，振蕩混勻2分鐘，冰浴5分鐘，2-8℃，12000×g，離心15min，轉(zhuǎn)移上清至另一1.5ml離心管。加入500μl預(yù)冷的異丙醇，冰浴靜置20min，2-8℃，12000×g，離心10min，棄上清，加入1ml預(yù)冷的75％乙醇，洗滌沉淀及離心管壁，2-8℃，7500×g，離心5min，棄上清，空氣干燥5-10min，加入50μl DEPC無菌水，至完全溶解，進(jìn)行紫外分析及電泳檢測(1.1％Agarose/EB 100V 20min)，樣品保存于-80℃。結(jié)果如圖3所示，從電泳檢測結(jié)果中可看到28s rRNA和18s sRNA兩條特征譜帶條帶清晰，亮度比接近2∶1，說明總RNA沒有降解。
實(shí)施例五、ADTZ基因特異性引物的獲得從實(shí)施例三所得到的ADTZ短肽氨基酸序列設(shè)計(jì)2對引物(P1、P2和G1、G2)。參照QIAGEN OneStep RT-PCR Kit(QIAGEN Inc.美國)手冊進(jìn)行RT-PCR以獲得ADTZ基因部分序列的產(chǎn)物。切膠回收RT-PCR產(chǎn)物，并按常規(guī)方法進(jìn)行TA克隆，用HindIII和EcoRI酶切鑒定TA克隆的重組質(zhì)粒，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。將重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，得到ADTZ基因的cDNA片段E1。具體做法如下引物對1 引物對2P15’-TGGGARGGNTTYACNGC-3’G15’-CARGAYGCNAAYGGNGA-3’P25’-TCNCCRTTNGCRTCYTG-3’G25’-GCNGTRAANCCYTCCCA-3’本發(fā)明擴(kuò)增ADTZ基因特異性引物的引物對不限于以上的P1與P2，G1與G2，它還包含其他的引物對，只要該引物對是由上方法獲得的ADTZ短肽氨基酸序列所設(shè)計(jì)。
(一)RT-PCR的步驟
1、將模板總RNA(由實(shí)施例四獲得)于75℃變性5min，迅速插入冰中冷卻，2、準(zhǔn)備Master Mix(80μl總體系)42μl RNase-free Water16μl 5×QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer3.2μldNTP Mix (10mM)3.2μlQIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix64.4μl抽吸混勻，短暫離心；3、按照下表所示順序添加各組分至0.5ml無菌離心管中(單位μl)

4、PCR循環(huán)程序·Reverse transcription 50℃ 30min·Initial PCR activation step50℃ 15min·3-step cycling·15 cycles 94℃ 40sec65℃ 1min (-1℃/cycle)72℃ 1min·25 cycles 94℃ 40sec50℃ 1min72℃ 1min·Final extension70℃ 10min5、循環(huán)結(jié)束后取5μl樣品電泳檢測。
(二)切膠回收RT-PCR產(chǎn)物1.配制的TAE電泳緩沖液，并配制0.8％瓊脂糖凝膠；2.將50μl的RT-PCR產(chǎn)物與10×loading buffer按比例混合，上樣；3.100V，電泳20min；4.電泳結(jié)束后，在紫外燈下觀察條帶位置，切下目的帶，轉(zhuǎn)移至一個新的滅菌的1.5ml的離心管中；5.加入800μlBuffer NT1；6.漩渦振蕩NucleoTrap Suspension，使小珠完全懸浮后，取10μl加入離心管中；7.將離心管在50℃水浴6min，期間每隔2min短暫漩渦振蕩；8.室溫下，10000×g，離心30s，棄上清；9.加入500μl Buffer NT2，短暫漩渦振蕩，室溫下，10000×g，離心30s，棄上清。重復(fù)此步驟一次。
10.加入500μl Buffer NT3，短暫漩渦振蕩，室溫下，10000×g，離心30s，棄上清。重復(fù)此步驟一次。
11.再次10000×g，離心30s，棄上清，空氣中干燥10-15min；12.加入30μlTE Buffer(pH8.0)，重懸沉淀?；厥盏钠蚊麨椤癊1”。RT-PCR產(chǎn)物的電泳檢測。結(jié)果如圖4所示，顯示引物對P1和P2的反應(yīng)結(jié)果中獲得一個條帶，條帶位置約于800bp左右，命名為E1片段。
(三)TA克隆與測序1 連接在1.5ml新的滅菌的離心管中加入下列成份1μlpUCm-T載體3μlE1片斷(RT-PCR回收產(chǎn)物)1μl10×buffer1μlT4 DNA連接酶加4μl的無菌水補(bǔ)充總體積至10μl；抽吸混勻，短暫離心，22℃水浴4h以上。
2 CaCl2法制備E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞挑取DH5α單克隆于2mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。從活化的新鮮DH5α菌液中取50μl接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)1.5-2h，冰浴30min，將菌液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，5000rpm，離心5min，棄上清，取1.5ml冰浴的無菌CaCl2加入離心管，懸浮菌體，冰浴10min，5000rpm，離心5min，棄上清；加入200μl冰浴的無菌CaCl2加入離心管，懸浮菌體，保存于4℃下備用。
3 轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞取感受態(tài)細(xì)胞200μl加入含10μl連接物的離心管中，混勻，冰浴30min；42℃水浴90s；立即冰浴3-5min；加入800μl LB液體培養(yǎng)基，37℃溫育40-60min；將一轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含有Amp及IPTG/X-gal的LB固體培養(yǎng)基上，每個90mm平板涂布200μl，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h。
4 堿提質(zhì)粒DNA
挑取轉(zhuǎn)化的單菌落，接種到2ml的含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)過夜。取1.5ml菌液于微量離心管中，12000rpm離心2min，棄上清；取400μl STE溶液洗菌體，漩渦振蕩混勻，12000rpm離心2min，棄上清；加入100μl預(yù)冷溶液I于沉淀菌體中，劇烈振蕩混勻；加入200μl新鮮配制的溶液II，立即快速顛倒混勻，冰浴3min；加入150μl預(yù)冷溶液III，反復(fù)顛倒混勻，冰浴5min；12000rpm離心5min，上清移至另一管中；加入等體積酚仿，顛倒混勻，12000rpm離心5min；小心吸取上清轉(zhuǎn)移至另一管中；加入兩倍體積的預(yù)冷無水乙醇，顛倒混勻，室溫靜置40-60min；12000rpm離心10min，棄上清；加入200μl 70％乙醇，漂洗沉淀，12000rpm離心1min，棄上清；打開管蓋空氣中干燥5-10min，加入30μl無DNA酶的RNA酶的TE溶解沉淀，37℃溫育1h。貯存于-20℃。
5 酶切鑒定重組質(zhì)粒pTE1用HindIII和EcoRI酶切鑒定TA克隆的重組子，如下表(單位μl)

37℃酶切4h以上。1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，結(jié)果如圖5，重組載體pTE1的酶切鑒定，HindIII+EcoRI雙酶切(1號樣品)和HindIII單酶切(3號樣品)均切下400bp多的條帶，且前者的亮度比后者高，EcoRI單酶切將重組子切成線性(2號樣品)，表明E1片斷中央位置存在一個HindIII酶切位點(diǎn)。
6 測序重組質(zhì)粒PEG純化法(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring HarborLabroratory Press.USA)提取質(zhì)粒DNA。以T7和SP6為測序引物，采用ABI377 DNASequencer DNA自動序列儀(由上海博雅公司提供)，正反向進(jìn)行測定，得到E1片段核酸序列。測序結(jié)果序列包含引物P1和P2序列，在中間位置出有一個aagctt的HindIII酶切位點(diǎn)。
實(shí)施例六編碼ADTZ全長cDNA序列的獲得根據(jù)實(shí)施例五已獲得的ADTZ基因部分序列E1片段設(shè)計(jì)引物S1(5’-TAGGCGAAGTGTCGTCGTCAATGGAA-3’)、S3(5’-GAAGTTATCGGCTTTCCAGTCAGAGGGT-3’)分別作為3’RACE和5’RACE的引物，按SMARTTMRACE cDNA amplification Kit(COLONTECH Laboratories，Inc.Cat.No.K1811-2)手冊進(jìn)行3’RACE和5’RACE。切膠回收RACE產(chǎn)物，并按常規(guī)方法進(jìn)行TA克隆，用HindIII和EcoRI酶切鑒定TA克隆的重組子，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。將重組質(zhì)粒送交測序公司進(jìn)行測序，得到兩個片斷E2、E3，利用NCBI的VecScreen(BLASTN2.2.5)程序(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen.html)識別去除載體序列，用DNAMAN程序(美國Lynnon BioSoft公司的軟件)將E1、E2、E3拼接，將得到的序列用NCBI的ORF Finder程序(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)進(jìn)行開放閱讀框分析，得到了編碼ADTZ成熟肽的ADTZ基因的全長cDNA序列。具體如下引物S15’-TAGGCGAAGTGTCGTCGTCAATGGAA-3’引物S35’-GAAGTTATCGGCTTTCCAGTCAGAGGGT-3’一、3’RACE(一)3’RACE-Ready cDNA的制備1.將模板總RNA于75℃變性5min，迅速插入冰中冷卻；2.在一個0.5ml滅菌離心管中加入以下試劑1μl變性的模板總RNA1μl3’-CDS Primer A加3μl的無RNA酶的無菌水補(bǔ)充體積到5μl；3.抽吸混勻，并短暫離心使混合液位于管底；4.70℃，溫浴2min；5.冰浴2min，稍稍離心后加入下列試劑2μl 5×First-Strand Buffer1μl DTT(20mM)1μl dNTP Mix(10mM)1μl PowerScript Reverse Transcriptase10μl總體積6.輕輕抽吸混勻試劑并稍稍離心；7.溫箱中42℃溫浴1.5h；8.用100μlTricine-EDTA buffer稀釋產(chǎn)物；9.72℃溫育7min；10.樣品存于-20℃。
(二)3’RACE的步驟1.準(zhǔn)備Master Mix(100μl總體系)69μlPCR-Grade Water10μl10×Advantage 2 PCR Buffer2μl dNTP Mix(10mM)2μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix83μl
抽吸混勻，短暫離心；2.按照下表所示順序添加各組分至0.5ml無菌離心管中(單位μl)

3.PCR循環(huán)程序·5 cycles94℃ 5sec72℃ 3min·5 cycles94℃ 5sec70℃ 10sec72℃ 3min·35 cycles 94℃ 5sec68℃ 10sec72℃ 3min4.循環(huán)結(jié)束后取5μl樣品電泳檢測，結(jié)果如圖6所示，顯示3’RACE獲得一個一條帶的產(chǎn)物，產(chǎn)物帶位于分子量約800bp處，命名為E2片段。
(三)切膠回收3’RACE產(chǎn)物，TA克隆，CaCl2法制備E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，堿提質(zhì)粒DNA(實(shí)驗(yàn)操作同前面實(shí)施例五的內(nèi)容)。
(四)酶切鑒定重組質(zhì)粒pTE2用HindIII和EcoRI酶切鑒定TA克隆的重組子，如下表(單位μl)

37℃酶切4h以上。1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，結(jié)果如圖7所示，重組載體pTE2的酶切鑒定，HindIII+EcoRI雙酶切(1號樣品)切下兩條帶分別位于600bp和300-400bp左右，HindIII單酶切(3號樣品)切下一條帶約300-400bp，EcoRI單酶切將重組載體切成線性(2號樣品)，E2片斷中存在一個HindIII酶切位點(diǎn)，位置約靠近片斷的某一側(cè)。
(五)測序重組質(zhì)粒PEG純化法(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold SpringHarbor Labroratory Press.USA)提取質(zhì)粒DNA。以T7和SP6為測序引物，采用ABI377DNA Sequencer DNA自動序列儀(由上海博雅公司提供)，正反向進(jìn)行測定，得到2段核酸序列。得到的E2序列，在偏3’位置存在一個AAGCTT的HindIII酶切位點(diǎn)。
二、5’RACE(一)5’RACE-Ready cDNA的制備1.取出模板總RNA于75℃變性5min，迅速插入冰中冷卻；2.在一個0.5ml滅菌離心管中加入以下試劑1μl變性的模板總RNA1μl5’-CDS Primer A1μlSMART IIA Oligonucleotide加2μl的無RNA酶的無菌水補(bǔ)充體積到5μl；2.抽吸混勻，并短暫離心使混合液位于管底；3.70℃，、溫浴2min；4.冰浴2min，稍稍離心后加入下列試劑2μl5×First-Strand Buffer1μlDTT(20mM)1μldNTP Mix(10mM)1μlPowerScript Reverse Transcriptase10μl 總體積5.輕輕抽吸混勻試劑并稍稍離心；6.溫箱中42℃溫浴1.5h；7.用100μlTricine-EDTA buffer稀釋產(chǎn)物；8.72℃溫育7min；9.樣品存于-20℃。
(二)5’RACE步驟1.準(zhǔn)備Master Mix(110μl總體系)75.9μlPCR-Grade Water11μl 10×Advantage 2 PCR Buffer2.2μl dNTP Mix(10mM)2.2μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix91.3μl抽吸混勻，短暫離心；2.按照下表所示順序添加各組分至0.5ml無菌離心管中(單位μl)


3.PCR循環(huán)程序· 94℃ 1min·5 cycles94℃ 30sec72℃ 4min·5 cycles94℃ 30sec70℃ 4min·25 cycles 94℃ 30sec68℃ 4min· 72℃ 10min4.循環(huán)結(jié)束后取5μl樣品電泳檢測，得到5’RACE產(chǎn)物E3。結(jié)果如圖8所示，顯示5’RACE獲得一個單條帶的產(chǎn)物，條帶位置約于1400-1800bp左右，命名為E3片段。
(三)切膠回收5’RACE產(chǎn)物，TA克隆，CaCl2法制備E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，堿提質(zhì)粒DNA(實(shí)驗(yàn)操作同實(shí)施例五的內(nèi)容)。
(四)酶切鑒定重組質(zhì)粒pTE3用HindIII和EcoRI酶切鑒定TA克隆的重組子，如下表(單位μl)

37℃酶切4h以上。1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，結(jié)果如圖9所示，重組載體pTE3的酶切鑒定，HindIII+EcoRI雙酶切(1號樣品)出現(xiàn)兩條帶分別位于1400-1000bp和300-400bp左右，HindIII單酶切(3號樣品)出現(xiàn)一條帶約1400-1000bp，E3片斷中能存在一個HindIII酶切位點(diǎn)。
(五)測序挑取重組質(zhì)粒PEG純化法(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold SpringHarbor Labroratory Press.USA)提取質(zhì)粒DNA。以T7和SP6為測序引物，采用ABI377DNA Sequencer DNA自動序列儀(由上海博雅公司提供)，正反向進(jìn)行測定，得到E3片段核酸序列。得到的E3片段，在偏向5’位置存在一個HindIII酶切位點(diǎn)，在3’末端存在一個HindIII酶切位點(diǎn)。
三、ADTZ cDNA序列的拼接利用NCBI的Vecscreen程序識別去除載體序列，用DNAMAN程序?qū)1、E2、E3拼接，將得到的序列用NCBI的ORF Finder程序進(jìn)行開放閱讀框分析，得到序列長度為2.3kb，含有完整開放閱讀框，有3’末端的poly(A)尾巴，并包含5’端和3’端的非翻譯區(qū)。結(jié)果見圖序列SEQ ID NO2。將ADTZ核苷酸序列和推測的氨基酸序列通過因特網(wǎng)進(jìn)行BLASTA序列相似性查詢，程序BLAST和BLASTX(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，結(jié)果表明ADTZ為一全新的基因，由其推算出的編碼ADTZ的成熟肽氨基酸序列在GENEBANK中找不到相同的序列，為一全新的氨基酸序列。
編碼ADTZ全長cDNA序列的獲得不限于用實(shí)施例六所述的方法，用ADTZ短肽氨基酸序列設(shè)計(jì)探針從Armillariella tabescens的cDNA文庫中克隆該序列也包含在內(nèi)。
實(shí)施例七編碼ADTZ成熟肽cDNA產(chǎn)物的獲得分析實(shí)施例六所得編碼ADTZ全長cDNA序列的兩端序列，設(shè)計(jì)了一對引物P35’-GTCGAATTCATGGCCACCACAACTGTC-3’P43’-GTAACTCTCTGCTAACACTCCTAGGGAC-5’以獲得從起始密碼子開始到終止密碼子的ADTZ開放閱讀框序列，并在引物上分別添加限制酶切位點(diǎn)EcoRI(GAATTC)和BamHI(GGATCC)。按常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，切膠回收PCR產(chǎn)物。具體如下1.準(zhǔn)備Master Mix(100μl總體系)69μlPCR-Grade Water10μl10×Advantage 2 PCR Buffer2μl dNTP Mix(10mM)2μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix83μl抽吸混勻，短暫離心；2.按照下表所示順序添加各組分至0.5ml無菌離心管中(單位μl)

3.PCR循環(huán)程序· 94℃ 1min·5 cycles94℃ 30sec72℃ 4min·5 cycles94℃ 30sec70℃ 4min·35 cycles 94℃ 30sec68℃ 4min· 72℃ 10min4.循環(huán)結(jié)束后取5μl樣品電泳檢測，結(jié)果如圖10所示，顯示PCR獲得一個一條帶的產(chǎn)物，條帶位置約于1800bp左右，命名為ADTZ’片段。
5.切膠回收PCR產(chǎn)物按常規(guī)的PCR產(chǎn)物回收方法進(jìn)行。得到含編碼ADTZ成熟肽的cDNA，此片斷命名為“ADTZ’”。
實(shí)施例八重組質(zhì)粒ADTZ表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建基因克隆按常規(guī)方法(Sambrook，et al.2001，Molecular Cloning A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)進(jìn)行，將實(shí)施例七所得的ADTZ’克隆到pHIL-S1構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pHIL-S1-ADTZ，克隆后的目的基因經(jīng)酶切、測序鑒定。
具體做法如圖14所示，含基因ADTZ的重組質(zhì)粒pHIL-S1的構(gòu)建過程為EcoRI+BamHI雙酶切質(zhì)粒pHIL-S1和目的片斷ADTZ，酶切產(chǎn)物進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳，并切膠回收。利用T4 DNA連接酶進(jìn)行質(zhì)粒pHIL-S1和目的基因ADTZ的連接。CaCl2法制備E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)化子，堿提質(zhì)粒。用EcoRI+BamHI、HindIII、Sacl酶切鑒定重組質(zhì)粒pHIL-S1-ADTZ。挑取重組質(zhì)粒PEG純化法(Sambrook，et al.2001，Molecular Cloning A Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Labroratory Press.USA)提取質(zhì)粒DNA。以T7和SP6為測序引物，采用ABI377DNA Sequencer DNA自動序列儀(由上海博雅公司提供)，正反向進(jìn)行測定。酶切結(jié)果如圖11所示，重組載體pSA的酶切鑒定，BamHI、EcoRI雙酶切(樣品1)切下一條帶位于2000bp左右，HindIII單酶切(樣品2)切下三條帶分別約在1400bp，600bp和500bp，SacI單酶切(樣品3)將重組質(zhì)粒切成線性，說明插入片段中沒有SacI酶切位點(diǎn)。。
實(shí)施例九重組ADTZ的表達(dá)用Sacl酶切重組質(zhì)粒pHIL-S1-ADTZ和質(zhì)粒pHIL-S1，酶切產(chǎn)物進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收酶切后的線性重組質(zhì)粒pHIL-S1-ADTZ和質(zhì)粒pHIL-S1。按PichiaExpression Kit(Invitrogen Inc.，美國)手冊中的原生質(zhì)法轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GS115，篩選Mut+轉(zhuǎn)化子。利用甲醇作為唯一碳源對重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)(按Pichia Expression Kit手冊操作)中，培養(yǎng)液經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明，轉(zhuǎn)化子經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，培養(yǎng)液上清出現(xiàn)明顯的目的蛋白帶，而轉(zhuǎn)化不含目的基因的空質(zhì)粒的對照菌在相同的條件下誘導(dǎo)96小時，在上清中未檢測到目的蛋白條帶。結(jié)果如圖12所示，轉(zhuǎn)化子經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，培養(yǎng)液上清出現(xiàn)明顯的目的蛋白帶；而轉(zhuǎn)化不含目的基因的空質(zhì)粒的陰性對照菌，在相同的條件下誘導(dǎo)在上清中無目的蛋白出現(xiàn)。
具體做法如下一、重組子與畢赤酵母的同源重組(一)線性化質(zhì)粒Sacl酶切重組質(zhì)粒pSA和質(zhì)粒pHIL-S1，同時線性化質(zhì)粒pHIL-S1是作為下面實(shí)驗(yàn)的control。
酶切pSA(120總體系)12μl Buffer L+8μl Sacl+100μl pSA酶切pHIL-S1(120總體系)12μl Buffer L+8μl Sacl+100μl pHIL-S10.8％瓊脂糖凝膠電泳酶切樣品，切膠回收酶切后的線性重組質(zhì)粒pSA和質(zhì)粒pHIL-S1。
(二)培養(yǎng)用于原生質(zhì)化的畢赤酵母菌GS1151.從平板上挑取一個GS115單克隆接種于10mlYPD中，在150ml錐形瓶中，30℃，250-300rpm振蕩培養(yǎng)過夜；2.從昨日培養(yǎng)的的10mlYPD菌液中分別取5，10，20μl接種于200mlYPD中，在500ml的錐形瓶中，250-300rpm振蕩培養(yǎng)過夜；3.檢測3個瓶中菌液的OD600值，取OD600＝0.2-0.3的菌液轉(zhuǎn)入離心管中，室溫1500×g離心5min，棄上清，收集的細(xì)胞用于原生質(zhì)化。
(三)畢赤酵母菌GS115的原生質(zhì)化1.培養(yǎng)收集的細(xì)胞重懸于200ml的無菌水中，轉(zhuǎn)移至兩個無菌的10ml離心管中；2.室溫下，1500×g離心5min，棄上清；3.用10ml新鮮配制的SED洗沉淀，室溫下，1500×g離心5min，棄上清；4.用10ml 1M山梨醇洗沉淀，室溫下，1500×g離心5min，棄上清；5.用10mlSCE重懸沉淀；6.取一管Zymolyase凍融后輕彈管壁，使溶液混勻；7.取7.5μl Zymolyase加入管中，30℃溫育30min；8.室溫下750×g離心10min，收集菌體，棄上清；9.用10ml 1M山梨醇洗原生質(zhì)體，輕輕敲打管壁分散沉淀，室溫下750×g離心10min，收集菌體，棄上清；10.用10ml CaS洗菌體，室溫下750×g離心10min，收集菌體，棄上清；
11將沉淀重懸于0.6ml CaS中，此原生質(zhì)體在30min內(nèi)必須使用。
(四)原生質(zhì)法轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GS1151.分別取100μl畢赤酵母原生質(zhì)體加入A、B、C 3個無菌15ml離心管中；2.A管中不加DNA作為陰性對照，B管中加入30μl線性化的原質(zhì)粒pHIL-S1，C管中加入30μl線性化的重組質(zhì)粒pSA，室溫下溫育10min，期間準(zhǔn)備一支3ml新鮮配制的PEG/CaT；3.各管中加入1ml新鮮配制的PEG/CaT，輕輕混勻，室溫下溫育10min；4.室溫下750×g離心10分鐘，棄上清，控干；5.將沉淀重懸于150μl SOS中，室溫溫育20min；6.各管加入850μl 1M山梨醇，準(zhǔn)備鋪板；7.涂布RD固體培養(yǎng)基，每板涂布200μl，28-30℃溫育倒置培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化子約在4-6天出現(xiàn)。
(五)篩選Mut+轉(zhuǎn)化子1.用無菌牙簽挑取His+轉(zhuǎn)化子，分別在MM和MD板上一一對應(yīng)點(diǎn)菌，同時點(diǎn)上GS115/His+MutsAlbumin和GS115/His+Mut+β-gal作為對照。
2.28-30℃溫育倒置培養(yǎng)2天；3.兩天后，觀察對照MM和MD板，若在兩板上均生長良好為Mut+，若在MD上生長良好，在MM板上生長少或不生長則為Muts。
(六)重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)1.挑取一個His+Mut+轉(zhuǎn)化子的單克隆，接種于25mlBMG，在250ml的錐形瓶中，28-30℃，250-300rpm振蕩培養(yǎng)，直至OD600＝2-6(約16-18h)；2.1500-3000×g離心5min收集細(xì)胞，棄上清，重懸細(xì)胞于BMM中至OD600為1.0(約需100-200mlBMM)，在1升的錐形瓶中，28-30℃，250-300rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。
3.每24h加100％甲醇，始終濃度至0.5％，保持誘導(dǎo)表達(dá)；4.誘導(dǎo)表達(dá)96h的時間。培養(yǎng)液離心2-3min，留取上清放入-80℃保存以用于純化表達(dá)產(chǎn)物。
經(jīng)誘導(dǎo)96小時培養(yǎng)上清中總蛋白量達(dá)0.23mg/ml。目的蛋白的分子量與用BioEdit軟件(http//www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)預(yù)測的理論值76.95kDa相符。
實(shí)施例十重組ADTZ的純化誘導(dǎo)表達(dá)的發(fā)酵液經(jīng)70％飽和(NH4)2SO4沉淀，收取沉淀獲得粗酶樣品。粗酶樣品以等體積的PBS溶解，離心后取上清上疏水色譜層析Phenyl sepharose柱，以連續(xù)梯度的洗脫緩沖液洗脫，收集目的峰。透析脫鹽，PBS溶液平衡后濃縮。濃縮酶液上金屬螯合親和色譜層析Chelating Sepharose柱pH7.5～6.0的連續(xù)pH梯度緩沖液進(jìn)行洗脫，收集目的峰。具體如下
1、硫酸氨沉淀收集粗酶重組表達(dá)發(fā)酵液加入(NH4)2SO4粉末至40％飽和度，4℃，10000g離心20分鐘，上清繼續(xù)再加入(NH4)2SO4粉末至70％飽和度。4℃，10000g離心20分鐘。即獲得粗酶樣品。
2、疏水層析ADTZ粗酶樣品以等體積的0.02M PBS(pH6.0)液溶解，4000g 4℃離心10分鐘，取上清，上Phenyl sepharose柱[Phenyl sepharose 6 Fast flow(high sub)，Pharmacia Biotech，Inc]，溶液液(0.02M PBS+30％飽和硫酸銨，pH6.0)洗至基線，然后以連續(xù)梯度的洗脫緩沖液[A液(0.02M PBS+10％飽和硫酸銨，pH6.0)+B液(0.02MPBS，pH6.0)]洗脫，收活性峰。透析脫鹽，并以F液(0.02M PBS+0.5M NaCl，pH7.5)平衡，濃縮至蛋白濃度約為1mg/ml。
3、金屬螯合層析Chelating Sepharose[Chelating Sepharose Fast Flow，PharmaciaBiotech，Inc]預(yù)先以0.2M CuCl2溶液飽和，以純水洗柱至基線，再用F液(0.02M PBS+0.5MNaCl，pH7.5)洗至基線穩(wěn)定。將經(jīng)過疏水層析后的目的峰樣品上樣，分別以不連續(xù)pH梯度緩沖液G液
進(jìn)行洗脫，收集目的峰。目的峰用SDS-PAGE電泳鑒定。
結(jié)果誘導(dǎo)表達(dá)后的1升發(fā)酵液，經(jīng)以上的純化后可獲得58mg純化的重組ADTZ。純度達(dá)到95％以上。
實(shí)施例十一重組ADTZ活性的鑒定重組ADTZ活性的鑒定按參照實(shí)施例二之一方法進(jìn)行。反應(yīng)體系(1)活性酶組1μLAFB1溶液(AFB1甲醇溶液0.5μg/μL，氮?dú)鈸]干)+重組表達(dá)ADTZ酶液(蛋白含量0.1mg/mL)300μL+0.5μL MgSO4+10μL PEG200；(2)滅活酶組1μL AFB1溶液(AFB1甲醇溶液0.5μg/μL，氮?dú)鈸]干)+滅活的重組表達(dá)ADTZ酶液(蛋白含量0.1mg/mL，預(yù)先以100℃水浴5分鐘)300μL+0.5μL MgSO4+10μL PEG200；(3)緩沖液對照組1μL AFB1溶液(AFB1甲醇溶液0.5μg/μL，氮?dú)鈸]干)+PBS緩沖液(0.1M pH6.6)300μL+0.5μL MgSO4+10μL PEG200；反應(yīng)體系充分混勻，30℃水浴，反應(yīng)1小時，以后每小時向各加入0.5μL AFB1溶液，直至管內(nèi)AFB1總量為2μg。加畢后，再繼續(xù)反應(yīng)6小時。反應(yīng)結(jié)束后按實(shí)施例二之一方法操作點(diǎn)板展開檢測。
結(jié)果顯示用重組ADTZ處理后的AFB1產(chǎn)物則Rf值接近1(＝0.93)，與天然ADTZ的結(jié)果相似，表明重組ADTZ具有轉(zhuǎn)化AFB1的活性。結(jié)果如圖13所示，表明用重組ADTZ處理后的AFB1產(chǎn)物則Rf值接近1(＝0.93)，與天然的ADTZ相似，表明重組的ADTZ有轉(zhuǎn)化AFB1的活性。
實(shí)施例十二 重組ADTZ對AFB1解毒生物學(xué)活性的鑒定重組ADTZ活性的鑒定按參照實(shí)施例二之二方法進(jìn)行。受試樣品的制備將天然的ADTZ替換為重組表達(dá)的ADTZ，其余的分組設(shè)計(jì)和做法同樣。結(jié)果活性重組ADTZ處理反應(yīng)組的細(xì)菌回復(fù)突變菌落數(shù)與陰性對照組(DMSO對照組)相近(MR值均小于2)。緩沖液處理對照組和滅活重組ADTZ處理對照組的細(xì)菌回復(fù)突變菌落數(shù)明顯高于陰性對照組(MR值均大于2)，與陽性對照(黃曲霉毒素B1對照)的細(xì)菌回復(fù)突變數(shù)無顯著性差異。說明重組ADTZ具有抗AFB1引起突變的生物活性作用。結(jié)果如下表。
黃曲霉毒素B1經(jīng)重組表達(dá)酶處理后的細(xì)菌突變回復(fù)試驗(yàn)

序列表<110>暨南大學(xué)<120>一種具有轉(zhuǎn)化黃曲霉毒素活性的解毒酶及編碼該酶的基因<140>
<141>2004-08-17<160>2<170>Patentln version 3.2<210>1<211>695<212>PRT<213>假蜜環(huán)菌(Armillariella tabescens)<400>1Met Ala Thr Thr Thr Val His Arg Glu Arg Phe Leu Ala Asp Lys Ser1 5 10 15Ala Pro Leu Cys Gly Met Asp Ile Arg Lys Ser Phe Asp Gln Leu Ser20 25 30Ser Lys Glu Lys Leu Tyr Thr His Tyr Val Thr Glu Ala Ser Trp Ala35 40 45Gly Ala Arg Ile Ile Gln Ala Gln Trp Thr Pro Gln Ala Thr Asp Leu50 55 60Tyr Asp Leu Leu Ile Leu Thr Phe Ser Val Asn Gly Lys Leu Ala Asp65 70 75 80
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Ala Asp Gly Thr Gly Ser Arg Asp Phe Tyr Thr Thr Leu Thr Glu Pro625 630 635 640Ile Ser Gly Trp Glu Gly Lys Ile Arg Asp Ile Val Leu Lys Lys Lys645 650 655Leu Pro Arg Lys Ile Phe Val Gln Pro Asn Thr Phe Val Val Asn Gly660 665 670Glu Val Gln Leu Lys Glu Tyr Pro Leu Thr Ala Ala Gly Val Ile Glu675 680 685Ser Phe Ile Glu Arg Arg Leu690 695<210>2<211>2321<212>DNA<213>假蜜環(huán)菌(Armillariella tabescens)<220>
<221>CDS<222>(92)...(2179)<400>2acgcggggaa tcttatcctc aatcttatcg ccagccagtc acatctcttc ctttctcgag 60aactcgtcac ctgaatacct accgcagaga a atg gcc acc aca act gtc cac cgg gag cga 121Met Ala Thr Thr Thr Val His Arg Glu Arg1 5 10ttc ctg gca gat aag tct gct cct ttg tgt ggt atg gat att aga aag tca ttt gat 178Phe Leu Ala Asp Lys Ser Ala Pro Leu Cys Gly Met Asp Ile Arg Lys Ser Phe Asp15 20 25cag ctc agc tct aag gaa aag ctc tac acg cat tac gtg acc gaa gct tct tgg gcg ggc 238Gln Leu Ser Ser Lys Glu Lys Leu Tyr Thr His Tyr Val Thr Glu Ala Ser Trp Ala Gly30 35 40 45gca aga atc atc cag gct cag tgg acc ccg cag gcg aca gat cta tat gat ctg ttg atc 298Ala Arg Ile Ile Gln Ala Gln Trp Thr Pro Gln Ala Thr Asp Leu Tyr Asp Leu Leu Ile50 55 60 65ctt acg ttc agc gta aat gga aag ctc gcc gac ctg aat gcc ctt aag acg tcg tca ggc 358Leu Thr Phe Ser Val Asn Gly Lys Leu Ala Asp Leu Asn Ala Leu Lys Thr Ser Ser Gly70 75 80 85ctt tca gag gac gat tgg gag gcc ttg ata cag tac acg gtc cag gta ttg agc aat ctt 418Leu Ser Glu Asp Asp Trp Glu Ala Leu Ile Gln Tyr Thr Val Gln Val Leu Ser Asn Leu90 95 100 105gtc aac tac aag acg ttc gga ttt acg aag atc att ccc cgc gtc gac gca gaa aag ttt 478Val Asn Tyr Lys Thr Phe Gly Phe Thr Lys Ile Ile Pro Arg Val Asp Ala Glu Lys Phe110 115 120 125
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1.一種具有轉(zhuǎn)化黃曲霉毒素活性的解毒酶，其等電點(diǎn)為5.3～6.8，分子量為73～77千道爾頓，其氨基酸序列如序列表所示。
2.編碼如權(quán)利要求1所述的具有轉(zhuǎn)化黃曲霉毒素活性的解毒酶的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其核苷酸序列如序列表所示。
4.包含如權(quán)利要求3所述的基因的重組表達(dá)載體。
5.用如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞所得的轉(zhuǎn)化體。
6.制備如權(quán)利要求1所述的解毒酶的方法，其特征在于，包括以下步驟培養(yǎng)用包含如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化體，回收所表達(dá)的具有轉(zhuǎn)化黃曲霉毒素活性的解毒酶。
7.如權(quán)利要求1所述的具有轉(zhuǎn)化黃曲霉毒素活性的解毒酶在制備飼料和食品中黃曲霉毒素除毒產(chǎn)品的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求1所述的具有轉(zhuǎn)化黃曲霉毒素活性的解毒酶在制備預(yù)防和治療由黃曲霉毒素誘發(fā)的腫瘤的藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有轉(zhuǎn)化黃曲霉毒素活性的解毒酶及編碼該酶的基因。發(fā)明人首先分離并純化出了具有該活性的新型蛋白，命名為黃曲霉毒素解毒酶(Aflatoxin－detofizyme，ADTZ)。本發(fā)明通過純化和測序獲得ADTZ的基因特異性引物，從假蜜環(huán)菌(Armillariella tabescens)的總RNA出發(fā)，克隆得到編碼ADTZ的基因，并利用基因工程的方法，在多種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并純化出重組ADTZ蛋白。本發(fā)明所述的解毒酶具有轉(zhuǎn)化AFB
文檔編號C12N9/00GK1712526SQ200410051120
公開日2005年12月28日 申請日期2004年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月17日
發(fā)明者姚冬生, 劉大嶺, 管敏, 謝春芳 申請人:暨南大學(xué)