專利名稱：靈芝孢子油及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及以靈芝菌的孢子為原料，提取的一種活性成分及其制備方法，并涉及其用途。
背景技術(shù)：
靈芝(Ganoderma lucidum)為擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，是我國傳統(tǒng)扶正固本、滋補強壯的名貴中藥，在我國有5000多年的藥用、食用歷史。在不同生態(tài)環(huán)境均有相適宜的種類分布，已構(gòu)成了豐富的靈芝類群，尤其赤靈芝效用最為突出。
靈芝孢子是靈芝在成熟時期不斷從菌蓋下噴射出的生殖細胞，這些微細孢子是繁殖下一代靈芝的種子，它是靈芝的全部遺留物質(zhì)和孕育新生命所必須的營養(yǎng)精華。其主要功效成分可分為三萜類、多糖類、核苷、酶類、氨基酸、有機鍺、甾醇類、生物堿類及多種維生素等。
靈芝孢子有堅韌的外殼，由幾丁質(zhì)、鈣、磷、鐵等構(gòu)成，不溶解與水、弱酸等，不容易被胃酸所破壞，成為人體吸收其有效成分的主要障礙。通常采用超微粉體破壁或酶解破壁技術(shù)對靈芝孢子進行破壁，破壁率達95％以上，粒度達到300目以上。
Kutoba等1982年首次從靈芝中分離得到三萜類化合物—靈芝酸A、B以來，迄今為止從靈芝中分離得到的三萜類化合物已達120余種。三萜類化合物是靈芝特有的一種次級代謝成分，具有顯著的藥理活性。專利CN1094766c公開了一種靈芝孢子油的超臨界萃取加工方法，涉及到采用孢子粉制粒成型后進行超臨界萃取，制粒的工藝是以水、明膠或淀粉的混合物為粘合劑，室溫自然干燥而成。涉及的超臨界萃取的溫度、壓力條件也相對較寬，生產(chǎn)時難以掌握好的工藝條件，制得純度高的靈芝孢子油產(chǎn)品。同時，萃取時間也長達35小時，這在工業(yè)化過程中是難以真正實施。
專利CN1114446c也公開了一種靈芝孢子有效活性物質(zhì)的萃取方法。具體的也是涉及靈芝孢子經(jīng)破壁、超臨界CO2萃取的方法。但是提及到更為寬泛的超臨界萃取的技術(shù)條件，萃取壓力5～60Mpa，萃取溫度32～85℃，萃取時間0.5～6hr，在實際生產(chǎn)中下更是難以在如此寬泛的工藝條件下均得到純度高的產(chǎn)品和達到高的出油率。
專利CN1445346A也公開了一種靈芝孢子油超臨界CO2莘取制備方法。該專利除了在超臨界萃取條件方面與上述兩專利有所重疊外，涉及到采用膨化破壁技術(shù)完成靈芝孢子粉的破壁。由于采用的膨化溫度較高(80～140℃)，完全可能加速破壁后孢子粉內(nèi)的油脂類物質(zhì)的氧化和酸敗過程，對孢子油的產(chǎn)品質(zhì)量帶來不利的影響。由于上述的缺點，我們需要進一步摸索最佳的適合工業(yè)生產(chǎn)的工藝條件，提取具有生理活性的靈芝孢子油并能控制產(chǎn)品質(zhì)量用于制備藥物、食品和保健食品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有生理活性的靈芝孢子油及其適合工業(yè)生產(chǎn)的制備方法和應用于制備藥物或食品。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是所制得的靈芝孢子油是用破壁的靈芝孢子粉采用超臨界二氧化碳提取得到的靈芝孢子油中含有以熊果酸計達24～35％的總?cè)疲咦佑偷南鄬γ芏葹?.88～0.92(20℃/4℃)，折光率在25℃下為1.45～1.48，酸價14～35。
靈芝孢子油中總?cè)频暮繙y定方法可采用可見分光光度法將靈芝孢子油樣品溶于乙酸乙酯中并于水浴上蒸干后，加入香草醛—冰乙酸溶液和高氯酸，于水浴加熱后，再加入冰乙酸用分光光度計測定樣品中的總?cè)坪?。取熊果酸為對照品繪制標準曲線，樣品溶液配制后用分光光度計于548.1nm波長處測定。
相對密度、折光率、酸價的測定方法按中國藥典附錄的方法測定。
其靈芝孢子油的制備方法是選用破壁的靈芝孢子為原料，用乙醇的水溶液制粒并干燥后，投料于超臨界二氧化碳萃取釜中，采用超臨界二氧化碳萃取、二級分離的方法，提取得到油狀物，進一步經(jīng)5000～15000rpm離心分離，得到淡黃色油狀物。
為了保證提取的出油率和產(chǎn)品的質(zhì)量，制粒時所用的乙醇水溶液的體積百分比濃度為5～95％，優(yōu)選乙醇水溶的體積百分比濃度為30～40％，制粒后在30～55℃溫度，進行減壓干燥或熱風循環(huán)干燥，顆粒的含水量小于5％。直接采用破壁的靈芝孢子粉進行超臨界二氧化碳萃取，由于少量孢子微粉進入油狀物中，即使經(jīng)過離心分離，孢子油的顏色依然偏深；同時，工業(yè)生產(chǎn)時，批與批之間連續(xù)萃取可以使萃取釜內(nèi)筒上端的燒結(jié)板變形，嚴重者會帶來超壓操作的危險。為切實解決生產(chǎn)的安全操作問題，確保孢子油萃取過程質(zhì)量的穩(wěn)定，本發(fā)明采取了將靈芝孢子粉用乙醇的溶液制粒后，優(yōu)選在30～55℃下減壓干燥或熱風循環(huán)干燥，成型后顆粒的含水量小于5％為宜。如果顆粒含水量＞5％，不但孢子油的生產(chǎn)得率降低，而且容易造成循環(huán)系統(tǒng)結(jié)冰而導致CO2氣路堵塞。靈芝孢子粉在不同乙醇溶液濃度下的制粒結(jié)果以及顆粒的含水量對比結(jié)果見表1。
表1 不同乙醇溶液濃度的制粒結(jié)果比較

所說的二氧化碳萃取時的工藝條件經(jīng)研究，優(yōu)選萃取釜壓力為25～32MPa，溫度為45～45℃，萃取時間為2～3小時，二氧化碳流量為30～40kg/hr；二級分離的工藝條件是第一級分離壓力8～10MPa，分離溫度45～50℃；第二級分離壓力5～6MPa，分離溫度30～40℃為佳。我們通過大量的試驗證明，萃取條件在低于25Mpa，孢子油中總?cè)戚腿〔煌耆?，其含量以熊果酸計小?0％，而在高于32Mpa條件下，總?cè)坪坎⑽从酗@著的增加，詳見下表。同時，考慮到目前我國的超臨界萃取的中試或生產(chǎn)型設備的操作壓力一般小于35Mpa。如采用高壓力的生產(chǎn)設備，生產(chǎn)投資會增加很多，并存在設備的保養(yǎng)、維修、生產(chǎn)安全等系列問題。因此，經(jīng)過優(yōu)化的超臨界萃取條件確定為25～32Mpa，萃取溫度為40～45℃。
表2靈芝孢子油在不同萃取條件下的總?cè)祁惡?40％乙醇溶液制粒)

為了保證產(chǎn)品的質(zhì)量，尤其是控制孢子油中的含水量，經(jīng)反復試驗，得出采用二級分離方法可獲得解決，在解析過程中絕大部分的靈芝孢子油主要在分離釜I解析出來，而水集中在分離釜II解析出來，從而避免只用一級分離帶來孢子油含水量過高的問題。
本發(fā)明的另一個目的是所得的靈芝孢子油用于制備提高機體免疫調(diào)節(jié)作用的藥物和食品。
下面通過藥效試驗證明本發(fā)明所提供的靈芝孢子油的用途。
試驗條件樣品以上述工藝獲得的靈芝孢子油，通過壓制法在符合GMP的條件下制備出靈芝孢子油軟膠囊，規(guī)格400mg/粒。為了更好地檢測孢子油的功效，按60公斤成人為0.04g/kg b.w，設計低、中、高劑量組。各實驗劑量組所需濃度均用玉米油稀釋樣品配成。
組別與劑量設玉米油對照組和低、中、高三個劑量組，劑量如下(1)低劑量組0.02g/kg b.w，相當于推薦日服用量5倍。
(2)中劑量組0.40g/kg b.w，相當于推薦日服用量10倍。
(3)中劑量組1.20g/kg b.w，相當于推薦日服用量30倍動物SPF級昆明種雌性小白鼠，6～8周齡(體重18～22g)給藥途徑每天按10ml/kg b.w量灌胃動物給予受試動物。
1、靈芝孢子油軟膠囊對小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應的影響見表3。
表3 靈芝孢子油軟膠囊對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的影響劑量 動物數(shù) 足跖增厚 P值組別(g/kg b.w) (只) (mm) (與對照組比)對照組0.012 0.37±0.28低劑量0.212 0.59±0.29＞0.05中劑量0.412 0.49±0.30＞0.05高劑量1.212 0.73±0.31＜0.01F值 3.249試驗結(jié)果高劑量組足跖增厚值與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義，表明該試驗結(jié)果為陽性。
2、靈芝孢子油軟膠囊對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化反應見表4。
表4 靈芝孢子油軟膠囊對小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化反應的影響劑量 動物數(shù) P值組別 光密度差值(g/kg b.w)(只)(與對照組比)對照組0.0 120.118±.055低劑量0.2 120.164±.060 ＜0.05中劑量0.4 120.187±.062 ＜0.01高劑量1.2 120.179±.042 ＜0.05F值 3.691試驗結(jié)果各劑量組光密度值與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義，表明靈芝孢子油軟膠囊對脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化反為陽性結(jié)果。
3、靈芝孢子油軟膠囊對受試動物血清溶血素抗體滴度反應見表5。
表5 靈芝孢子油軟膠囊對小鼠血清溶血素抗體滴度反應的影響劑量 動物數(shù) 抗體體積 P值組別(g/kg b.w)(只)(mm) (與對照組比)對照組 0.0 12 48.17±4.81低劑量 0.2 12 61.17±1.33 ＞0.05中劑量 0.4 12 85.50±0.75 ＜0.01高劑量 1.2 12 82.83±8.25 ＜0.01F值9.727試驗結(jié)果由表可見，中、高劑量組的抗體體積數(shù)均高于對照組，差異比較有統(tǒng)計學意義，表明靈芝孢子油軟膠囊對受試動物血清溶血素抗體滴度反應為陽性。
4、靈芝孢子油軟膠囊對小鼠碳廓清吞噬功能的影響見表6。
表6靈芝孢子油軟膠囊對小鼠碳廓清吞噬功能的影響劑量 動物數(shù)抗體體積 P值組別(g/kg b.w) (只) (mm) (與對照組比)對照組 0.0103.58±0.69低劑量 0.2104.91±1.23 ＜0.05中劑量 0.4105.14±1.15 ＜0.01高劑量 1.2105.62±1.38 ＜0.01F值 5.858試驗結(jié)果各劑量組吞噬指數(shù)與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義。表明靈芝孢子油軟膠囊對小鼠碳廓清吞噬作用為陽性結(jié)果。
5、結(jié)論小鼠經(jīng)口每日分別給予靈芝孢子油軟膠囊0.20、0.40、1.20g/kg b.w，相當于推薦日服用量5、10、30倍，試驗時間共30天。結(jié)果顯示(1)綿羊紅細胞誘導的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應試驗(足跖增厚法)結(jié)果陽性。
(2)小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗陽性，樣品具有增強免疫功能作用。
(3)綿羊紅細胞免疫小鼠血清溶血素試驗(血凝法)結(jié)果陽性，樣品具有增強體液免疫功能作用。
(4)小鼠碳廓清試驗結(jié)果陽性，樣品具有增強單核-巨噬細胞功能作用。
依據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》增強免疫力功能判定標準判斷，靈芝孢子油軟膠囊具有增強免疫力功能作用。
本發(fā)明的有益效果1、采用本發(fā)明所提供的方法，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，工藝流程簡單，操作方便，提取收率高，適合于工業(yè)生產(chǎn)的安全可靠的制備方法。
2、靈芝孢子油產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定，產(chǎn)品質(zhì)量控制方便有可操作性。
3、產(chǎn)品具有良好的提高具體免疫功能的作用。
下面通過具體實施例闡述本發(fā)明的技術(shù)方案。
具體實施例方式
實施例1 取破壁的靈芝孢子粉5Kg，用20％乙醇溶液作濕潤劑，制成軟材，擠壓造粒后，在45℃下干燥5小時，得含水量為3.6％的孢子粉顆粒。置于50升超臨界二氧化碳萃取釜中，CO2經(jīng)高壓泵加壓，循環(huán)萃取。萃取釜的壓力為25MPa，溫度40℃，一級分離10MPa、50℃，二級分離5MPa、40℃。連續(xù)萃取2.5小時后，于分離器中收集孢子油，可得淡黃色具有孢子粉特殊氣味的孢子油。5000rpm離心后，得油狀物1.082kg，收率21.64％。
實施例2 取破壁的靈芝孢子粉5kg，用40％乙醇溶液作濕潤劑，制成軟材，擠壓造粒，在50℃下干燥4小時，得含水量為4.3％的孢子粉顆粒。置于50升超臨界二氧化碳萃取釜中，CO2經(jīng)高壓泵加壓CO2經(jīng)高壓泵加壓，循環(huán)萃取。萃取釜的壓力為28MPa，溫度45℃，一級分離10MPa、50℃，二級分離6MPa、40℃。連續(xù)萃取2小時后，于分離器中收集孢子油，可得淡黃色具有孢子粉特殊氣味的孢子油。5000rpm離心后，得油狀物1.189kg，收率23.78％。
實施例3.取破壁的靈芝孢子粉5kg，用10％乙醇溶液作濕潤劑，制成軟材，擠壓造粒，在35℃下干燥6小時，得含水量為4.6％的孢子粉顆粒。置于50升超臨界二氧化碳萃取釜中，CO2經(jīng)高壓泵加壓，循環(huán)萃取。萃取釜的壓力為25MPa，溫度45℃，一級分離10MPa、50℃，二級分離6MPa、40℃。連續(xù)萃取3小時后，于分離器中收集孢子油，可得淡黃色具有孢子粉特殊氣味的孢子油。10000rpm離心分離得油狀物1.142kg，收率22.84％。
實施例4 取破壁的靈芝孢子粉5Kg，用80％乙醇溶液作濕潤劑，制成軟材，擠壓造粒后，在45℃下干燥4小時，得含水量為3.4％的孢子粉顆粒。置于50升超臨界二氧化碳萃取釜中，CO2經(jīng)高壓泵加壓，循環(huán)萃取。萃取釜的壓力為28MPa，溫度45℃，一級分離10MPa、50℃，二級分離5MPa、40℃。連續(xù)萃取2.5小時后，于分離器中收集孢子油，可得淡黃色具有孢子粉特殊氣味的孢子油。12000rpm離心后，得油狀物1.202kg，收率24.04％。
實施例5 取破壁的靈芝孢子粉5Kg，用90％乙醇溶液作濕潤劑，制成軟材，擠壓造粒后，在45℃下干燥4小時，得含水量為2.6％的孢子粉顆粒。置于50升超臨界二氧化碳萃取釜中，CO2經(jīng)高壓泵加壓，循環(huán)萃取。萃取釜的壓力為30MPa，溫度40℃，一級分離10MPa、50℃，二級分離5MPa、40℃。連續(xù)萃取2.5小時后，于分離器中收集孢子油，可得淡黃色具有孢子粉特殊氣味的孢子油。12000rpm離心后，得油狀物1.227kg，收率24.54％。
實施例6 取破壁的靈芝孢子粉5Kg，用60％乙醇溶液作濕潤劑，制成軟材，擠壓造粒后，在40℃下干燥5小時，得含水量為3.6％的孢子粉顆粒。置于50升超臨界二氧化碳萃取釜中，CO2經(jīng)高壓泵加壓，循環(huán)萃取。萃取釜的壓力為30MPa，溫度45℃，一級分離10MPa、50℃，二級分離5MPa、40℃。連續(xù)莘取2.5小時后，于分離器中收集孢子油，可得淡黃色具有孢子粉特殊氣味的孢子油。5000rpm離心后，得油狀物1.239kg，收率24.78％。
實施例7 取破壁的靈芝孢子粉5Kg，用50％乙醇溶液作濕潤劑，制成軟材，擠壓造粒后，在45℃下干燥5小時，得含水量為3.6％的孢子粉顆粒。置于50升超臨界二氧化碳萃取釜中，CO2經(jīng)高壓泵加壓，循環(huán)萃取。萃取釜的壓力為32MPa，溫度45℃，一級分離10MPa、50℃，二級分離5MPa、40℃。連續(xù)萃取2.5小時后，于分離器中收集孢子油，可得淡黃色具有孢子粉特殊氣味的孢子油。5000rpm離心后，得油狀物1.256kg，收率25.12％。
實施例8 取破壁的靈芝孢子粉5Kg，用70％乙醇溶液作濕潤劑，制成軟材，擠壓造粒后，在45℃下干燥5小時，得含水量為2.8％的孢子粉顆粒。置于50升超臨界二氧化碳萃取釜中CO2經(jīng)高壓泵加壓，循環(huán)萃取。萃取釜的壓力為32MPa，溫度45℃，一級分離10MPa、50℃，二級分離5MPa、40℃。連續(xù)萃取2.5小時后，于分離器中收集孢子油，可得淡黃色具有孢子粉特殊氣味的孢子油。15000rpm離心后，得油狀物1.249kg，收率24.98％。
實施例9 取實施例1～8制得的純靈芝孢子油9.5kg，以明膠為囊材，采用常規(guī)的壓制法制備成每粒400mg的軟膠囊，可用于食品、保健食品或藥品。
表7 不同實施例檢測結(jié)果對比

權(quán)利要求
1.一種靈芝孢子油，其特征在于用破壁的靈芝孢子粉采用超臨界二氧化碳提取得到的靈芝孢子油中含有以熊果酸計達24～35％的總?cè)?，孢子油的相對密度?.88～0.92，折光率在25℃下為1.45～1.48，酸價14～35。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說的靈芝孢子油的制備方法，其特征在于選用破壁的靈芝孢子為原料，用乙醇的水溶液制粒并干燥后，投料于超臨界二氧化碳萃取釜中，采用超臨界二氧化碳萃取、二級分離的方法，提取得的油狀物，進一步經(jīng)過5000～15000rpm離心分離，得到淡黃色油狀物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的靈芝孢子油的制備方法，其特征在于制粒時所用的乙醇水溶液的體積百分比濃度為5～95％，制粒后在30～55℃溫度進行減壓干燥或熱風循環(huán)干燥，顆粒的含水量小于5％。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靈芝孢子油的制備方法，其特征在于制粒時所用的乙醇水溶液的體積百分比濃度為30～40％。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的靈芝孢子油制備方法，其特征在于所說的超臨界二氧化碳萃取時的萃取壓力為25～32MPa，溫度為40～45℃，萃取時間為2～3小時，二氧化碳流量為30～40kg/hr；二級分離的工藝條件是第一級分離壓力8～10MPa，分離溫度45～50℃；第二級分離壓力5～6MPa，分離溫度30～40℃。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靈芝孢子油的用途，其特征在于制備提高機體免疫調(diào)節(jié)作用的食品、保健食品和藥物。
全文摘要
靈芝孢子油及其制備方法和用途，涉及以靈芝菌的孢子為原料，提取的一種活性成分及其制備方法，和用途。孢子油中含有24－35％的總?cè)?，相對密度?.88～0.92，折光率為1.45～1.48，酸價14～35；其制備方法是用破壁的靈芝孢子為原料，用乙醇溶液制粒干燥后于超臨界二氧化碳萃取釜萃取、二級分離，提取得到油狀物，經(jīng)離心分離得到淡黃色油狀物；產(chǎn)品用于制備提高機體免疫調(diào)節(jié)作用的藥物和食品。本發(fā)明所提供的方法，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，工藝流程簡單，操作方便，提取收率高，適合于工業(yè)生產(chǎn)；產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定，質(zhì)量控制方便有可操作性；產(chǎn)品有良好的提高機體免疫作用。
文檔編號A23L1/29GK1586295SQ20041005141
公開日2005年3月2日 申請日期2004年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月10日
發(fā)明者李金華, 黃星, 劉菊妍, 史慶龍, 寧德山 申請人:廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開發(fā)有限公司