專利名稱：：去除轉(zhuǎn)基因植物中階段性作用外源基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，更具體地涉及一種用于去除轉(zhuǎn)基因作物中階段性外源基因從而減少轉(zhuǎn)基因作物的危害的方法。
背景技術(shù)：
：隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用的普及和轉(zhuǎn)基因食品的大量上市，轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性問題日益成為大眾關(guān)心的焦點(diǎn)。其中非常有爭議的一點(diǎn)就是轉(zhuǎn)化載體中使用的篩選標(biāo)記基因，一方面大部分使用的篩選標(biāo)記基因都是編碼抗生素抗性的基因，這些基因及其產(chǎn)物在轉(zhuǎn)化植株中已經(jīng)沒有用處了，而且在大田種植過程中有可能擴(kuò)散到其它的雜草和作物中去，從而造成基因污染。另一方面，如果想要對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行進(jìn)一步的遺傳操作，則不能選擇原來的篩選標(biāo)記，只有引入新的篩選標(biāo)記基因，使得轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的抗性越來越復(fù)雜，選擇余地也越來越小。所以篩選標(biāo)記基因的存在造成了很多不便，在這種背景下，marker-free轉(zhuǎn)基因技術(shù)也就應(yīng)運(yùn)而生了(YoderJ.I，GoldsbroughA.P.Transformationsystemsforgeneratingmarker-freetransgenicplants.Biotechnology，1994，12263～267)。到目前為止，已經(jīng)誕生了很多去除轉(zhuǎn)基因植物中的篩選標(biāo)記的方法(BarbaraHohn，AvrahamALevy，HolgerPuchta.Eliminationofselectionmarkersfromtransgenicplants.Currentopinioninbiotechnol，2001，12139～143)，大體上可以分為如下幾類(1)共轉(zhuǎn)化法(co-transformation)(KomariT，HieiY，SaitoY，etal.VectorscarryingtwoseparateT-DNAsforco-transformationofhigherplantsmediatedbyAgrobacteriumtumefaciensandsegregationoftransformantsfreefromselectionmarkers.PlantJ，1996，10165～174)即把篩選標(biāo)記基因和目的基因分別構(gòu)建到不同的T-DNA分子上，再由兩個(gè)T-DNA分子共同轉(zhuǎn)化目的物種，然后利用孟德爾遺傳分離規(guī)律通過后代篩選得到只含目的基因的轉(zhuǎn)基因植株。很明顯此方法過于繁瑣，工作量大。(2)轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)法(EbinumaH，SugitaK，MatsunagaE，etalSelectionofmarker-freetransgenicplantsusingtheisopentenyltransferasegene.ProcNatlAcadSciUSA，1997，942117～2121)即利用轉(zhuǎn)座子的Ac轉(zhuǎn)座酶對反向重復(fù)序列Ds的中間序列的轉(zhuǎn)座特性從而把篩選標(biāo)記基因去除，但利用此方法得到marker-free轉(zhuǎn)基因植株的頻率較低(0.5-1.0％)，而且還需要后期篩選。(3)染色體重組法利用λ噬菌體的整合切除系統(tǒng)，Zubco等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示23株植株里有3株去掉了篩選標(biāo)記基因(ZubcoE.，ScuttC.MeyerP.IntrachromosomalrecombinationbetweenattPregionsasatooltoremoveselectablemarkergenesfromtobaccotransgenes.NatBiotechnol，200018442～445)。然而該方法仍較為煩瑣。(3)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)與DNA重組系統(tǒng)的結(jié)合此法為目前應(yīng)用最有前景的方法，具有代表性的為GST-MAT(multi-autotransformation)系統(tǒng)(SugitaK，KasaharaT，MatsunagaE，etalAtransformationvectorfortheproductionofmarker-freetransgenicplantscontainingasinglecopytransgeneathighfrequency.PlantJ，2000，5461～469)與XVE系統(tǒng)(ZuoJ，NuiQ.-W，GeirMllerS，etalChemical-regulated，site-specificDNAexcisionintransgenicplants.NatBiotechnol，2001，19157～161)，即利用化學(xué)試劑誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子如GST或XVE來控制DNA重組系統(tǒng)Cre-loxP或R/RS的表達(dá)，當(dāng)代就可以得到marker-free轉(zhuǎn)基因植株，這樣就可以大大減少后期的工作量，而且可以提高得到marker-free轉(zhuǎn)基因植株的頻率。然而，以上報(bào)道的兩個(gè)系統(tǒng)都是利用的化學(xué)試劑誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子，但化學(xué)試劑本身也有可能造成對植株的損害，操作起來也比較繁瑣，這可能造成了得到marker-free轉(zhuǎn)基因植株頻率的降低。目前為止，尚沒有可以有效地且對植物基本無損害地去除轉(zhuǎn)基因作物中階段性作用外源基因(如篩選標(biāo)記基因)的方法。因此本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的有效地且對植物基本無損害地去除轉(zhuǎn)基因作物中階段性作用外源基因(如篩選標(biāo)記基因)的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供一種有效地且對植物基本無損害地去除轉(zhuǎn)基因作物中階段性作用外源基因(如篩選標(biāo)記基因)的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于轉(zhuǎn)化植物的構(gòu)建物，所述構(gòu)建物按5′至3′方向依次含有以下元件(a)LoxP元件；(b)外源基因表達(dá)盒；(c)篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒；(d)Cre基因表達(dá)盒，其中所述Cre表達(dá)盒的啟動(dòng)子是HSP啟動(dòng)子；(e)LoxP元件；其中元件(b)、(c)和(d)的位置可以互換。在另一優(yōu)選例中，所述的外源基因表達(dá)盒中所含的外源基因選自下組Bar、Gus。在另一優(yōu)選例中，所述的篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒中所含的篩選標(biāo)記基因包括NptII(卡那霉素抗性基因)、Bar、hptII(潮霉素抗性基因)。在另一優(yōu)選例中，LoxP元件的序列如SEQIDNO1所示。在另一優(yōu)選例中，Cre基因的序列如SEQIDNO2所示。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種載體，所述載體含有本發(fā)明上述的構(gòu)建物。還提供了一種植物細(xì)胞，所述的植物細(xì)胞被上述的載體或上述的構(gòu)建物所轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括步驟(a)用本發(fā)明上述的載體或本發(fā)明上述的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；(b)將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生成植株，從而獲得轉(zhuǎn)基因植物。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟(c)將再生的轉(zhuǎn)基因植物在適合Hsp啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熱激條件下培養(yǎng)，從而獲得熱激處理的轉(zhuǎn)基因植物。在另一優(yōu)選例中，所述方法中的熱激條件選自下組(a)在35±3℃下培養(yǎng)6-96小時(shí)；(b)在35±3℃下培養(yǎng)6-36小時(shí)，在25±5攝氏度培養(yǎng)6-36小時(shí)，然后在35±3℃下培養(yǎng)6-36小時(shí)。圖1顯示了pHSAE載體的示意圖和作用方式。其中，圖1中從35S到GUS的全部序列列于SEQIDNO4，并且各元件在SEQIDNO4中的詳細(xì)位置如下CaMV35S1-834LoxP1835-869BAR877-1375nptII1766-2660HSPNLSCRE3222-5775LoxP26105-6139GUS6147-7959。圖2顯示了用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因煙草植株。圖3顯示了熱激后種子在卡那霉素50mg/L培養(yǎng)基上會(huì)逐漸死亡(右側(cè))，而左側(cè)為未熱激處理的種子則不死亡。圖4顯示了T1代植株熱激與否的GUS染色分析結(jié)果。左為野生型煙草，中為熱激后的轉(zhuǎn)基因煙草，右為未熱激的轉(zhuǎn)基因煙草。圖5顯示了熱激前后PCR分析。各泳道如下1，2為2號株系熱激前后；3，4為3號株系熱激前后；5，6為8號株系熱激前后；7，8為10號株系熱激前后；WT為野生型熱激后；兩側(cè)的M均為分子量標(biāo)準(zhǔn)物DL2000。圖6顯示了轉(zhuǎn)pHSAE煙草與轉(zhuǎn)pBI121煙草熱激后的GUS表達(dá)活性定量測定結(jié)果。其中橫坐標(biāo)中的數(shù)字代表不同的株系，□為指未熱激誘導(dǎo)，■為熱激后。圖6A為熱激前后轉(zhuǎn)pBI121煙草的GUS表達(dá)活性；圖6B為轉(zhuǎn)pHSAE煙草未熱激與熱激后GUS表達(dá)活性，11號為野生型煙草；圖6C為熱激后轉(zhuǎn)pBI121煙草的平均GUS表達(dá)活性，轉(zhuǎn)pHSAE煙草未熱激和熱激后GUS表達(dá)活性比較，CK指野生型煙草。圖7顯示了T0代植株熱激前后對nptII基因切除情況的Southern分析，以nptII基因的PCR產(chǎn)物為模板合成探針，CK為質(zhì)粒對照。圖8顯示了pCrox18的結(jié)構(gòu)(注該質(zhì)粒為環(huán)狀，為方便起見給出的是線性化的結(jié)構(gòu)圖譜)。其中，各元件如下35S35S啟動(dòng)子；LoxP134bpcre重組酶位點(diǎn)；BARBar抗性基因(植物)；Tn903卡那霉素抗性基因(細(xì)菌)；HSPNLScreE9熱激蛋白啟動(dòng)子，核定位信號，cre重組酶，E9終止子；kan卡那霉素抗性基因(植物)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)植物在熱激誘導(dǎo)后HSP會(huì)啟動(dòng)了cre基因的表達(dá)并對loxP之間的序列進(jìn)行有效的切除。利用這一特性，將轉(zhuǎn)基因植物中階段性作用外源基因置于兩個(gè)LoxP序列之間，在獲得轉(zhuǎn)基因植物后，在利用熱激誘導(dǎo)，就可有效地去除階段性作用外源基因(如篩選標(biāo)記基因)。這種新系統(tǒng)被稱之為HSAE(heatshockauto-excision)系統(tǒng)，它可利用熱激蛋白的啟動(dòng)子來控制Cre-loxP對篩選標(biāo)記基因的切除。如本文所用，術(shù)語“LoxP元件”指可以被Cre蛋白識別的兩個(gè)同向重復(fù)位點(diǎn)，一種優(yōu)選的LoxP序列如SEQIDNO1所示。在本發(fā)明中，兩個(gè)LoxP元件的方向通常是相同的。如本文所用，術(shù)語“Cre”指，一種具有重組功能的DNA酶，一種優(yōu)選的Cre的核苷酸和氨基酸序列如SEQIDNO2和3所示。如本文所用，“外源基因”指作用是階段性作用的外源DNA分子?？捎糜诒旧暾埖耐庠椿驔]有特別限制，包括轉(zhuǎn)基因植物領(lǐng)域常用的各種外源基因。代表性例子包括(但并不限于)bar、Bt。如本文所用，“篩選標(biāo)記基因”指轉(zhuǎn)基因過程中用來篩選轉(zhuǎn)基因植株的基因?？捎糜诒旧暾埖暮Y選標(biāo)記基因沒有特別限制，包括轉(zhuǎn)基因植物領(lǐng)域常用的各種篩選標(biāo)記基因。代表性例子包括(但并不限于)NptII(卡那霉素抗性基因)、Bar、hptII(潮霉素抗性基因)。如本文所用，“表達(dá)盒”指含有待表達(dá)基因以及表達(dá)所需元件的序列組件的一段多聚核苷酸序列。例如，在本發(fā)明中，術(shù)語“Cre表達(dá)盒”指含有Cre編碼序列以及表達(dá)所需元件的序列組件的多聚核苷酸序列。表達(dá)所需的組件包括啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號序列。此外，Cre表達(dá)盒還可以含有或不含有其他序列，其中包括但并不限于增強(qiáng)子、分泌信號肽序列等。例如，信號肽序列的位置在啟動(dòng)子和Cre編碼序列之間。術(shù)語“外源基因表達(dá)盒”指含有外源基因序列以及表達(dá)所需元件的序列組件的多聚核苷酸序列。術(shù)語“篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒”指含有篩選標(biāo)記基因序列以及表達(dá)所需元件的序列組件的多聚核苷酸序列。在本發(fā)明中，適用于外源基因表達(dá)盒和篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒的啟動(dòng)子可以是任何一種常見的啟動(dòng)子，它可以是組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。較佳地，該啟動(dòng)子是組成型的強(qiáng)啟動(dòng)子，例如巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、牛乳頭瘤病毒啟動(dòng)子等其它適用于真核表達(dá)的啟動(dòng)子。在本發(fā)明中，適用于Cre表達(dá)盒的啟動(dòng)子可以是可熱激誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，包括HSP啟動(dòng)子，例如來自擬南芥的Hsp啟動(dòng)子。在本發(fā)明中，適用于各表達(dá)盒的信號肽序列可以是任何一種常見的適用于真核表達(dá)的核定位信號肽序列，例如來自各種高等植物的信號肽等。較佳地，該信號肽序列是來自玉米的信號肽。如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。本發(fā)明構(gòu)建物中所用的各種元件都是本領(lǐng)域中已知的，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用常規(guī)的PCR方法、合成方法、酶切方法獲得相應(yīng)的元件，然后通過熟知DNA連接技術(shù)連接在一起，就形成了本發(fā)明的構(gòu)建物。將本發(fā)明的構(gòu)建物插入載體(尤其是用于適合農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的載體)，就獲得了本發(fā)明的載體。本發(fā)明的載體采用Cre-LoxP系統(tǒng)與誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)相結(jié)合的方法。Cre所編碼的重組酶能催化兩個(gè)同向的34bploxP位點(diǎn)發(fā)生重組，將兩個(gè)loxP位點(diǎn)間的DNA序列切除。之前的應(yīng)用此系統(tǒng)產(chǎn)生MFTPS的方法主要是采用兩次轉(zhuǎn)化的方法，即第一次在一個(gè)表達(dá)載體中把loxP位點(diǎn)構(gòu)建在要切除的標(biāo)記基因的兩側(cè)，轉(zhuǎn)化植物后挑出轉(zhuǎn)基因植株，然后再把含Cre基因的表達(dá)載體對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行二次轉(zhuǎn)化，再從其中挑選發(fā)生了切除反應(yīng)的植株，從而獲得MFTPS。此方法明顯比較繁瑣，且對于轉(zhuǎn)化率比較低的植物如大豆、玉米、小麥等來說更難以實(shí)施。因此我們設(shè)計(jì)了這個(gè)目前在產(chǎn)生MFTPS的研究領(lǐng)域最為先進(jìn)的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)與Cre-LoxP系統(tǒng)相結(jié)合的方法。本發(fā)明所采用的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)為熱誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。熱激啟動(dòng)子(HSP)是由擬南芥中克隆出來的，當(dāng)其受到持續(xù)高溫刺激時(shí)(如35℃15h)即可啟動(dòng)其所控制基因的表達(dá)，這對于我國大部分地區(qū)來說，夏天的溫度均可達(dá)到。本系統(tǒng)主要適用于夏季收獲的作物，如小麥、水稻、大豆等，另外生長在溫度可以控制的環(huán)境內(nèi)的作物也可應(yīng)用。另外，考慮到最近幾年關(guān)于生物安全的激烈爭論，本系統(tǒng)采用了把目的基因一并去除的方法。這樣，如一些抗病抗蟲基因(如Bar)的生物安全問題便可迎刃而解了。本系統(tǒng)作用原理如下首先獲得轉(zhuǎn)基因植株，這時(shí)HSP在溫度控制下不活化，轉(zhuǎn)基因植物到了夏季即收獲季節(jié)，高溫刺激下HSP活化，啟動(dòng)NLS及Cre的表達(dá)，NLS可攜帶Cre酶進(jìn)入細(xì)胞核(這一步大大增加了切除效率)，切除LoxP位點(diǎn)中間序列。這樣農(nóng)民獲得的種子是已經(jīng)去除了外源基因的種子，可正常利用，但也失去了其外源基因的性狀，故不能留種，也防止了種子的擴(kuò)散。系統(tǒng)中的GUS是建立系統(tǒng)時(shí)所用，平時(shí)不表達(dá)，只有當(dāng)切除反應(yīng)發(fā)生后才會(huì)處于35S的控制下從而表達(dá)，可用來鑒定獲得的植株是否MFTPS。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，構(gòu)建了含有本發(fā)明的構(gòu)建物的植物表達(dá)載體HSAE，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，從而獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株。經(jīng)熱激誘導(dǎo)后，通過GUS染色反應(yīng)檢測、PCR分析檢測、GUS酶表達(dá)活性定量測定、以及Southern鑒定，充分證明了用該構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的植物在熱激條件下會(huì)將LoxP元件之間的外源基因去除，從而減少轉(zhuǎn)基因作物中外源基因的潛在危害。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)能夠在當(dāng)代得到外源基因被切除的轉(zhuǎn)基因植物。(2)不只去掉篩選標(biāo)記基因，還把已經(jīng)發(fā)揮作用的目的基因去除，使得到的轉(zhuǎn)基因種子最大程度的無害化。(3)利用氣溫控制，使得種植方得到的種子不能留種，有效控制了轉(zhuǎn)基因種子的種植范圍，而且保障了開發(fā)種子方的利益。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)和《植物組織培養(yǎng)手冊》(上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1990年出版)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1HSAE植物表達(dá)載體的構(gòu)建用常規(guī)質(zhì)粒pCROX18(質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖如圖8所示。TineHoff，KirkM，Schnorr.Arecombinase-mediatedtranscriptionalinductionsystemintransgenicplantsPlantMolBiol，2001，4541～49)為模板，以HindIII+35S起始序列(GCAAGCTTAGATTAGCCTTTTAAT，SEQIDNO5)為上游引物，以PstI+loxP結(jié)尾序列(CTGCAGCTTATTGAAGCATATTAC，SEQIDNO6)為下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系MgCl2(10×)3μl，PCR反應(yīng)緩沖液(10×)3μl，dNTPs(各2.5μM)3μl，上述的上游引物(25μM)0.5μl，下游引物(25μM)0.5μl，模板(0.1μg/μl)1μl，牛血清白蛋白(10mg/ml)0.3μl，TaqDNA聚合酶(5U/μl)0.3μl，最后加水至30μl。PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性10分鐘；然后94℃變性40秒，54℃復(fù)性30秒，延伸30秒，共30個(gè)循環(huán)；最后，72℃延伸7分鐘(注以下的PCR反應(yīng)條件相同)。PCR產(chǎn)物回收采用華舜公司的回收試劑盒，回收后用HindIII/PstI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，把酶切產(chǎn)物與同樣經(jīng)過HindIII/PstI雙酶切的質(zhì)粒pPZIP212(TineHoff，KirkM，Schnorr.Arecombinase-mediatedtranscriptionalinductionsystemintransgenicplantsPlantMolBiol，2001，4541～49)用來自華美公司的T4連接酶進(jìn)行連接，連接得到的質(zhì)粒再經(jīng)BamHI/XmaI雙酶切，產(chǎn)物備用。以pCROX18為模板，以BamHI+HSP上游序列(GGATCGAGATAATAATCGGTTTC，SEQIDNO7)和XmaI+lox結(jié)尾序列(CCCGGGATTATTGAAGCATATTA，SEQIDNO8)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)BamHI/XmaI雙酶切，與上述備用的產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，得到的質(zhì)粒)再經(jīng)BamHI/PstI雙酶切，產(chǎn)物備用。以pBI121(購自Clontech公司)為模板，以PstI+nptII起始序列(CTGCAGGATGATTGAACAAGATGGATTG，SEQIDNO9)和BamHI+nos終止子結(jié)尾序列(GGATCCCCCGATCTAGTAACATAGTAG，SEQIDNO10)為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)BamHI/PstI雙酶切后與上述備用的產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到的載體經(jīng)EcoRI/SmaI雙酶切后備用。pBI121經(jīng)同樣的雙酶切后gus基因及Nos終止子與上述酶切產(chǎn)物連接，引物(5’-GCTGCAGATGAGCGTATCATTACGAAC-3’，SEQIDNO11和5’-GGTTACCTCGACAAGCTCGAGTTTCTC-3’，SEQIDNO12)用來從pCAMBIA3301(購自Cambia公司，澳大利亞)中擴(kuò)增bar-35ster，PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHI酶切后與同樣酶切的之前得到的載體連接，形成的載體經(jīng)引物(5’-GCAAGCTTAGATTAGCCTTTTAAT-3’，SEQIDNO5和5’-GGTTACCTCGACAAGCTCGAGTTTCTC-3’，SEQIDNO12)確認(rèn)，表明bar-35ster的插入方向正確，該得到的載體即為pHSAE(圖1)。實(shí)施例2農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草及轉(zhuǎn)基因植株的獲得-70℃儲(chǔ)存的農(nóng)桿菌EHA105(MP90)(購自Cambia公司)，劃菌LB平板(Rif100μg/μl，慶大霉素50μg/μl)，28℃培養(yǎng)2天；挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，過夜190rpm培養(yǎng)，第二天，放大二十倍，搖至OD＝0.5時(shí)(約5-6小時(shí))，4℃5000rpm5分鐘收菌，分別用1000毫升，500毫升，50毫升無菌水洗菌，最后收集的菌體重懸于1毫升無菌水中，加入10％甘油，每管40微升分裝，-70℃保存。電轉(zhuǎn)化EHA105感受態(tài)細(xì)胞冰上解凍后，分別加入質(zhì)粒pHSAE，pBI121，混勻轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯電擊，加入500毫升LB，28℃190RPM搖3小時(shí)，涂三抗LB平板(Rif100μg/μl，Kan50μg/μl，慶大霉素50μg/μl)，28℃培養(yǎng)，約三天后挑菌培養(yǎng)并PCR鑒定。挑取含有雙元載體pBI121和pHSAE的農(nóng)桿菌EHA105單菌落接種于卡那霉素100mg/L濃度的5mlYEP液體培養(yǎng)基，28℃搖床培養(yǎng)過夜，然后菌液轉(zhuǎn)至50mlYEP卡那霉素100mg/L培養(yǎng)基中搖至OD600＝1.3，菌體于3000rpm離心10分鐘后重懸于1/2MSB5液體培養(yǎng)基附加6mg/lBAP和100μM乙酰丁香酮，OD600調(diào)整至0.5。在MSB5培養(yǎng)基(BAP＝1.5mg/L)上培養(yǎng)24小時(shí)的煙草葉片在上述培養(yǎng)基中28℃感染4分鐘，然后轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，感染后的煙草葉盤在無菌濾紙上把菌液吸干后轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(1/2MSB5(pH5.8)，0.6％瓊脂糖，3mg/lBAP，100μM乙酰丁香酮)，暗培養(yǎng)5天，用無菌水洗凈后轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)(1/2MSB5，0.2mg/LBAP，0.2mg/lIBA，300mg/L頭孢霉素，300mg/L羧芐青霉素，100mg/L卡那霉素)，每10天繼代一次。等抗性芽長至3-5厘米將其切下轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基(1/2MSB5，0.2mg/LBAP，1.0mg/lIBA，300mg/L頭孢霉素，300mg/L羧芐青霉素，25mg/L卡那霉素)，根長的足夠壯時(shí)移栽到土壤中在人工氣候室生長結(jié)實(shí)。用常規(guī)的冷酚法提取煙草基因組總DNA，方法如下用液氮研磨材料至粉狀，加6ml提取緩沖液(1MTris-HCl(pH9.0)，50mMEDTA，1％SDS)，混勻，再加入等體積的水飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻，于冰上靜置1小時(shí)，每隔10分鐘搖勻一次。12000rpm4℃離心10分鐘，取上清，加等體積的酚∶氯仿∶異戊醇，冰上靜置5分鐘；繼續(xù)用酚∶氯仿∶異戊醇，直至有機(jī)相與水相之間沒有蛋白為止。加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，12000rpm4℃離心10分鐘，取上清，加0.5倍體積的高鹽溶液(0.8M檸檬酸鈉，1.2MNaCl)和0.5倍體積的異丙醇，混勻，置-70℃30分鐘。12000rpm4℃離心10分鐘去上清，沉淀溶于100μLddH2O中，用RNAaseA處理，再用酚∶氯仿∶異戊醇抽提、乙醇沉淀后即得到很純的基因組DNA，溶于100μLddH2O，跑電泳并測定OD260/OD280值，確定總DNA的質(zhì)量和濃度；加2.5倍體積的無水乙醇，保存于-70℃?zhèn)溆谩Ｈ∵m量DNA沉淀物用于PCR鑒定或進(jìn)行酶切作Southern雜交即以抽提的DNA為模板，以gus序列P1(CACGTTTGTGTGAACAACG，SEQIDNO13)和P2(CCAGTCCATTAATGCGTGGT，SEQIDNO14)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取陽性植株備用，共得到13個(gè)株系(圖2)。實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因煙草的熱激反應(yīng)取PCR陽性植株的T0代植株或獲得的種子經(jīng)氯氣消毒2小時(shí)后，在含卡那霉素100mg/l的MS培養(yǎng)基上生長至12天，移至35℃培養(yǎng)箱中生長24h后放至25℃培養(yǎng)間恢復(fù)24h后再取出移至35℃培養(yǎng)箱中生長24h，最后放至25℃培養(yǎng)間生長備用。實(shí)施例4GUS染色反應(yīng)取熱激后的轉(zhuǎn)基因煙草、未熱激的轉(zhuǎn)基因煙草和未轉(zhuǎn)基因煙草而熱激的煙草分別浸泡在X-Gluc溶液(含EDTA10mmol/L，磷酸鈉緩沖液100mmol/L，亞鐵氰化鉀0.5mmol/L，高鐵氰化鉀0.5mmol/L，20％甲醇(V/V)和0.1％X-Gluc)中，室溫?cái)?shù)小時(shí)后觀察。熱激前的轉(zhuǎn)基因煙草沒有顯藍(lán)色，而熱激后的轉(zhuǎn)基因煙草則顯出明顯的藍(lán)色，而且熱激后的煙草在卡那霉素100mg/L的培養(yǎng)基上生長時(shí)會(huì)慢慢死去(圖3)。這說明熱激后HSP被誘導(dǎo)并啟動(dòng)了其后cre基因的表達(dá)從而對loxP之間的nptII及其他序列進(jìn)行了切除。另外，對T1代植株進(jìn)行熱激前后得到了同樣的結(jié)果，且熱激后也可以正常生長并開花結(jié)實(shí)(圖4)。對得到的13個(gè)株系熱激前后GUS染色的統(tǒng)計(jì)表明，發(fā)生切除的頻率可以達(dá)到80％以上。但有的株系(9號)在熱激以前也能夠在根部顯藍(lán)色，初步推測這可能與HSP的滲漏表達(dá)有關(guān)。實(shí)施例5熱激前后PCR分析檢測用常規(guī)的冷酚法提取熱激后的轉(zhuǎn)基因煙草、未熱激的轉(zhuǎn)基因煙草和未轉(zhuǎn)基因而熱激的煙草的總DNA作為模板，以35S上游序列P1(TGCTAACCCACAGATGGTTAG，SEQIDNO15)和gus基因部分序列P2(CCAGACGTTGCCCGCATAATTAC，SEQIDNO16)為引物進(jìn)行擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系MgCl2(10×)3μl，PCR反應(yīng)緩沖液(10×)3μl，dNTPs(各2.5μM)3μl，P1(25μM)0.5μl，P2(25μM)0.5μl，模板(0.1μg/μl)1μl，牛血清白蛋白(10mg/ml)0.3μl，TaqDNA聚合酶(5U/μl)0.3μl，最后加水至30μl。PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性10分鐘；然后94℃變性40秒，54℃復(fù)性30秒，延伸30秒，共30個(gè)循環(huán)；最后，72℃延伸7分鐘。以植物基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果如圖5所示。如果熱激后植物體內(nèi)沒有發(fā)生切除，則因?yàn)?5S與gus基因的距離太遠(yuǎn)而不能擴(kuò)增出條帶，如果發(fā)生了切除，這時(shí)35S與gus基因連在一起，就可以擴(kuò)增出大小為1044bp的(即應(yīng)當(dāng)帶有的35S與gus基因部分序列(1010bp)加上剩下的一個(gè)loxP序列(34bp))條帶。圖5的結(jié)果表明，沒有進(jìn)行熱激處理的轉(zhuǎn)基因煙草不能擴(kuò)增出條帶，而熱激處理后同樣的株系就可以擴(kuò)增出大小約為1044bp的條帶，這個(gè)結(jié)果從分子水平上進(jìn)一步證明熱激誘導(dǎo)后HSP的確啟動(dòng)了cre基因的表達(dá)并對loxP之間的nptII及其他序列進(jìn)行了切除。實(shí)施例6GUS酶表達(dá)活性定量測定參照J(rèn)efferson的方法(JeffersonRA.Assayingchimericgenesinplantsthegusgenefusionsystem.PlantMolboilRep，1987，5387～405)，取熱激后的轉(zhuǎn)基因煙草、未熱激的轉(zhuǎn)基因煙草和未轉(zhuǎn)基因而熱激的煙草組織150mg，加入500μL提取緩沖液在研缽中研成勻漿，3000×g離心10min，收集上清液。在1ml預(yù)熱的反應(yīng)緩沖液中(提取液中加入1mmol/LMUG)加入20μL上清液，混勻后于37℃下反應(yīng)30min后取出100μL加入到900μL反應(yīng)終止液中，用970CRT熒光分光光度計(jì)測定各樣品的Ex365/Em455值。再采用Bradford的方法測定蛋白含量，取上清液20μL，用重蒸水定容至4ml，加入1ml考馬斯亮藍(lán)溶液，測定595nm光吸收值。用4-甲基傘形酮的納摩爾數(shù)與蛋白含量及時(shí)間的比值(nmol·mg-1·min-1)表示GUS活性對于得到的marker-free轉(zhuǎn)基因植株來說，僅僅發(fā)生了切除反應(yīng)是不夠的，還要看切除了多少，是否發(fā)生了比較徹底的切除，這是目前影響得到marker-free轉(zhuǎn)基因植株頻率的關(guān)鍵因素。因?yàn)閜HSAE載體里的gus基因是從pBI121中來的，在本實(shí)施例中利用以下實(shí)驗(yàn)來確定熱激后植物體內(nèi)發(fā)生切除的程度。即分別測定轉(zhuǎn)pBI121，轉(zhuǎn)pHSAE熱激前后的轉(zhuǎn)基因煙草組織的GUS酶活性，如果熱激后轉(zhuǎn)pBI121與轉(zhuǎn)pHSAE熱激后轉(zhuǎn)基因煙草組織的GUS活性的差別不大，則熱激后轉(zhuǎn)pHSAE的煙草體內(nèi)發(fā)生了比較徹底的切除。結(jié)果如圖6A-C所示。從圖6可以看出，熱激后轉(zhuǎn)pHSAE煙草的GUS活性與轉(zhuǎn)pBI121煙草的GUS活性相差很小(A、B、C)，而且熱激前后同株系的GUS酶活比較說明GUS的表達(dá)是在熱激過程中開始的。該結(jié)果進(jìn)一步證明熱激后HSP被誘導(dǎo)并啟動(dòng)了其后Cre基因的表達(dá)從而對loxP之間的nptII及其他序列進(jìn)行了切除，而且大部分切除發(fā)生的比較徹底。實(shí)施例7發(fā)生切除與否的Southern鑒定(a)DNA的提取按照常規(guī)的冷酚法進(jìn)行DNA提取，方法如下用液氮研磨材料至粉狀，加6ml提取緩沖液(1MTris-HCl(pH9.0)，50mMEDTA，1％SDS)，混勻，再加入等體積的水飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻，于冰上靜置1小時(shí)，每隔10分鐘搖勻一次。12000rpm4℃離心10分鐘，取上清，加等體積的酚∶氯仿∶異戊醇，冰上靜置5分鐘；繼續(xù)用酚∶氯仿∶異戊醇，直至有機(jī)相與水相之間沒有蛋白為止。加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，12000rpm4℃離心10分鐘，取上清，加0.5倍體積的高鹽溶液(0.8M檸檬酸鈉，1.2MNaCl)和0.5倍體積的異丙醇，混勻，置-70℃30分鐘。12000rpm4℃離心10分鐘去上清，沉淀溶于100μLddH2O中，用RNAaseA處理，再用酚∶氯仿∶異戊醇抽提、乙醇沉淀后即得到很純的基因組DNA，溶于100μLddH2O，跑電泳并測定OD260/OD280值，確定總DNA的質(zhì)量和濃度；加2.5倍體積的無水乙醇，保存于-70℃，每樣品取40μgDNA分別用BamHI酶切，待DNA完全酶切后，0.8％瓊脂糖凝膠電泳，切去多余的凝膠，0.25MHCl浸泡20min，水洗，加入變性液，于室溫輕搖變性45min，短暫水洗，加入中和液室溫中和30min。以20×SSC為轉(zhuǎn)移液，用毛細(xì)管吸印法轉(zhuǎn)膜12-16小時(shí)，將DNA轉(zhuǎn)移到Hybond-XL膜上，用鉛筆標(biāo)記上樣孔位置，6×SSC短暫漂洗，80℃烘烤固定2小時(shí)，備用。變性液1.5MNaCl，0.5MNaOH中和液1.5MNaCl，0.5MTris-HCl，pH7.0(b)探針標(biāo)記用引物5’-GGTNACCGACGATATCACAAAAGGC-3’(SEQIDNO17)和5’-GGTTACCTCGACAAGCTCGAGTTTCTC-3’(SEQIDNO12)擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、割膠純化后，取25ng的PCR產(chǎn)物作為模板標(biāo)記探針。探針的標(biāo)記使用Prime-a-GeneLabelingSystem(Promega公司)，標(biāo)記體系為50μL(摻入α-32P-dCTP)，37℃溫浴1小時(shí)。標(biāo)記的探針以市售的QIAquickNucleotideRemovalKit(購自Takara公司)純化。(c)預(yù)雜交和雜交將轉(zhuǎn)有總DNA尼龍膜，浸入10ml預(yù)雜交液中，在雜交爐中42℃預(yù)雜交2-4h。將變性后的探針，全部加入上述預(yù)雜交液中，42℃雜交24h。預(yù)雜交液50％(W/V)甲酰胺，5×SSC，5×Denhardt試劑，1％(W/V)SDS，100μg/ml變性的魚精DNA。(d)洗膜與壓片雜交結(jié)束后，倒出雜交液。按照以下程序洗膜1)2×SSC，0.1％SDS室溫洗滌兩次，每次5min。2)0.2×SSC，0.1％SDS室溫洗滌兩次，每次5min3)0.2×SSC，0.1％SDS42℃洗滌兩次，每次15min。4)2×SSC，室溫短暫漂洗。將膜置于紙巾上，以除去大部分液體。將膜用保鮮膜包裹，平整壓于X光片下，附加增感屏，-70℃曝光合適的時(shí)間。按照常規(guī)方法沖洗X光片。(e)從尼龍膜上除去探針將數(shù)百毫升0.05×SSC/0.01MEDTA加熱至沸騰，叢加熱器上移開該液體，并加入SDS至終濃度為0.1％，將膜浸泡于其中15分鐘。重復(fù)上述步驟。用0.1×SSC于室溫短暫漂洗膜，將其置于一疊紙巾上，以除去膜上大部分液體。將膜夾于兩張保鮮膜之間，壓在X光片下，檢查是否所有探針均被除去。將膜晾干，用鋁箔寬松包起，于室溫存放待用。結(jié)果如圖7所示，顯示Bar基因確實(shí)發(fā)生了切除，而bar和nptII基因是連鎖的，所以篩選標(biāo)記基因(即nptII基因)也肯定發(fā)生了切除。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>去除轉(zhuǎn)基因植物中階段性作用外源基因的方法<130>041781<160>17<170>PatentInversion3.1<210>1<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>LoxP元件<400>1ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttat34<210>2<211>1553<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>Cre基因<400>2tgcgcagctggacgtaaactcctcttcagacctaataacttcgtatagcatacattatac60gaagttatattaagggttattgaatatgatcaatttacctgtaaatccatacagttcaat120accttagcaggtcaaatagtgaccacttgatcatttgatcaaggttgcgctacgtaaaat180ctgtgaaaaattggcggtgttagtcctacagatttcgcgtaccacttagcaccaccaatc240aatcagaggtgaaaaatgggatattcaactgctaaagtgtccactcatcttgagcttgag300aaaaaccgtggttactggcgggcaaaagggtttgatcgtgatagttgccaactg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